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1、关于基因工程基本流程关于基因工程基本流程获取目的基因获取目的基因第1页，讲稿共67张，创作于星期日2获取目的基因获取目的基因目的基因修饰、改良目的基因修饰、改良建立高效表达系统建立高效表达系统表达调控机制研究表达调控机制研究第2页，讲稿共67张，创作于星期日3v鸟枪法鸟枪法vcDNA法法vPCR扩增扩增v化学合成化学合成v基因文库基因文库第3页，讲稿共67张，创作于星期日4鸟枪法（鸟枪法（shotgun）v用基因组中的随机产生的片段作为模板进行克隆用基因组中的随机产生的片段作为模板进行克隆第4页，讲稿共67张，创作于星期日5v“鸟枪法鸟枪法”最初用于测定微生物基因组序列。近年最初用于测定微生物
2、基因组序列。近年来，美国塞莱拉公司利用改进的全基因组来，美国塞莱拉公司利用改进的全基因组“鸟枪法鸟枪法”完成了果蝇和人类基因组的测序工作，证明了它完成了果蝇和人类基因组的测序工作，证明了它在测定大基因组上的可行性和有效性。在测定大基因组上的可行性和有效性。第5页，讲稿共67张，创作于星期日6鸟枪法基本程序鸟枪法基本程序v机械切割机械切割片段长度均一，大小可控，平头末端片段长度均一，大小可控，平头末端 v 全酶切全酶切片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不可控开，大小不可控 v 部分酶切部分酶切片段长度可控，含有粘性
3、末端，目的基因完整片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整1.目的基因组目的基因组DNA片段的制备片段的制备第6页，讲稿共67张，创作于星期日7v根据外源根据外源DNA片段的末端性质、筛选方案和大小确定片段的末端性质、筛选方案和大小确定载体载体片段大小片段大小-噬菌体、噬菌体、YAC、BAC 筛选方案筛选方案克隆载体：原位杂交或限制性酶切图谱克隆载体：原位杂交或限制性酶切图谱表达载体：基因产物功能检测表达载体：基因产物功能检测2.外源外源DNA片段的全克隆片段的全克隆第7页，讲稿共67张，创作于星期日8v根据筛选方案确定受体：根据筛选方案确定受体：大肠杆菌：原位杂交或限制性酶切图谱大肠杆菌：原
4、位杂交或限制性酶切图谱特异基因表达受体：基因产物功能检测特异基因表达受体：基因产物功能检测第8页，讲稿共67张，创作于星期日9v菌落原位杂交菌落原位杂交理想的探针是筛选的决定因素理想的探针是筛选的决定因素v基因产物功能检测基因产物功能检测 依赖于筛选模型的建立，如酶的活性、抗生素抗性依赖于筛选模型的建立，如酶的活性、抗生素抗性v限制性酶切图谱限制性酶切图谱多次酶切筛选多次酶切筛选3.期望重组子的筛选期望重组子的筛选第9页，讲稿共67张，创作于星期日10限制性酶切图谱限制性酶切图谱第10页，讲稿共67张，创作于星期日11 例如，已知某目的基因位于例如，已知某目的基因位于1.8kb的的SalI片段
5、中，将重片段中，将重组组子子用用SalI切开，凝胶切开，凝胶电电泳分离，用泳分离，用刀片切下相当于刀片切下相当于1.6-2.0kb大小大小区域内的凝胶区域内的凝胶块块，回收，回收DNA片片段，根据目的基因内部的特段，根据目的基因内部的特征性征性酶酶重复重复酶酶切切过过程直至程直至筛筛选选成功成功第11页，讲稿共67张，创作于星期日12v通过亚克隆在已克隆的片段上准确定位目的基因，通过亚克隆在已克隆的片段上准确定位目的基因，然后对目的基因进行序列分析，搜寻其编码序列以然后对目的基因进行序列分析，搜寻其编码序列以及可能存在的表达调控序列及可能存在的表达调控序列4.目的基因的定位目的基因的定位第12
