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1、Review第三部分第三部分 目的基因的分离目的基因的分离目的序列已知：目的序列已知：l一般采用一般采用PCR技术或技术或分子杂交技术分离克分子杂交技术分离克隆目的基因隆目的基因 目的序列未知：目的序列未知：l差异表达序列差异表达序列l无差异表达的目的序无差异表达的目的序列，可采用文库筛选列，可采用文库筛选法、功能蛋白分离法、法、功能蛋白分离法、序列克隆法序列克隆法一、目的基因的功能克隆一、目的基因的功能克隆l根据蛋白质的基本生化特性这一功能信息，在获知根据蛋白质的基本生化特性这一功能信息，在获知基因的功能后克隆基因的功能后克隆l其具体作法是其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建在纯化相应的
2、编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库，然后从文库中筛选目的基因文库或基因组文库，然后从文库中筛选目的基因l(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序，据此合成将纯化的蛋白质进行氨基酸测序，据此合成寡寡核苷酸探针核苷酸探针从从cDNA库或基因组文库中筛选编码基库或基因组文库中筛选编码基因因l(2)将相应的编码蛋白制成相应将相应的编码蛋白制成相应抗体探针抗体探针，从，从cDNA表达文库中筛选相应克隆。表达文库中筛选相应克隆。二、二、序列克隆法序列克隆法l根据已知基因序列或同源基因序列分离目的根据已知基因序列或同源基因序列分离目的基因基因l采用核酸探针杂交筛选或用采用核酸探针杂交筛选或用PCR技术进行分技
3、术进行分离离三、差别杂交法三、差别杂交法l适用范围：适用范围：l组织组织特异性表达特异性表达或特定发育阶段表达的基因或特定发育阶段表达的基因l 受生长因子调节的基因受生长因子调节的基因l 经特殊处理诱导表达的基因经特殊处理诱导表达的基因应用前提应用前提：基因在两种不同的细胞群体中的差异性表：基因在两种不同的细胞群体中的差异性表达（一个细胞群体中正常表达，另一个细胞群体中目达（一个细胞群体中正常表达，另一个细胞群体中目的基因不表达）。的基因不表达）。基本过程基本过程l制备两种细胞群体的的制备两种细胞群体的的mRNA提取物提取物l以两种总以两种总mRNA或或cDNA为探针为探针l以表达目的基因的细
4、胞群体构建以表达目的基因的细胞群体构建cDNA文库文库有目的基因表达的有目的基因表达的mRNA探针，重组体菌落阳性反应探针，重组体菌落阳性反应目的基因不表达的目的基因不表达的mRNA探针，除目的基因之外，其探针，除目的基因之外，其余菌落都为阳性反应余菌落都为阳性反应 比较底片，对照原板，可挑选出含选目的基因的菌落比较底片，对照原板，可挑选出含选目的基因的菌落cDNA文库母板目的基因有表达目的基因无表达无有无有说明含目的基因说明含目的基因四、减法杂交技术四、减法杂交技术l又称差减杂交、扣除杂交、减数杂交、消减杂交又称差减杂交、扣除杂交、减数杂交、消减杂交l本质：尽量本质：尽量去除两种样品中普遍共
5、同存在的基因序去除两种样品中普遍共同存在的基因序列列，从而使目的基因序列得到有效的富集，从而提，从而使目的基因序列得到有效的富集，从而提高基因筛选分离的敏感性高基因筛选分离的敏感性两种策略：两种策略：lmRNA减法杂交减法杂交l基因组减法杂交基因组减法杂交mRNA减法杂交减法杂交l提取表达目的基因的细胞提取表达目的基因的细胞mRNA，反转录成，反转录成cDNAl 提取不表达目的基因的细胞提取不表达目的基因的细胞mRNAl 过量杂交过量杂交l两种组织中均表达的基因产物形成两种组织中均表达的基因产物形成cDNA/mRNA杂杂交分子交分子l 特异特异mRNA反转录的反转录的cDNA片段仍保持单链片段
6、仍保持单链减数杂交技术分离减数杂交技术分离差异表达基因差异表达基因DNA/RNA杂交分子可结合杂交分子可结合在羟基磷灰石柱上，而游离在羟基磷灰石柱上，而游离的单链的单链cDNA则过柱流出。则过柱流出。回收的回收的cDNA转变为双链转变为双链cDNA后克隆倒适当的载体后克隆倒适当的载体中，就成为一个减数文库。中，就成为一个减数文库。五、mRNA差别显示技术l又称为差别显示反转录又称为差别显示反转录PCR（DDRT-PCR）l目的序列未知，目的序列未知，1992年由美国哈佛大学医学年由美国哈佛大学医学分校分校Dena-Farber研究所的两位科学家研究所的两位科学家Liang和和Pardee首次提
