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1、实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术技术所谓real-time FQ-PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。第1页/共38页是一种完全闭管式的PCR和荧光探针杂交技术相结合的定量PCR方法。PCR的高效扩增特性 核酸探针的高特异性 光谱技术的高灵敏性和可计量性第2页/共38页实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR定义利用荧光信号对PCR反应的过程进行实时监控目的对起始模板进行定量l优点 灵敏，重复性，动态范围宽，高通量l原理 Ct 值与起始模板浓度的对数成比例第3页/共38页实时荧光定量实时荧光定
2、量PCRPCR原理原理PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不再以指数方式生成模板，从而进入平台期。在传统的PCR 中，常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产物，因此用此终点法对PCR产物定量存在不可靠之处。第4页/共38页利用电泳定量利用电泳定量11,500 counts/5200 counts=2.2 fold difference第5页/共38页实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理在real-time Q-PCR中，对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号，随着反应时间的进行，监测
3、到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。第6页/共38页实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理在PCR反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显地区别，而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期，因此可以在PCR反应处于指数期的某一点 上来检测PCR产物的量，并且由此来推断模板最初的含量。第7页/共38页实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理为了便于对所检测样本进行比较，在real-time Q-PCR反应的指数期，首先需设定一定荧光信号的域值（threshold）。以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号（baseline），荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的
4、标准偏差的10倍。threshold=10´SDcycle 6-15 第8页/共38页实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理如果检测到荧光信号超过域值被认为是真正的信号，它可用于定义样本的域值循环数（Ct）。Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。第9页/共38页什么是什么是C(t)C(t)值值C(t)Threshold（域值）第10页/共38页为什么要引入为什么要引入C(t)C(t)值值CtEndpoints96 replicates of B7 gene molecular beacon第11页/共38页实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原
5、理原理研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。第12页/共38页实时荧光定量实时荧光定量Ct 18 and Ct 22,2(4 Ct shift)=16 fold difference第13页/共38页实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。第14页/共38页如何定量如何定量标 准 曲 线 未知样品的C(t)值 定量第15页/共38页荧光化学荧光化学荧光定量PCR所使用的荧光化
6、学可分为两种：荧光探针和荧光染料。荧光探针：TaqMan荧光探针 荧光染料：SYBR荧光染料 第16页/共38页一、TaqMan检测技术检测技术原理原理PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，与扩增片断内部某一段系列相同或互补，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。第17页/共38页探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。第18
7、页/共38页TaqMan检测技术原理示意图原理示意图PCR扩增前PCR扩增时上游引物完好探针DNA合成荧光物质荧光淬灭物质探针水解，释放荧光模板负链第19页/共38页TaqMan 探针未结合的探针探针、引物与目的片段结合，FRET光发射或者以热量形式散失Donor dye(Reporter)Acceptor dye(Quencher)LightEnergy transferTaqTaq 水解探针，报告荧光素与淬灭荧光素分离TaqLight EmissionLight第20页/共38页TaqManTaqMan检测技术的设计检测技术的设计与普通PCR的设计基本相同，区别在于引物与探针的设计一般需要
8、特定的软件，如美国ABI公司开发的Primer Express软件。第21页/共38页（一）选择靶基因TaqMan技术主要用于检测，所以其扩增的基因必须是特异的，如：某种病原微生物所共有的保守基因 （检测某种病原微生物）；某个血清型所特有的基因序列 （区分检测某个血清型）；选择决定毒力强弱的基因 （区分强毒和弱毒）等。第22页/共38页（二）选择探针选择探针需要同时满足以下条件：1、在靶基因的保守区域2、G+C含量在40%以上；3、相同碱基连续不超过4个；4、Tm值在712;第23页/共38页（二）选择探针5、内部自身配对较少；6、5端不为G；7、G数目比C数目少；如果6和7难以满足的时候，就
9、要考虑用互补序列作探针。第24页/共38页（三）选择引物探针选好之后，在探针的上下游分别选择合适的引物序列，引物应满足如下的条件:1、在靶基因保守和无二级结构的区域；2、与探针所在区域不重叠；第25页/共38页（三）选择引物3、与靶基因其他区域配对较少；4、G+C含量在40%以上；5、相同碱基连续不超过4个；6、Tm值比探针Tm值低101;第26页/共38页（三）选择引物7、探针与两条引物之间的各种组合形成的二聚体都较少，特别是引物3端与探针配对很少；8、PCR扩增片断在70250个碱基之间。如果找不到合适的引物，可调整探针（向前或向后）的序列，或重新选择一个探针，再寻找合适的引物。第27页/
10、共38页普通PCR临床检测技术的缺点普通PCR临床检测技术虽然解决了检出率低、周期长的问题，但由于假阳性率高，不能正确指导临床实践。因此国家卫生部曾在1997年行文禁止将普通PCR技术用于临床诊断。第28页/共38页1、采用闭管检测，不需PCR后处理，并采用dUTP-UNG酶的防污染系统，扩增和检测一次同时完成。不需开盖，不产生污染，避免了假阳性。FQ-PCR与普通与普通PCR的区别的区别第29页/共38页2、探针与被检DNA序列特异杂交，增强了特异性。A、上下游引物和探针三道关卡控制其特异性；B、引物和探针都比较长，退火温度较高，非特异性扩增几率减少。FQ-PCR与普通与普通PCR的区别的区
11、别第30页/共38页3、可定量结果，准确灵敏地反应了病原体的感染和治疗恢复情况。FQ-PCR与普通与普通PCR的区别的区别第31页/共38页FQ-PCR与普通与普通PCR的区的区别别4、光谱分析仪直读结果，自动分析，增强了灵敏性和客观性。能够实时检测，即一边PCR，一边检测PCR的结果，而不需要在PCR结束之后进行核酸电泳来显示PCR反应的结果，（因此实时荧光PCR检测技术操作更简单；也避免了核酸电泳非常难以回避的化学污染和核酸污染等严重问题）；第32页/共38页FQ-PCR与普通与普通PCR的区的区别别5、可以多重检测。如果检测两种以上的基因片断，可以对各个基因分别设计探针和引物，在不同的反
12、应管中进行TaqMan检测，或者将各自的探针分别标记不同的荧光信号，在同一个反应体系中检测多个基因片断。第33页/共38页二、二、SYBRSYBR荧光染料原理荧光染料原理在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。第34页/共38页ssDNA=free dye(weak fluorophore)dsDNA=Binds minor groove(intense fluorophore)SYBR Green I(双链DNA结合染料)第35页
13、/共38页人医现所开展的检测项人医现所开展的检测项目目乙肝病毒乙肝病毒（HBV）荧光定量）荧光定量PCR检测检测 丙肝病毒丙肝病毒（HCV）荧光定量）荧光定量PCR检测检测淋球菌淋球菌（NG）荧光定量）荧光定量PCR检测检测沙眼衣原体（沙眼衣原体（CT）荧光定量荧光定量PCR检测检测解脲支原体（解脲支原体（UU）荧光定量荧光定量PCR检测检测结核分支杆菌（结核分支杆菌（TB）荧光定量荧光定量PCR检测检测第36页/共38页兽医现所开展的检测项目兽医现所开展的检测项目禽流感病毒禽流感病毒（ALV）荧光定量）荧光定量PCR检测检测 新城疫病毒新城疫病毒（NDV）荧光定量）荧光定量PCR检测检测蓝耳病病毒（蓝耳病病毒（PRRSV）荧光定）荧光定量量PCR检测检测第37页/共38页感谢您的观看！第38页/共38页