6、页，讲稿共67张，创作于星期日13鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进-非随机鸟枪法非随机鸟枪法v前提条件：目的基因的酶切图谱已知前提条件：目的基因的酶切图谱已知目的基因两侧的酶切位点已知目的基因两侧的酶切位点已知两个位点之间的距离已知两个位点之间的距离已知v如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重组子中目的重组子的出现频率的完整性，从而提高重组子中目的重组子的出现频率第13页，讲稿共67张，创作于星期日14鸟枪法的局限性鸟枪法的局限性v工作
7、量较大，需要了解目的基因的背景知识；工作量较大，需要了解目的基因的背景知识；v不能获得的最小长度的目的基因；不能获得的最小长度的目的基因；v不能除去真核生物目的基因的内含子结构不能除去真核生物目的基因的内含子结构第14页，讲稿共67张，创作于星期日15cDNA法法vcDNAmRNA的互补的互补DNA(complementary DNA)反反/逆转录病毒基因复制和表达中间产物逆转录病毒基因复制和表达中间产物分离分离mRNA体外合成体外合成cDNA克隆进入克隆进入受体细胞受体细胞筛选含有筛选含有目的基因目的基因的重组克的重组克隆隆第15页，讲稿共67张，创作于星期日161.mRNA的分离纯化的分离
8、纯化v利用多数利用多数mRNA都含有一段都含有一段polyA尾巴，尾巴，将将mRNA从总从总RNA（rRNA、tRNA等）等）中分离纯化。中分离纯化。vmRNA只占总只占总RNA的的1%-2%。v含有含有poly(A)的的mRNA亲和层析亲和层析低聚低聚dT纤维素纤维素:用于用于poly(A)较长的较长的mRNA多聚多聚U琼脂糖琼脂糖:用于用于poly(A)较短的较短的mRNA（20A）v无无poly(A)的的 mRNA第16页，讲稿共67张，创作于星期日172.双双链链cDNA的体外合成的体外合成反反转录转录酶酶1）cDNA第一第一链链合成合成逆逆转录转录酶酶以以RNA为为模板，模板，Oli
9、go dT（或随机引物）作引物，（或随机引物）作引物，合成合成cDNA的第一的第一链链。mRNAcDNA3 5 5 AAAAAAATTTTTTTOligo dT引物引物第17页，讲稿共67张，创作于星期日18cDNA单单链链的的3末末端端一一般般形形成成一一个个弯弯回回来来的的双双链链发发卡卡结结构构（机机理理不不明明），可可成成为为合合成成第第二二条条cDNA链链的的引引物物。用用DNA聚聚合合酶酶合成第二合成第二链链DNA。cDNA第一第一链链5 cDNA第二第二链链合成合成DNA聚合聚合酶酶cDNA第一第一链链cDNA第二第二链链5 3 2）cDNA第二第二链链合成合成-自身合成自身合成
10、第18页，讲稿共67张，创作于星期日19核酸核酸酶酶S1用核酸用核酸酶酶S1可以切掉可以切掉发发卡卡结结构构（但（但这这会会导导致致cDNA中有用的序列被切掉！）。中有用的序列被切掉！）。cDNA第一第一链链cDNA第二第二链链5 3 cDNA第一第一链链cDNA第二第二链链5 3 5 3 第19页，讲稿共67张，创作于星期日20第20页，讲稿共67张，创作于星期日212）cDNA第二第二链链合成合成-置置换换合成合成vRNaseH识别识别mRNA-cDNA杂交分子中的杂交分子中的mRNA，并将其降解，并将其降解成许多成许多小片断小片断小片断正好成为小片断正好成为DNA聚合酶的引物，用来合成聚
11、合酶的引物，用来合成冈崎冈崎片断片断DNA Pol I除去引物并修补后再使用除去引物并修补后再使用DNA连接酶连接酶连成连成一整条一整条DNA链链第21页，讲稿共67张，创作于星期日22mRNAcDNA3 5 反反转录转录酶酶引物引物mRNAcDNA第一第一链链3 5 引物引物mRNAcDNA第一第一链链3 5 mRNAmRNADNA 聚合聚合酶酶DNA 聚合聚合酶酶cDNA第二第二链链cDNA第一第一链链3 5 RNaseHDNA ligase去引物去引物第22页，讲稿共67张，创作于星期日23第23页，讲稿共67张，创作于星期日24v第一链合成完毕后，变性去除残留的第一链合成完毕后，变性去