7、出的，并运用这种方法来分首次提出的，并运用这种方法来分离一对培养的哺乳动物细胞中差别表达的基离一对培养的哺乳动物细胞中差别表达的基因。至今，运用因。至今，运用mRNA差别显示技术分离、差别显示技术分离、鉴定的差别表达基因大约有鉴定的差别表达基因大约有300多个。多个。3 端锚定引物端锚定引物l锚定引物的通式是锚定引物的通式是oligo(dT)12MN，其中，其中M为为A、C、G中的任意一种，中的任意一种，N为为A、C、G或或T中的任中的任意一种，所以意一种，所以共有共有12种种oligo(dT)12MN引物，用引物，用这这12种引物分别对同一总种引物分别对同一总RNA样品进行样品进行cDNA合
8、合成成，即进行，即进行12次不同的反转录反应，每一种次不同的反转录反应，每一种3 端锚定引物，都能够把总端锚定引物，都能够把总mRNA群体的群体的112分分子反转录成子反转录成mRNA-cDNA杂交分子。杂交分子。l这样可以将整个这样可以将整个mRNA群体在群体在cDNA水平上，分水平上，分成大致相等但序列结构不同的成大致相等但序列结构不同的12份亚群体。这一份亚群体。这一过程叫做过程叫做差异显示反转录差异显示反转录，即，即DDRT。5端随机引物端随机引物l另外，还需要另外一种另外，还需要另外一种由由10个核苷酸组成的个核苷酸组成的5端随机引物端随机引物。l这种这种5 随机引物可以同特定细胞类
9、型的总随机引物可以同特定细胞类型的总mRNA群体中的一部分分子发生杂交作用，而群体中的一部分分子发生杂交作用，而且杂交部位是随机地分布在距每条新合成的且杂交部位是随机地分布在距每条新合成的cDNA链链3端的不同位置上。端的不同位置上。l用用3 端锚定引物和端锚定引物和5 随机引物组成的引物对，随机引物组成的引物对，以以mRNA/cDNA为模板进行为模板进行PCR扩增，然后经扩增，然后经过过23h的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以显的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以显示出在示出在100500bp之间的之间的DNA条带条带l20种种 5端随机引物端随机引物l12种种 3端锚定引物端锚定引物l240组引物，
10、进行组引物，进行PCR lPCR过程中加入放射性标记过程中加入放射性标记l变型聚丙烯酰氨凝胶电泳变型聚丙烯酰氨凝胶电泳l放射自显影显示差异表达条带放射自显影显示差异表达条带l对差异表达条带进行割胶回收并制备成探针，从对差异表达条带进行割胶回收并制备成探针，从文库中筛选文库中筛选差别显示分析基本流程差别显示分析基本流程基本程序基本程序l提取两种细胞的总提取两种细胞的总mRNA,反转录后成为反转录后成为2种种cDNAl以一定的引物作随机聚合酶链反应以一定的引物作随机聚合酶链反应l通过扩增产物的电泳分析通过扩增产物的电泳分析,分离出不同样分离出不同样品间的差异条带品间的差异条带l将差异将差异DNA做
11、成探针做成探针l 在在cDNA文库或基因组文库中筛选基因并文库或基因组文库中筛选基因并作功能分析作功能分析 优点：优点：几乎可检测细胞表达的所有基因几乎可检测细胞表达的所有基因 可同时比较多种细胞类型可同时比较多种细胞类型 可同时展现所有差异可同时展现所有差异 用量少，操作简单，快速高效用量少，操作简单，快速高效缺点缺点：12种锚定引物和种锚定引物和20种随机引物，种随机引物，240次次PCR 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离片段小于聚丙烯酰胺凝胶电泳分离片段小于500bp 有些差别条带成簇出现，造成假阳性有些差别条带成簇出现，造成假阳性 缺乏定量分析手段，判断差异条带有难度缺乏定量分析手段，判断差异条
12、带有难度第六章 DNA重组的操作第一节 受体细胞 易于重组易于重组DNADNA分子的导入分子的导入 能使重组能使重组DNADNA分子稳定存在于细胞中分子稳定存在于细胞中 便于重组体的筛选便于重组体的筛选 遗传稳定性高遗传稳定性高 安全性高安全性高 有利于外源基因的高效分泌表达有利于外源基因的高效分泌表达 在遗传密码的应用上无偏倚性在遗传密码的应用上无偏倚性 具有较好的转译后加工机制具有较好的转译后加工机制 有较高的应用价值有较高的应用价值1、原核生物细胞是较为理想的受体细胞 大多原核生物没有坚硬的细胞壁 没有核膜，有利于外源片断重组 基因组简单，便于对外源基因进行遗传分析 多为单细胞生物，繁殖
