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1、实时荧光定量实时荧光定量PCR技术技术提纲：提纲：实时荧光定量PCR原理 数学原理 化学原理实时荧光定量PCR的方法应用 绝对定量 相对定量定量PCR的实验要素平台定量PCR仪器介绍第1页/共38页实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR定义定义定义定义：在在PCRPCR反应体系中加入反应体系中加入荧光基团荧光基团，利用，利用荧光信号累积实现了荧光信号累积实现了实时监测实时监测整个整个PCRPCR进程，对进程，对起始模板起始模板进行定量分析的方法。进行定量分析的方法。第2页/共38页与普通与普通与普通与普通PCRPCR的区别的区别的区别的区别普通PCR技术：在PCR结束后对终点产物进行定量分析。实
2、时定量实时定量PCRPCR技术：技术：实时检测实时检测PCRPCR扩增，在扩增的扩增，在扩增的指数期指数期对起对起始模板进行定量。始模板进行定量。第3页/共38页第4页/共38页第5页/共38页第6页/共38页荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是 基线（背景）荧光信号的标准偏差的 10 倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值（threshold value）。第7页/共38页第8页/共38页定量PCR的数学原理第9页/共38页第10页/共38页斜率与扩增效率第11页/共38页第12页/共3
3、8页荧光定量PCR化学原理 非特异性荧光标记：1、SYBR Green 特异性荧光标记：2、TaqMan第13页/共38页1、SYBR Green 法第14页/共38页SYBR Green 熔解曲线分析第15页/共38页SYBR Green法优缺点优点:对DNA模板没有选择性适用于任何DNA使用方便-不必设计复杂探针非常灵敏便宜第16页/共38页2、TaqMan探针法第17页/共38页TaqMan作用机理第18页/共38页TaqMan法优缺点第19页/共38页 Real-time PCR 方法应用方法应用第20页/共38页绝对定量(Absolute Quantification，AQ)病原体检
4、测 转基因食品检测 基因表达研究相对定量(Relative Quantification，RQ)基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究第21页/共38页绝对定量与相对定量的定义第22页/共38页绝对定量通过标准品定量绝对定量的标准样品：已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。标准样品的种类：含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒含有和待测样品相同扩增片段的cDNAPCR的产物第23页/共38页绝对定量：从荧光到拷贝数第24页/共38页相对定量通过内标定量内标（Endogenous Control）通常是-actin、GAPDH基因等看家基因在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环
5、境因素影响小内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量第25页/共38页相对定量：参照因子Calibrator 第26页/共38页相对定量分析方法1 -Ct-Ct前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100且偏 差在 5以内 1、用内参基因的CT值归一目标基因的CT值：CTCT（test)=CT test)=CT（target,test)-CT target,test)-CT（ref,test)ref,test)CT CT（calibrator)=CT calibrator)=CT（target,calibrator)-CT target,calibrator)-CT（ref,calibra
6、tor)ref,calibrator)2、用校准样本的CT值归一试验样本的CT值：CT=CT（test)-CT（calibrator)3、计算表达水平比率：2 CT=表达量的比值第27页/共38页相对定量分析方法相对定量分析方法2 2：双标准曲线法双标准曲线法目标基因与内参基因扩增效率不同目标基因与内参基因扩增效率不同 待测样品目的基因浓度待测样品目的基因浓度 待测样品内参基因浓度待测样品内参基因浓度 F=对照样品目的基因浓度对照样品目的基因浓度 对照样品内参基因浓度对照样品内参基因浓度第28页/共38页 定量PCR的实验要素第29页/共38页样品DNA纯度：OD260/OD280=1.8，1
7、.6 2.0之间DNA用量：0.05 ng 100 ngRNA纯度：OD260/OD280=2.0 cDNA用量：1-100 ng 总RNA反转录的cDNA取1 uL第30页/共38页标准品第31页/共38页标准品梯度稀释方法第32页/共38页复管测试样品和标准品都要重复重复次数须遵循统计学要求第33页/共38页平台PCR仪介绍ABI 7500 fast特征：特征：特征：特征：使用96孔板，样品量大，仪器稳定，结果分析直观ABI试剂ROX校正物理方面的误差：枪的误差（如试剂体积）、耗材质量（如管盖厚度、透光性能不一致）所导致的光能损失、仪器稳定性（如孔间、批间温度的波动）Rn=Normalization=Reporter/Referenc第34页/共38页Rotor gene 6500HRM特征：特征：特征：特征：36孔(普通透明0.2mlPCR管)或者72孔(特殊0.1ml管)离心式检测可以做HRM。第35页/共38页MJ Opticon 2特征：特征：特征：特征：可以使用8连排管或96孔板，软件操作简单第36页/共38页 谢谢！第37页/共38页感谢您的观看。感谢您的观看。第38页/共38页