12、除残留的mRNA，在，在cDNA的游的游离离3末端添加末端添加Oligo dC，然后与人工合成的，然后与人工合成的Oligo dG退火，形退火，形成引物结构，聚合第二条链。成引物结构，聚合第二条链。3）cDNA第二第二链链合成合成-引物合成引物合成第24页，讲稿共67张，创作于星期日25mRNA3 5 AAAAAAAcDNA第一第一链链5 TTTTTTTT3 碱处理碱处理cDNA第一第一链链5 TTTTTTTT3 dCTP末端转移酶末端转移酶cDNA第一第一链链5 TTTTTTTT3 CCCCCCC加入加入Oligo dG退火退火cDNA第一第一链链5 TTTTTTTT3 CCCCCCCGGG
13、GGGG5 3 聚合酶聚合酶cDNA第二第二链链cDNA第一第一链链5 TTTTTTTT3 CCCCCCCGGGGGGG5 3 AAAAAAA第25页，讲稿共67张，创作于星期日26双链双链cDNA的克隆的克隆v克隆方案的选择标准与鸟枪法相同克隆方案的选择标准与鸟枪法相同末端性质末端性质筛选方案筛选方案片段大小片段大小第26页，讲稿共67张，创作于星期日27cDNA重组克隆的筛选重组克隆的筛选v原位杂交原位杂交v产物功能检测产物功能检测v差示法（差别杂交差示法（差别杂交/扣除杂交）扣除杂交）第27页，讲稿共67张，创作于星期日28v在一个细胞群体中目的基因正常表达，在另一个细胞群体中目在一个细
14、胞群体中目的基因正常表达，在另一个细胞群体中目的基因不表达。在这种情况下便可制备到两种不同的基因不表达。在这种情况下便可制备到两种不同mRNA提取提取物。其一是含有一定比例的目的基因物。其一是含有一定比例的目的基因mRNA种的总种的总mRNA群体，群体，其二是不含有目的基因其二是不含有目的基因mRNA种的总种的总mRNA群体。通过这两种总群体。通过这两种总mRNA（或是它们的（或是它们的cDNA拷贝）为探针的平行杂交，对由表达拷贝）为探针的平行杂交，对由表达目的的基因的细胞总目的的基因的细胞总mRNA构建的克隆库进行筛选。当使用存构建的克隆库进行筛选。当使用存在目的基因的在目的基因的mRNA探
15、针时，所有包含着重组体的菌落都呈阳性探针时，所有包含着重组体的菌落都呈阳性反应，在反应，在X光底片上呈现黑色斑点；而使用不存在目的基因的光底片上呈现黑色斑点；而使用不存在目的基因的mRNA探针时，除了含有目的基因的菌落外，其余的所有菌落都呈阳性反应，探针时，除了含有目的基因的菌落外，其余的所有菌落都呈阳性反应，在在X光底片上呈现黑色斑点。比较这两种底片并对照原平板，光底片上呈现黑色斑点。比较这两种底片并对照原平板，便可以挑选出含目的基因的菌落。便可以挑选出含目的基因的菌落。差别杂交差别杂交第28页，讲稿共67张，创作于星期日29第29页，讲稿共67张，创作于星期日30v局限性局限性差别杂交的灵
16、敏度比较低，特别是对于那些低丰度的差别杂交的灵敏度比较低，特别是对于那些低丰度的mRNA而言，这个缺点就显得更加突出而言，这个缺点就显得更加突出差别杂交需要筛选大量的杂交滤膜，鉴定大量的噬菌斑或差别杂交需要筛选大量的杂交滤膜，鉴定大量的噬菌斑或克隆片段，十分耗费时间和金钱克隆片段，十分耗费时间和金钱第30页，讲稿共67张，创作于星期日31原理：原理：羟羟基磷灰石柱基磷灰石柱结结合合DNA-RNA或或DNA-DNA双双链链，不，不结结合合单链单链DNA。（Hydroxylapatite column）扣除杂交扣除杂交第31页，讲稿共67张，创作于星期日32v从从表表达达A蛋蛋白白和和不不表表达达