13、迅速，过程简单缺陷：以原核生物表达真核生物基因存在问题，很多真核生物基因不能在E.coli中表达具生物活性的功能蛋白。缺乏真核生物蛋白质折叠复性系统 缺乏蛋白质加工系统 原核生物内源蛋白易降解空间构象不正确的异源蛋白，造成表达产物不稳定常用受体菌：大肠杆菌 人胰岛素、生长素、干扰素等 枯草杆菌 人干扰素、白细胞介素 乙肝病毒核心抗原等 蓝藻 易于表达植物基因2、真菌细胞低等真核生物酵母菌：以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核微生物，易于表达外源真核基因 基因结构最为简单的真核生物之一 具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统 不含有特异性病毒，不产生毒素 培养简单 可将外源基因表达产物分泌至胞外
14、3、植物细胞 坚硬的细胞壁 纤维素酶处理原生质体 摄取外源片断全能性：在合适的培养条件下，一个分离的活细胞可分化成植株。水稻，棉花，玉米，马铃薯，烟草等4、动物细胞早期：生殖细胞、受精卵细胞或胚细胞现在：体细胞培养动物：猪、羊、牛、鱼、鼠、猴等 生产天然状态的复杂蛋白质 动物疫苗 动物品种的遗传改良 人类疾病的基因治疗第二节 重组体导入受体细胞2.1 重组质粒DNA转化大肠杆菌 转化（transformation）定义转化微生物的种类感受态细胞 P139转化过程供体（donor）：提供DNA的生物受体（recipient or host）：获得DNA的生物1.定义l转化：受体菌直接吸收供体菌的
15、DNA片断而获得后者部分遗传性状的现象。l转化子（transformant）：通过转化方式而形成的杂种后代。2.转化微生物的种类 首次发现转化现象 肺炎链球菌（Griffith,1928）嗜血杆菌属、芽孢杆菌属、奈瑟氏球菌属、根瘤菌嗜血杆菌属、芽孢杆菌属、奈瑟氏球菌属、根瘤菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属、黄单胞菌属等。属、葡萄球菌属、假单胞菌属、黄单胞菌属等。3.感受态感受态（competence）感受态：指受体细胞最易接受外源DNA片断并能实现转化的一种生理状态。感受态是细菌的一种遗传特性，而且也受生长阶段、培养条件的影响。肺炎链球菌 对数生长后期芽孢杆菌属 指数期末和稳定期大肠杆菌 刚进入对
16、数期DH5菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5107 个/ml左右 大肠杆菌 革兰氏阴性菌 细胞表面的结构和组成与革兰氏阳性菌不同 转化因子的吸收较为困难 人工制备感受态细胞4.转化过程大肠杆菌的转化方法：Ca 2诱导大肠杆菌转化法 电穿孔转化法 三亲本杂交接合转化大肠杆菌1、Ca 2诱导大肠杆菌转化法 培养培养生命活动旺盛的菌体生命活动旺盛的菌体 菌种分纯活化，扩大培养，处于对数生长期菌种分纯活化，扩大培养，处于对数生长期 沉淀菌体沉淀菌体 冰水浴中预冷冰水浴中预冷10分钟，分钟，4 4 离心离心 化合物处理化合物处理 含含CaCl2 无菌无菌预冷缓冲液处理预冷缓冲液处理 DNA分子转
17、化感受态细胞分子转化感受态细胞制备感受态细胞的注意事项制备感受态细胞的注意事项1.细胞生长状态和密度细胞生长状态和密度:l不要用经过多次转接或储于不要用经过多次转接或储于的培养菌，最好从的培养菌，最好从70或或 20甘油保存的菌种甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。液。l细胞生长密度以刚进入细胞生长密度以刚进入对数生长期对数生长期时为好，可通过监测培养时为好，可通过监测培养液的液的OD600 来控制。来控制。DH5菌株的菌株的OD600 为为0.5时时,细胞密度细胞密度在在5107 个个/ml左右左右(不同的菌株情况有所不同不同的菌株情况有所不同)
