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1、基因重组和基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering 第 十 四 章 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望起初上帝创造天地，起初上帝创造天地，地是空虚混沌，渊面黑暗，地是空虚混沌，渊面黑暗，上帝的灵运行在水面上，上帝的灵运行在水面上，上帝说：上帝说：“要有光，就有了光。要有光，就有了光。”-旧约全书旧约全书创世纪创世纪 萤火虫的发光基因对烟草说：萤火虫的发光基因对烟草说：“要有光要有光”，烟草就发
2、光了。，烟草就发光了。主要内容主要内容 重组重组DNA技术相关概念技术相关概念 重组重组DNA技术基本原理及操作步骤技术基本原理及操作步骤 PCR、核酸杂交、核酸杂交DNA克隆克隆工具酶工具酶目的基因目的基因基因载体基因载体重组重组DNA技术相关概念技术相关概念 克隆克隆(clone)：通过通过无性繁殖无性繁殖过程所产生的与亲代过程所产生的与亲代 完全相同的子代群体。完全相同的子代群体。（一）（一）DNA克隆克隆技术水平：技术水平：分子克隆分子克隆(molecular clone)即即DNA 克隆，基因克隆克隆，基因克隆细胞克隆细胞克隆个体克隆（动物或植物）个体克隆（动物或植物）P352DNA
3、克隆克隆应应用用酶酶学学的的方方法法，在在体体外外将将各各种种来来源源的的目目的的DNA与与载载体体DNA接接合合成成一一具具有有自自我我复复制制能能力力的的重重组组DNA分分子子，继继而而通通过过转转化化或或转转染染宿宿主主细细胞胞，筛筛选选出出含含有有目目的的基基因因的的转转化化细细胞胞，再再进进行行扩扩增增提提取取获获得得大大量量同同一一DNA分分子子，也也称称基基因因克克隆隆或或基基因因克隆。克隆。P352生物技术工程生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等酶工程、细胞工程等目的目的 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感
4、兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程基因工程(genetic engineering)实现基实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程。因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程。基因克隆的主要操作步骤基因克隆的主要操作步骤粘性末端粘性末端质粒质粒目的基因目的基因粘性末端粘性末端匹配的粘性末端匹配的粘性末端分分(分离分离)切切(切割切割)酶切后的目的基因片段酶切后的目的基因片段接接(连接连接)连接后的重组连接后的重组质粒质粒DNA分子分子重组质粒重组质粒目的基因目的基因大肠杆菌大肠杆菌转转(转化转化)染色体染色体真好玩!筛筛(筛选筛选)分解抗生分解抗生素的酶素的
5、酶含抗生素的培养基含抗生素的培养基还活着还活着!玩完啦玩完啦!大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大量生长大量生长提取大量质粒提取大量质粒酶切鉴定酶切鉴定基因克隆的基本步骤基因克隆的基本步骤v分：分：分离目的基因和载体分离目的基因和载体DNA。v切：切：用合适的酶切割上述两者，产生匹配的末端。用合适的酶切割上述两者，产生匹配的末端。v接：接：连接酶将目的基因装入载体。连接酶将目的基因装入载体。v转：转：转入宿主细胞。转入宿主细胞。v筛：筛：筛选具有筛选具有重组重组DNA分子的阳性分子的阳性克隆。克隆。限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 连接酶连接酶 聚合酶聚合酶(Taq酶、酶、末端转移酶末端转移酶)
6、多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶合成双链合成双链cDNA分子分子5羟基末端羟基末端磷酸化磷酸化 切除末端切除末端磷酸基磷酸基(二二)DNA重组中的工具酶重组中的工具酶P3531.限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（restriction endonuclease,RE）能能识别识别DNA的的特异序列特异序列，并在识别位点，并在识别位点或其周围或其周围切割切割双链双链DNA的一类核酸内切酶。的一类核酸内切酶。主要来源于主要来源于原核生物原核生物由于能限制外源由于能限制外源DNA的的“入侵入侵”而得名。与甲而得名。与甲基化酶共同构成细菌的基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外限制