17、A蛋蛋白白的的组组织织细细胞胞中中分分别别提提取取和分离和分离总总mRNA。v将将表表达达A蛋蛋白白的的mRNA合合成成cDNA第第一一链链。再再同同不不表表达达A蛋白的总蛋白的总mRNA杂交成杂交成cDNA-mRNA双链。双链。v不不能能杂杂交交的的cDNA就就包包括括特特异异表表达达的的A基基因因的的cDNA单单链。链。v用用羟羟磷磷灰灰石石柱柱收收集集单单链链cDNA，合合成成为为双双链链DNA进进行行扩增、克隆、测序。扩增、克隆、测序。第32页，讲稿共67张，创作于星期日33AAA组织组织B组织组织总总mRNA（A）总总mRNA（B）含蛋白含蛋白A的的mRNA不含蛋白不含蛋白A的的mR
18、NA总总cDNA第一第一链链A杂杂交交内含蛋白内含蛋白A 的的cDNA羟羟磷灰石柱磷灰石柱过过柱柱吸收吸收RNA-DNA单链滤过单链滤过羟羟磷灰石柱磷灰石柱BA第33页，讲稿共67张，创作于星期日34PCR扩增法扩增法v使用使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物。序列化学合成聚合反应必需的双引物。The National Center for Biotechnology Information/NCBI:http:/www.ncbi.nlm.ni
19、h.gov/genbankEuropean Bioinformatics Institute/EMBL-EBI:http:/www.ebi.ac.uk/DNA Data Bank of Japan/DDBJ:http:/www.ddbj.nig.ac.jp/index-e.html第34页，讲稿共67张，创作于星期日351.直接从基因组中扩增直接从基因组中扩增（1）提取基因组）提取基因组DNA作模板作模板（2）根据目的基因序列设计引物）根据目的基因序列设计引物（3）PCR扩增扩增适合扩增适合扩增原核生物原核生物基因。基因。第35页，讲稿共67张，创作于星期日36原核基因组部分原核基因组部分原核
20、细胞原核细胞提取基因组提取基因组DNAPCR扩增扩增第36页，讲稿共67张，创作于星期日37（1）提取基因组）提取基因组 total RNA（2）反转录合成总）反转录合成总cDNA作模板作模板（4）PCR扩增扩增（3）根据目的基因序列设计引物）根据目的基因序列设计引物2.从从mRNA中扩增中扩增:RT-PCR适合扩增适合扩增真核生物真核生物基因。基因。第37页，讲稿共67张，创作于星期日38目的基因目的基因的引物的引物1反转录成目的基因反转录成目的基因cDNA第一链第一链目的基因目的基因的引物的引物2目的目的 基因基因cDNA第二链第二链PCRmRNA第38页，讲稿共67张，创作于星期日39化
21、学合成法化学合成法v1976年年H.G.Khorana提出了用化学方法合成基因的设提出了用化学方法合成基因的设想，并于想，并于1979年在年在science上发表了率先成功地合成上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。基因的论文。v化学合成目的基因的前提：化学合成目的基因的前提：核苷酸序列已知核苷酸序列已知v目前通用的合成方法：目前通用的合成方法：固相磷酸三酯合成法固相磷酸三酯合成法第39页，讲稿共67张，创作于星期日40v核苷酸核苷酸1的的3-OH端在合成开始时就已经附着在惰性的端在合成开始时就已经附着在惰性的固相载体上，同时它的脱氧核糖环的固相载体上，同时它的