18、，这时比较合，这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。适。密度过高或不足均会影响转化效率。2.质粒的质量和浓度质粒的质量和浓度:l用于转化的质粒用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。l转化效率与外源转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比的浓度在一定范围内成正比,但当但当加入的外源加入的外源DNA的量过多或体积过大时的量过多或体积过大时,转化效率就会转化效率就会降低。降低。1ng的的cccDNA即可使即可使50l 的感受态细胞达到饱的感受态细胞达到饱和。一般情况下和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞溶液的体积不应超过感受态细胞体积的
19、体积的5。3.试剂的质量试剂的质量:l所用的试剂所用的试剂,如如CaCl2 等均需是最高纯度的等均需是最高纯度的(GR.或或AR.)，并用超纯水配制，最好分装保存于干，并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。燥的冷暗处。4.防止杂菌和杂防止杂菌和杂DNA的污染：的污染：l整个操作过程均应在整个操作过程均应在无菌条件下进行无菌条件下进行，所用器皿，如，所用器皿，如离心管，离心管，tip头等最好是新的，并经高压灭菌处理，头等最好是新的，并经高压灭菌处理，所所有的试剂都要灭菌有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、，且注意防止被其它试剂、DNA酶酶或杂或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂所
20、污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。感受态细胞的制备感受态细胞的制备1、挑取平板上的大肠杆菌单菌落接种于、挑取平板上的大肠杆菌单菌落接种于2 mL LB液体培液体培养基中，养基中，37振荡培养过夜振荡培养过夜2、按、按1的接种量接种于的接种量接种于3 mL新鲜新鲜LB培养液，培养液，37剧烈剧烈振荡培养至振荡培养至OD600为为0.4-0.6(可见雾状可见雾状)3、倒至、倒至1.5mL的的eppendorf管中管中,4下下12,000 rpm离心离心1 min，倒出培养液，用无菌滤纸尽量吸干，倒出培养液，用
21、无菌滤纸尽量吸干4、加入、加入1mL 预冷的无菌预冷的无菌0.1molL-1 CaCl2溶液涡旋，溶液涡旋，4下下12,000 rpm离心离心30秒秒,尽量去除上清尽量去除上清5、沉淀以、沉淀以50-100L 预冷的预冷的0.1molL-1 CaCl2重悬，重悬，4保保存备用，存备用，7d内可用。内可用。细胞的转化细胞的转化2ul2ul重组重组DNADNA50ul50ul感受态细胞混匀感受态细胞混匀冰浴冰浴30min30min4242热激热激9090120S120S冰浴冰浴2min2min复苏：加入复苏：加入450ul450ul液态液态LBLB培养基，培养基，37 37 轻缓轻缓振荡培养（振荡
22、培养（150rpm150rpm），），1.51.52h2h取取303050ul50ul，涂布在含相，涂布在含相应抗生素的培养基上，平应抗生素的培养基上，平板培养板培养挑取单菌落，于含相应抗生素挑取单菌落，于含相应抗生素的液态培养基培养后，取一定的液态培养基培养后，取一定量提取质粒，进行鉴定（酶切、量提取质粒，进行鉴定（酶切、杂交、测序等）杂交、测序等）CaCl2 的诱导原因：l 在在0的的CaCl2 低渗溶液中，细菌细胞发生低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，膨胀，Ca 2使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中部分核酸酶解促使细胞外膜与内膜间隙中部分核酸酶解
23、离，诱导形成感受态离，诱导形成感受态l Ca 2 能与加入的能与加入的DNA分子结合，形成抗分子结合，形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基磷酸钙复合物，脱氧核糖核酸酶的羟基磷酸钙复合物，黏附在胞膜的外表面；黏附在胞膜的外表面；42 热激处理，细热激处理，细胞膜的液晶结构发生扰动，出现间隙。胞膜的液晶结构发生扰动，出现间隙。提高转化效率的因素：Mg Cl 2与CaCl2 共同处理 二甲基亚枫（DMSO）、二硫苏糖醇（DTT）提高1001000倍，易污染 RbCl、MnCl 2、LiCl和KCl等与CaCl2多盐处理 对照处理：DNA对照处理：无菌水代替感受态细胞，检验DNA溶液 感受态细胞对照处理：NTE