7、修饰系统，限制外源源DNA，保护自身保护自身DNA第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。命名命名 属属 系系 株株 序序Escherichia coli RY13分类分类、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型型）EcoR 类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome)GGGGA AT TCCCCCCCCT TA AGGGG舟行水面水行舟舟行水
8、面水行舟A segment of double-stranded DNA in which the nucleotide sequence of one strand reads in reverse order to that of the complementary strand.In the same strand containing complementary nucleotide sequence with opposite polarity.在在对称轴中心对称轴中心同时切割双链，产生同时切割双链，产生平末端平末端或或称称钝性末端（钝性末端（blunt end），如，如Hpa I：
9、5 GTTAAC3 Hpa I 5 GTT AAC33 CAATTG5 3 CAA TTG 5 II型酶切割双链型酶切割双链DNA产生产生3种不同的切口种不同的切口切割：切割：以内切方式水解双链以内切方式水解双链DNA中的中的磷酸二酯键磷酸二酯键，产生的产生的DNA片段片段5 端为磷酸基，端为磷酸基，3 端为羟基。端为羟基。P353 在在对对称称轴轴两两侧侧相相对对位位点点分分别别切切割割一一条条链链。从从 5端切割产生端切割产生5 端突出的粘性末端端突出的粘性末端，如，如EcoR ：从从3 端切割产生端切割产生3 端突出的粘性末端端突出的粘性末端。如。如Pst：5 GAATT C3 EcoR
10、 I 5 G 5 AATTC33 C TTAAG5 3 CTTA A 5 G 5 5 C TGCAG3 Pst I 5 CTGCA 3 G33 GACGT C5 3 G 3 ACGTC 5 限制性内切酶作用过程点击播放点击播放 1在下述双链在下述双链DNA序列序列(仅列出其中一仅列出其中一链序列链序列)中不属于完全回文结构的是中不属于完全回文结构的是 AAGAATTCT B.TGAATTCA CGGAATTCC DCGTTAAGC EAGATATCT 1某识别某识别6核苷酸序列的限制性内切酶切割核苷酸序列的限制性内切酶切割5AGCTGAATTC3产生产生 2某识别某识别6核苷酸序列的限制性内切
11、酶切割核苷酸序列的限制性内切酶切割5CTGCAGAGTC3产生产生 3某识别某识别6核苷酸序列的限制性内切酶切割核苷酸序列的限制性内切酶切割5AGGTTAACAG3产生产生5 端突出的粘性末端端突出的粘性末端3 端突出的粘性末端端突出的粘性末端平末端平末端二、二、DNA连接酶连接酶(DNA ligase)连连接接DNA链链3-OH末末端端和和相相邻邻DNA链链5-P末末端端，使使二二者者生生成成磷磷酸酸二二酯酯键键，从从而而把把两两段段相相邻邻的的DNA链链连连接成一条完整的链。接成一条完整的链。HO5335DNA连接酶连接酶ATPADP5353 应用重组应用重组DNA技术有时是为分离、获得某
12、一技术有时是为分离、获得某一感兴趣感兴趣的基因或的基因或DNA片段片段，或是获得感兴趣的表达产物，或是获得感兴趣的表达产物 蛋白质蛋白质。这些感兴趣的基因或。这些感兴趣的基因或DNA序列就是序列就是目的基因目的基因。目的基因有两种类型：目的基因有两种类型：v cDNA(complementary DNA)derived by action of reverse transcriptasefrom(usually)mRNA templatev 基因组基因组DNA(genomic DNA)usually too large to clone directly（三）目的基因（三）目的基因（targe