22、脱氧核糖环的5-OH基团也已基团也已用二甲氧基三苯甲基用二甲氧基三苯甲基(DMT)保护起来。这种固相载体保护起来。这种固相载体典型的情况是使用可控微孔玻璃典型的情况是使用可控微孔玻璃(CPG)。第40页，讲稿共67张，创作于星期日固相磷酸三固相磷酸三酯酯合成合成过过程程结结果是全保果是全保护护的的DNA：5 DMT,3固相支持物固相支持物,核苷酸之核苷酸之间对氯间对氯苯。最后脱保苯。最后脱保护护。第41页，讲稿共67张，创作于星期日42v合成的一个循环周期分为如下步骤：合成的一个循环周期分为如下步骤：v第一步，脱三苯甲基作用第一步，脱三苯甲基作用(detritylation)酸酸处处理理法法，
23、脱脱去去与与核核苷苷酸酸1的的5-OH基基团团偶偶联联的的保保护护基基团团DMT。在在这这种种脱脱DMT反反应应中中，常常用用的的酸酸是是二二氯乙酸氯乙酸(DCA)或三氯乙酸或三氯乙酸(TCA)；第42页，讲稿共67张，创作于星期日43v第二步，偶联反应第二步，偶联反应(coupling)。通通过过一一种种弱弱碱碱四四唑唑(tetrazole)的的催催化化反反应应，使使加加进进来来的的第第二二个个核核苷苷酸酸(N2)同同已已附附着着在在固固相相载载体体上上的的核苷酸核苷酸1之暴露的之暴露的5-OH基缩合；基缩合；第43页，讲稿共67张，创作于星期日44v第三步，封端反应第三步，封端反应(cap
24、ping)。由由加加入入的的乙乙酸酸酐酐(acetic anhydride)激激发发乙乙酰酰化化作作用用，把把所所有有的的没没有有参参与与偶偶联联反反应应的的5-OH基基团团全全都都封封闭闭起来；起来；第44页，讲稿共67张，创作于星期日45v第四步，氧化作用第四步，氧化作用(oxidation)。在核苷酸在核苷酸N1和和N2之间新形成的之间新形成的3-5亚磷酸三酯键亚磷酸三酯键十分活跃。利用碘液催化作用，使之被氧化成为相十分活跃。利用碘液催化作用，使之被氧化成为相当稳定的当稳定的3-5磷酸三酯键。这也就是为何我们称磷酸三酯键。这也就是为何我们称这种寡核苷酸合成法为磷酸三酯法的原因。这种寡核苷
25、酸合成法为磷酸三酯法的原因。第45页，讲稿共67张，创作于星期日46v化学合成寡聚核苷酸片段的能力一般局限于化学合成寡聚核苷酸片段的能力一般局限于150200bp，而绝大多基因的大小超过了这个范围，而绝大多基因的大小超过了这个范围，因此，需要将寡核苷酸适当连接组装成完整的基因此，需要将寡核苷酸适当连接组装成完整的基因因第46页，讲稿共67张，创作于星期日47v小片段黏接法小片段黏接法预先设计合成预先设计合成12-15bp的片断，片段之间都有互补区域，不的片断，片段之间都有互补区域，不同片断之间的互补区域能形成有断点的完整双链。因此同片断之间的互补区域能形成有断点的完整双链。因此DNA片段在退火
26、时可以自动排序，最后用片段在退火时可以自动排序，最后用T4连接酶连接连接酶连接即可得到完整基因。即可得到完整基因。化学合成化学合成DNA片断的组装片断的组装第47页，讲稿共67张，创作于星期日48T4 DNA连接酶连接酶完整的完整的DNA双链双链退火退火第48页，讲稿共67张，创作于星期日49v优点：优点：DNA片段小，回收效率高片段小，回收效率高v缺点：互补序列短，退火时容易错配缺点：互补序列短，退火时容易错配第49页，讲稿共67张，创作于星期日50v补丁延长法补丁延长法目的基因的一条链分成若干目的基因的一条链分成若干40-50bp的片段，另一条链设计的片段，另一条链设计成与上述大片段交错互
27、补的小片段（约成与上述大片段交错互补的小片段（约20bp）DNA片段片段在退火用在退火用Klenow将空缺处补齐，最后用将空缺处补齐，最后用T4连接酶修复缺口。连接酶修复缺口。第50页，讲稿共67张，创作于星期日51退火退火KlenowT4 DNA连接酶连接酶第51页，讲稿共67张，创作于星期日52v大片段酶促法大片段酶促法预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作为另预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作为另一个片断延长的引物，用一个片断延长的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的双聚合酶延伸成完整的双链。链。第52页，讲稿共67张，创作于星期日53355353T4DNA连接酶连接酶Kleno