24、缓冲液代替DNA溶液，检验感受态细胞感受态细胞有效性对照处理：加入已知的容易转化的质粒DNA原因：转化处理过程中，可能感染杂菌，导致假阳性2、电穿孔转化法（P140）基本原理：利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔，形成可逆的瞬间通道，促进外源DNA的有效吸收。影响因素：电场强度，电脉冲时间，外源DNA浓度 菌体制备 冷却，离心，洗涤（降低离子强度）10甘油重悬细胞，-70 贮存 低温下（04）进行电穿孔转化3、三亲本杂交接合转化大肠杆菌根据非接合质粒的迁移作用而建立，目前常用的载体多是在非接合型质粒或缺少了接合转移基因的接合型质粒的基础上而构建的。待转化的受体菌 含有要转化的重组质
25、粒的供体菌 含有广泛宿主的辅助质粒的辅助菌（如：辅助菌株E.coli(pRK2013)）4、转化率：DNA分子转化受体菌获得转化子的效率 以转化子数与用于转化处理的DNA分子数或质量的比率表示 以转化子数与用于转化处理的受体细胞数的比率表示P150影响转化率的因素：重组DNA 分子质量较小，亲和性强，双螺旋闭合结构 受体细胞 受体细胞的选择非常重要 转化手段 电穿孔法Ca诱导法三亲本杂交法2.2 重组DNA分子转导大肠杆菌转染：将重组DNADNA分子分子直接导入受体细胞的过程。导入受体细胞的过程。转导转导：通过通过 噬菌体噬菌体颗粒颗粒感染宿主细胞的途径把外源细胞的途径把外源DNADNA分子转
26、移到受体细胞内的过程。分子转移到受体细胞内的过程。P142转化转化:139:1392.3 重组DNA分子导入植物细胞(P144)（1）农杆菌介导的Ti质粒载体转化法 革兰氏阴性菌作用机制：将待转移的目的基因组入农杆菌中的Ti质粒载体农杆菌识别敏感植物，将Ti质粒的T-DNA转移到植物细胞内部 选择合适的外植体 根据受体细胞的转化能力来决定 农杆菌的接种操作（接种到损伤切面，使农杆菌与外植体共培养）洗菌并筛选培养（无菌水清洗共培养后的外植体，无菌滤纸吸干后转移到筛选培养基上，杀死或抑制附着于表面的农杆菌）农杆菌介导外源基因转化植物的基本程序：1.创伤植株感染法创伤植株感染法（植株接种共转化法）2
27、.共培养感染法共培养感染法叶盘转化法植物愈伤组织共培养转化法植物悬浮细胞共培养转化法原生质体共培养转化法常用方法：创伤植株感染法创伤植株感染法（植株接种共转化法）l在整体植株上造成创伤在整体植株上造成创伤l农杆菌接种在创伤表面或针头注射农杆菌农杆菌接种在创伤表面或针头注射农杆菌l农杆菌以天然的感染过程在植株体内感染农杆菌以天然的感染过程在植株体内感染l获得转化的植物愈伤组织获得转化的植物愈伤组织共培养感染法共培养感染法l叶盘转化法叶盘转化法l植物愈伤组织共培养转化法植物愈伤组织共培养转化法l原生质体共培养转化法原生质体共培养转化法l植物悬浮细胞共培养转化法植物悬浮细胞共培养转化法 叶盘转化法
28、叶子表面进行消毒，再用消毒过的不锈钢打孔器从叶子上取下圆形小片 接种处理，放在农杆菌培养液中浸泡数秒钟 滤纸吸干，看护培养基上进行培养 培养两天后，滤纸连同叶盘转移到含有选择药物的“长芽”培养基中，筛选与再生培养 转移到“生根”培养基上诱导幼芽生根植物愈伤组织共培养转化法愈伤组织与农杆菌共培养抗生素筛选培养诱导分化植株再生（2）DNA的直接转移法 多聚物介导法 电穿孔转化法 激光微束穿孔转化法 显微注射法超声波介导转化法 基因枪法 脂质体介导法 花粉管通道法 基因枪法 P146 将DNA吸附在由钨制作的微型子弹(直径约为1.2um)表面 通过特制的手枪，将子弹高速射入完整的细胞和组织内 转化效
29、率与射击距离、真空度、子弹速度、子弹数目以及CaCl2和亚精胺(使子弹吸附在DNA上)的浓度等因素有关 避开原生质体再生植株的难关，单子叶植物基因转移的有效途径。2.4 重组DNA分子导入哺乳动物细胞 P148 磷酸钙转染法 DEAE葡聚糖转染法 聚阳离子DMSO转染法 脂质体介导法病毒介导的转染生化转染物理转染 病毒颗粒转导法 显微注射法 电穿孔法要点要点l转化？转染？转导？转化？转染？转导？l感受态细胞？大肠杆菌感受态细胞如何感受态细胞？大肠杆菌感受态细胞如何制备？制备？lCa 2诱导大肠杆菌转化和电击转化？诱导大肠杆菌转化和电击转化？l植物基因工程中的农杆菌介导法？植物植物基因工程中的农杆菌介导法？植物基因工程中外源基因转入植物细胞的方基因工程中外源基因转入植物细胞的方法？动物基因工程中外源基因转入植物法？动物基因工程中外源基因转入植物细胞的方法？细胞的方法？