13、t gene）P354常用的载体按来源分为：常用的载体按来源分为：质粒（质粒（plasmid）、噬菌体）、噬菌体(phage)、病毒、病毒(virus)按得到的产物，载体可分为：按得到的产物，载体可分为：克隆载体（克隆载体（cloning vector）主要用于基因片断的扩增）主要用于基因片断的扩增表达载体（表达载体（expression vector）用于获得目的基因编）用于获得目的基因编码的蛋白质码的蛋白质载体的分类载体的分类（四）基因载体（四）基因载体P354为携带为携带目的基因目的基因（外源基因外源基因），实现其无性繁殖实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些或表达有意义的蛋白质
14、所采用的一些DNA分子分子。质粒（质粒（plasmid）质粒是存在于细菌染色体外的质粒是存在于细菌染色体外的小型小型环状双链环状双链DNA分子分子，能在宿主，能在宿主细胞细胞独立自主地进行复制独立自主地进行复制，并在细胞，并在细胞分裂时保持恒定地传给子代细胞。质分裂时保持恒定地传给子代细胞。质粒带有某些粒带有某些遗传信息遗传信息，会赋予宿主细，会赋予宿主细胞胞新的遗传性状新的遗传性状。因为质粒因为质粒DNA有自我复制功能及携有自我复制功能及携带遗传信息等特性，可作为重组带遗传信息等特性，可作为重组 DNA操作的载体。操作的载体。目目 录录氨苄青霉素氨苄青霉素抗性基因抗性基因四环素四环素抗性基因
15、抗性基因多克隆位点多克隆位点ori载体的选择标准载体的选择标准v能自主复制；能自主复制；v具有多个单一限制酶切位点，称为多具有多个单一限制酶切位点，称为多克隆位点克隆位点 （外源（外源DNA插入点）；插入点）；v具有合适的筛选标记，便于重组体的具有合适的筛选标记，便于重组体的筛选和鉴定；筛选和鉴定；v分子量小，以容纳较大的外源分子量小，以容纳较大的外源DNA；v稳定传代。稳定传代。噬菌体噬菌体 噬菌体是大肠杆菌的噬菌体，它由噬菌体是大肠杆菌的噬菌体，它由外壳蛋白和外壳蛋白和-DNA组成组成。噬菌体（噬菌体（lambda bacteriophage）DNA，为线性双链，为线性双链DNA，它的两端
16、各有它的两端各有12个碱基的互补粘性末端，称个碱基的互补粘性末端，称COS位点。当噬菌体侵入宿位点。当噬菌体侵入宿主细胞，两个粘性末端互补结合，形成环状分子。主细胞，两个粘性末端互补结合，形成环状分子。DNA在体外可包装在体外可包装成病毒颗粒，并高效感染大肠杆菌。成病毒颗粒，并高效感染大肠杆菌。Sal BamHEcoRSal BamHEcoRpUC18和和pUC19载体载体多克隆位点多克隆位点rlacZ基因基因:编码编码-半乳半乳 糖苷酶的糖苷酶的-片段片段M13噬菌体噬菌体DNA改造系统（含改造系统（含lacZ基因）基因）粘性质粒载体粘性质粒载体(cosmid)酵母人工染色体酵母人工染色体(
17、yeast artificial chromosome,YAC)细菌人工染色体细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)动物病毒动物病毒DNA改造的载体改造的载体（如腺病毒，逆转录病毒）（如腺病毒，逆转录病毒）其其 他他（一）目的基因的获取（一）目的基因的获取1.化学合成法化学合成法2.基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library)3.cDNA文库文库(cDNA library)4.聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)二、重组二、重组DNA技术基本原理及操作步骤技术基本原理及操
18、作步骤 P356*化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列序列合成的基因有：人生长激素释放抑制因子、合成的基因有：人生长激素释放抑制因子、胰岛素原、胰岛素原、脑啡肽、干扰素基因等。脑啡肽、干扰素基因等。组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNADNA基因片断基因片断克隆载体克隆载体重组重组DNADNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌基因组基因组DNADNA文库文库存在于转化细胞内存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所由克隆载体所携带的所有基因组有基因组DNADNA的集合的集合P356*从