28、w片段片段引物引物第53页，讲稿共67张，创作于星期日54 将将某某种种生生物物细细胞胞的的整整个个基基因因组组DNA切切割割成成大大小小合合适适的的片片断断，并并将将所所有有这这些些片片断断都都与与适适当当的的载载体体连连接接，引引入入相相应应的的宿宿主主细细胞胞中中保保存存和和扩扩增增。理理论论上上讲讲，这这些些重重组组载载体体上上带带有有了了该该生生物物体体的的全全部部基因，称基因，称为为基因文基因文库库。根据构建方法的不同，基因文。根据构建方法的不同，基因文库库分分为为:基因基因组组DNA文文库库（genomic DNA library,含有全部基因）含有全部基因）cDNA文文库库（c
29、omplementary DNA library,含含有有全全部部蛋蛋白白质质编编码码的的结结构基因）构基因）基因文基因文库库第54页，讲稿共67张，创作于星期日55 基因基因组组文文库库的大小的大小一个文一个文库库要包含要包含99%的基因的基因组组DNA时时所需要的克隆数目。所需要的克隆数目。N=ln(1-p)ln(1-f)p:文文库库包含了整个基因包含了整个基因组组DNA的概率的概率（99%）f:插入插入载载体的体的DNA片断的平均片断的平均长长度占整个基因度占整个基因 组组DNA的的百分数百分数N：所需的重：所需的重组载组载体数（克隆数）体数（克隆数）基因文库的完整性基因文库的完整性第5
30、5页，讲稿共67张，创作于星期日56例如：人的基因例如：人的基因组组是是 3109 bp，插入，插入DNA片断的平均片断的平均长长度如果是度如果是1.7104 bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=4.61GfN=4.61GfG：Genome大小；大小；f：fragment大小大小N=4.61Gf=4.6131091.7104=8.1105第56页，讲稿共67张，创作于星期日57cDNA文文库库的大小的大小一个一个cDNA文文库库要包含要包含99%的的mRNA时时所需要的克隆数目。所需要的克隆数目。p:文文库库包含了完整包含了完整mRNA的概率的概率（99%）
31、:某一种低丰度某一种低丰度mRNA占占细细胞整个胞整个mRNA的比例的比例N：所需的重：所需的重组载组载体数（克隆数）体数（克隆数）N=ln(1-p)ln(1-)1n1n第57页，讲稿共67张，创作于星期日58例如：人的成例如：人的成纤维细纤维细胞中，每个胞中，每个细细胞内不到胞内不到14个拷个拷贝贝的低丰度的低丰度mRNA约约占整个占整个mRNA含量的含量的30%，这这种种mRNA大大约约11000种，因此种，因此1nn=11000/30%=37000 =1/37000N=ln(1-0.99)ln(1-)137000=1.7105包含完整人成包含完整人成纤维细纤维细胞胞cDNA信息的文信息的
32、文库库需要需要17万个克隆万个克隆第58页，讲稿共67张，创作于星期日59 文文库库的的质质量量标标准准1.重重组组克隆的克隆的总总数不宜数不宜过过大，大，以减以减轻筛选轻筛选工作的工作的压压力力2.载载体的装体的装载载量最好大于基因的量最好大于基因的长长度度，避免基因被分隔避免基因被分隔克隆克隆3.克隆与克隆之克隆与克隆之间间必必须须存在足存在足够长够长度的重叠区域，度的重叠区域，以利克隆排以利克隆排序序4.克隆片段易于从克隆片段易于从载载体分子上完整卸下体分子上完整卸下5.重重组组克隆能克隆能稳稳定保存、定保存、扩扩增、增、筛选筛选第59页，讲稿共67张，创作于星期日60制制备备原原则则：
33、DNA片段之片段之间间存在部分重叠、大小均一存在部分重叠、大小均一（1）染色体）染色体DNA大片段的制大片段的制备备超声波超声波 机械机械搅搅拌拌 物理切割法物理切割法-平末端平末端内切内切酶酶Sau3A进进行局部消化。可得到行局部消化。可得到10-30kb的的随机片断。随机片断。酶酶切法切法-粘性末端粘性末端文库构建策略文库构建策略第60页，讲稿共67张，创作于星期日61常用常用载载体体 （2）构建基因文）构建基因文库库的的载载体体选选用用载载体能体能够够容容载载的的DNA片断大小直接影响到构建完整的基片断大小直接影响到构建完整的基因文因文库库所需要的所需要的重重组组子的数目子的数目。载载体
34、体容量越大容量越大，所要求的，所要求的DNA片断数目越少，所片断数目越少，所需的需的重重组组子越少子越少。对载对载体的要求体的要求质质粒：粒：cDNA文文库载库载体体 载载体系列：体系列：容量容量为为 24 kb cosmid载载体：体：容量容量为为 50 kb YAC：容量容量为为 1 Mb BAC:容量容量为为 300 kb基因基因组组文文库载库载体体第61页，讲稿共67张，创作于星期日62（3）构建基因文）构建基因文库库的受体的受体选选用用大多数情况下，基因文大多数情况下，基因文库库的受体是大的受体是大肠肠杆菌杆菌优优点：繁殖迅速，易于保存，克隆操作点：繁殖迅速，易于保存，克隆操作简简
35、便，便，转转化效率高化效率高少数情况下，如少数情况下，如为为了使目的基因高效表达，也可了使目的基因高效表达，也可选选用用动动植物植物细细胞胞第62页，讲稿共67张，创作于星期日63v在基因组文库的构建过程中，在基因组文库的构建过程中，严禁外源严禁外源DNA片段之片段之间的连接。间的连接。为了避免上述情况的发生，可采取下列措为了避免上述情况的发生，可采取下列措施的组合：施的组合：将待连接的将待连接的DNA片段根据载体的装载量分级分离片段根据载体的装载量分级分离用碱性磷酸单酯酶除去用碱性磷酸单酯酶除去DNA片段的末端磷酸基团片段的末端磷酸基团 用用TdT酶在酶在DNA片段的末端上增补同聚尾末端片段
36、的末端上增补同聚尾末端第63页，讲稿共67张，创作于星期日64基因组文库重组克隆排序基因组文库重组克隆排序v染色体步移染色体步移/走读（走读（chromosome walking）基因文库中任取一个克隆作为染色体走读的起点，将之两端基因文库中任取一个克隆作为染色体走读的起点，将之两端序列分别亚克隆，亚克隆片段在序列分别亚克隆，亚克隆片段在0.2-2.0 kb范围内范围内.分别以分别以上述亚克隆上述亚克隆DNA片段为探针，杂交同一基因文库，阳性克片段为探针，杂交同一基因文库，阳性克隆中的插入隆中的插入DNA片段必定与起点克隆所含的片段必定与起点克隆所含的DNA片段连片段连锁在一起然后再以阳性克隆
37、片段的两端序列为探针，锁在一起然后再以阳性克隆片段的两端序列为探针，进行第二步走读，直至线型染色体进行第二步走读，直至线型染色体DNA的端点。的端点。第64页，讲稿共67张，创作于星期日65第65页，讲稿共67张，创作于星期日66基因文库的筛选基因文库的筛选v文库筛选根据有关目的基因的背景知识：文库筛选根据有关目的基因的背景知识：目的基因的部分或全部碱基序列已知目的基因的部分或全部碱基序列已知目的基因编码产物的结构或功能已知目的基因编码产物的结构或功能已知目的基因与某些生物表型的相关性已知目的基因与某些生物表型的相关性已知第66页，讲稿共67张，创作于星期日感谢大家观看第67页，讲稿共67张，创作于星期日