19、基因组从基因组DNADNA文文库获取目的基因库获取目的基因(genomic DNA library)限制酶切位点限制酶切位点限制酶消化限制酶消化 除去中间片段除去中间片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色体色体DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA与载体与载体DNA混合混合 连接反应连接反应 体外包装体外包装 用重组噬菌体用重组噬菌体感染大肠杆菌感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文库基因文库目目 录录mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cD
20、NA文库文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制*从从cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因 逆转录酶逆转录酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T目目 录录cDNA文库的特点文库的特点代表了取材当时所表达基因的总和，不包括代表了取材当时所表达基因的总和，不包括那些未表达的基因。那些未表达的基因。mRNA分子中分子中不包括内含子及调控序列不包括内含子及调控序列，所，所以以cDNA文库的复杂性要比基因组文库低的多。文库的复杂性要比基因组文库低的多。v体外体外高效、快速、特异高效、快速、特异地扩增目的基因或地扩
21、增目的基因或DNA片段的技术。片段的技术。v其原理类似于其原理类似于DNA的体内复制的体内复制，只是在试管中给，只是在试管中给DNA的体外合成提供的体外合成提供一种合适条件一种合适条件模板模板DNA，寡核苷酸引物，寡核苷酸引物，dNTPs,DNA聚合酶，聚合酶，合适的缓冲液系统合适的缓冲液系统(Mg2+)和和DNA变性、复性及延伸的温度与时间变性、复性及延伸的温度与时间等，等，使目的使目的DNA得以迅速扩增得以迅速扩增.聚合酶链式反应聚合酶链式反应 P483（Polymerase Chain Reaction,PCR）5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5
22、5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 PCR技术的工作原理技术的工作原理目目 录录DNA变性变性 复性复性 延伸延伸Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。目目 录录DNA片段片段Cycle 1Cycle 2Cycle 3Cycle n理论上可达理论上可达2n个拷贝个拷贝原料原料（pg）产物产物(g)体外体外高效、快速、特异高效、快速、特异 地扩增地扩增DNA片段片段g mg u ug ng pg重组重组DNA技术基本原理技术
23、基本原理基本原理基本原理目的基因目的基因的获取的获取重组重组DNA导入导入受体菌受体菌 外源基因与载体的外源基因与载体的连接连接克隆克隆载体载体的选择和构建的选择和构建重组体的重组体的筛选筛选克隆基因的克隆基因的表达表达（三）外源基因与载体的连接（三）外源基因与载体的连接P357 粘性末端连接粘性末端连接 平端连接平端连接 同聚物加尾连接同聚物加尾连接 人工接头连接人工接头连接（二）克隆载体的选择和构建（二）克隆载体的选择和构建粘性末端连接粘性末端连接 外源外源DNA片段与载体用片段与载体用同一种限制性内切酶同一种限制性内切酶切割，切割，获得相同的粘性末端，相互互补配对，在获得相同的粘性末端，
24、相互互补配对，在DNA连接酶连接酶作用下，形成重组作用下，形成重组DNA分子。分子。DNA连接酶连接酶“缝缝合合”基基因的因的“分子分子针线针线”。DNA连接酶的作用过程点击播放点击播放2.平端连接平端连接适用于：适用于：限制性内切酶切割产生的平末端的补齐限制性内切酶切割产生的平末端的补齐目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶 T4 DNA连接酶连接酶 15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连3.同聚物加尾连接同聚物加尾连接在末端转移酶在末端转移酶(terminal transferase)的作的作用下，在用下，在DNA片段末端加上同聚物序
25、列、制造片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。出粘性末端，再进行粘端连接。如将如将poly（dA）加到双链）加到双链DNA片段片段3 羟基上，羟基上，而将而将poly（dT）加到质粒载体）加到质粒载体3 羟基上，制造羟基上，制造出粘性末端，然后通过退火进行粘性末端连接。出粘性末端，然后通过退火进行粘性末端连接。5335载体载体DNA5335目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶 53 35 5 3 T(T)nT T(T)nT35 5 3 35 5 3 A(A)nA A(A)nA35-核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端转移酶末端转移酶+dATP
26、末端转移酶末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体目目 录录CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco R目目 录录由平末端加上由平末端加上新的酶切位点，再新的酶切位点，再用限制酶切除产生用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘性末端，而进行粘端连接。粘端连接。4.人工接头人工接头(linker)连接连接受体菌条件受体菌条件 安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷 处于感受态处于感受态(competent)将重组将重组DNA导入宿主细胞有转化、转染和感染几种方法导入宿主细胞有转化、转染和感染几种方法
27、 将外源将外源DNA转入细菌的过程称转入细菌的过程称转化转化(transformation)将外源将外源 DNA直接转入动物细胞的过程称直接转入动物细胞的过程称转染转染(transfection)采用包装病毒将外源采用包装病毒将外源DNA转入细胞的过程称转入细胞的过程称感染感染(infection)（四）重组（四）重组DNA导入受体菌导入受体菌P358CaClCaCl2 2诱导转化诱导转化特殊处理特殊处理特殊处理特殊处理受体细胞受体细胞受体细胞受体细胞细胞膜特性细胞膜特性细胞膜特性细胞膜特性改变改变改变改变感受态细胞的制备感受态细胞的制备基因片段（特别是纯化的基因片段（特别是纯化的DNA）很难
28、直接导入受体）很难直接导入受体细胞，通常将受体细胞预细胞，通常将受体细胞预先加以处理，如在先加以处理，如在低温条低温条件件 下，用下，用CaCl2（冰浴）（冰浴）处理大肠杆菌，可以大大处理大肠杆菌，可以大大提高质粒的转化效率。这提高质粒的转化效率。这种经过预处理、种经过预处理、容易导入容易导入外源核酸分子外源核酸分子的受体细胞的受体细胞被称作被称作“感受态细胞感受态细胞”（competent cell）。连接连接目的基因目的基因目的基因目的基因基因载体基因载体基因载体基因载体连接酶连接酶连接酶连接酶转化转化宿主细胞宿主细胞转化后菌落或转染噬菌斑：转化后菌落或转染噬菌斑：(五五)重组体的筛选重组
29、体的筛选 P3581.直接选择法直接选择法(1)抗药性标记选择抗药性标记选择(2)标志补救标志补救(marker rescue)(3)分子杂交法分子杂交法 （原位杂交；（原位杂交；Southern印迹）印迹）2.免疫学方法免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等如免疫化学方法及酶免检测分析等1）抗药性标志的选择(插入失活法)pBR322AmprTetr插入外源插入外源插入外源插入外源基因片段基因片段基因片段基因片段标志基因标志基因Tetr失活失活AmpAmp平板平板平板平板TetTet平板平板平板平板转化转化区别非转化菌与转化菌？区别非转化菌与转化菌？双抗生素双抗生素对照筛选对照筛选重组子重组
30、子能在含有能在含有Ap的的培养板上生长培养板上生长但不能在含有但不能在含有Tet的培的培养板上生长养板上生长2 2）标志补救（）标志补救（-半乳糖苷酶法）半乳糖苷酶法）N2H 片段片段COOHCOOHw w片段片段-半乳糖苷酶活性半乳糖苷酶活性半乳糖苷酶活性半乳糖苷酶活性lacZlacZ缺陷型缺陷型缺陷型缺陷型的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌的大肠杆菌Ampuc18（LacZLacZ基因基因基因基因 N N端序列）端序列）端序列）端序列）P355X-galX-galLac Z蓝色化合物蓝色化合物 片段片段片段片段LacZ基因基因 N端序列端序列插入外源片段插入外源片段（LacZ基因失活）基因失活
31、）LacZ基因基因 C端序列端序列LacZLacZ酶酶w w w w片段片段片段片段w w w w片段片段片段片段X-gal互补互补：单独存在的单独存在的及及 片段都没片段都没有半乳糖苷酶的活性，只有宿主细有半乳糖苷酶的活性，只有宿主细胞与克隆载体同时表达两个片段时，胞与克隆载体同时表达两个片段时，宿主细胞内才有宿主细胞内才有 半乳糖苷酶活性，半乳糖苷酶活性，使特异性作用物（使特异性作用物（X-gal）变为）变为蓝色蓝色化合物。化合物。如果插入的外源基因是在如果插入的外源基因是在lacZ基基因内，就会影响因内，就会影响lacZ的表达，利的表达，利用用lac-E.coli为转染或感染细胞，为转染
32、或感染细胞，在含在含X-gal的培养基上生长时会的培养基上生长时会出现出现 白色菌落白色菌落；若无外源基因若无外源基因插入，则出现插入，则出现蓝色菌落。蓝色菌落。白色菌落白色菌落目目 录录-互补：互补：通过蓝白通过蓝白斑筛选可斑筛选可以筛选、以筛选、鉴定重组鉴定重组子与非重子与非重组子载体组子载体-半半乳乳糖糖苷苷酶酶能能分分解解X-gal，形形成成蓝蓝色色菌落菌落。当外源基因插入后，当外源基因插入后，LacZ基因被破坏，不能基因被破坏，不能合成完整的合成完整的-半乳糖苷酶，半乳糖苷酶，因此不能分解底物因此不能分解底物X-gal，菌落成白色。菌落成白色。P355大量生长大量生长克隆载体：拷贝大
33、量克隆载体：拷贝大量目的基因目的基因表达载体：获得大量表达载体：获得大量目的蛋白目的蛋白表达体系的建立表达体系的建立表达载体的构建表达载体的构建受体细胞的建立受体细胞的建立表达产物的分离纯化表达产物的分离纯化 指用指用探针探针检测样品中检测样品中未知核酸序列未知核酸序列，通过碱基互补配对，通过碱基互补配对原则发生同源性结合，再经显影或显色的方法，将结合的核原则发生同源性结合，再经显影或显色的方法，将结合的核酸序列的位置或大小显示出来。酸序列的位置或大小显示出来。探针探针：带有可检测标记的已知序列的：带有可检测标记的已知序列的DNA或或RNA片段。片段。3 3）核酸分子杂交（核酸分子杂交（核酸分
34、子杂交（核酸分子杂交（molecular hybridizationmolecular hybridization）Southern Blot：DNANorthern Blot：RNAWestern Blot：Protein参见参见481页页提取提取DNA限制性内切酶消化限制性内切酶消化琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳碱变性碱变性转移到转移到NC膜膜与与DNA或或RNA探针杂交探针杂交放射自显影放射自显影Southern blotting检测靶分子为检测靶分子为DNA,检测检测靶分子是否含有目的基因靶分子是否含有目的基因P360菌菌落落原原位位杂杂交交分分_分离出目的基因分离出目的基因及载体及载体
35、DNA。切切_利用限制性核酸利用限制性核酸内切酶分别切割目的基因和内切酶分别切割目的基因和载体。载体。接接_利用连接酶将目利用连接酶将目的基因与载体的基因与载体DNA共价连接共价连接形成重组形成重组DNA分子。分子。转转_重组重组DNA分子转分子转化受体细胞。化受体细胞。筛筛_筛选和鉴定含有筛选和鉴定含有重组重组DNA分子的受体细胞分子的受体细胞（阳性克隆）。（阳性克隆）。重组重组DNA的基本过程的基本过程重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制
36、酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基因目的基因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交目目 录录1.何谓基因重组技术，简述其基本过程。何谓基因重组技术，简述其基本过程。2.何谓目的基因，有哪些来源？何谓目的基因，有哪些来源？3.解释基因载体，哪些解释基因载体，哪些DNA 可作为基因载体？可作为基因载体？(质粒质粒)4.基本概念基本概念 DNA重组技术重组技术,限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶,回文结构回文结构,目的基因目的基因,基因组基因组DNA文库文库,cDNA文库文库,PCR,核酸分子杂交核酸分子杂交核酸分子杂交核酸分子杂交第十四章第十四章 基因工程基因工程实验结果