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1、主要表现为PCR产物分析手段落后：琼脂糖凝胶电泳法只能判断产物片段大小，并不能鉴别产物特异性。造成传统PCR检测缺点非特异性难以判断、假阳性多和重复性差等。实验室管理制度落后；人员培训水平落后；国内PCR市场存在的问题第1页/共36页反相膜杂交技术 复星微孔板杂交技术 复星、华美、复华、浩源、锦宏荧光PCR技术 复星、达安、匹基国内发展的核酸检测新技术第2页/共36页反相膜杂交技术原理首先将特异性探针交联在固相载体膜上，这时载体膜以及膜上的探针相当于固定相，当膜条的一端与带有杂交反应物的液面接触时，带有生物素标记的基因片段、标记酶、酶底物依次通过这个固定点时，其表现的效应行为类似于过滤或者是亲
2、和层析，这时探针有机会与流动相中的靶序列充分作用特异性结合（杂交），再经过酶显色最终显示出蓝紫色斑点。第3页/共36页反相膜杂交原理示意图第4页/共36页主要优点：1.操作简便；2.无特殊设备要求；3.适合于分型；4.结果可原始保存。主要缺点：只能进行半定量操作第5页/共36页微孔板杂交技术原理具体来讲，用生物素（Biotin）标记的PCR扩增产物，与固定在酶标板上的链霉亲合素（Streptavidin，SA）结合，再与抗原标记的特异性HBV探针进行正向法杂交。产物通过探针连接的抗体酶识别基团和标记碱性磷酸酶的抗体特异结合后，酶催化底物，在酶标板中显出颜色，通过酶标仪读取光吸收值。第6页/共3
3、6页微孔板杂交技术原理示意图第7页/共36页主要优点：1.杂交部分操作类似于ELISA，实验人员较熟悉；2.可向全自动过度；3.可定量操作。主要缺点：1.分型困难；2.试剂成本较高；3.操作较复杂。第8页/共36页荧光PCR技术原理荧光PCR试剂比常规PCR试剂多一个寡聚核苷酸探针，这个探针带有一个荧光发光分子和一个荧光淬灭分子，完整的探针在激发光激发下，发光分子所产生的荧光被淬灭分子全部吸收，样品无荧光。而PCR过程中。Taq酶分子在链延长过程中可以通过自身的5 3核酸外切酶降解与模板结合的特异性荧光探针，使得荧光发光分子从探针上切下来而与荧光淬灭分子分开，从而在激发光激发下产生特定波长的荧
4、光，这种荧光随着PCR扩增过程而动态增强。第9页/共36页荧光PCR技术原理示意图第10页/共36页主要优点：1.能对靶基因进行定量检测；2.在封闭状态下进行产物检测，减少了污染机会。主要缺点：1.仪器设备昂贵，不利于推广；2.分型困难。第11页/共36页核酸检测实验室的设置为了防止由标本（微生物或非微生物）和靶核酸模板以及经PCR扩增的靶核酸片段所引起的交叉污染，核酸检测实验室中应设置三个专用的实验室。前PCRPCR区1 1（试剂配制实验室）用途：该实验室是无临床标本和无核酸污染区，用于配制各类试剂及设置PCR扩增反应管无（靶核酸模板）。基本设备：1.实验应有紫外灯；2.PCR防污染罩；3.
5、冰箱（4，-20）；4.台式小型高速离心机、旋涡振荡器、各种规格移液器（0-10ul、40-200ul、50-1000ul）等；5.高压灭菌的各种Eppendorf管和移液器吸嘴；6.专用文具用品；7.实验桌椅（实验台台面防酸、防碱和耐热）；8.自来水设备第12页/共36页前PCRPCR区2 2（标本制备实验室）用途：该实验室用于分离和抽提病原微生物中的核酸，防止因标本处理而引起的实验室感染和检测的交叉污染。基本设备：1.实验室应有紫外灯；2.超净台或PCR防 污染罩；3.冰箱（4，-20）；4.高压灭菌器(处理传染性标本和物品)；5.高速和低速离心机、旋涡振荡器、各种规格移液器（0-10ul
6、、40-200ul、50-1000ul）等；6.高压灭菌的各种Eppendorf管和移液器吸嘴；7.专用文具用品；8.救护药箱，包括外伤用药，眼睛冲洗液等；9.实验桌椅（实验台台面防酸、防碱和耐热）；10.电话机（备有关临床医生的电话号码，以便因突发事件及时联系）；11.自来水设备。第13页/共36页后PCRPCR区（扩增和分析实验室）用途:该实验室用进行PCR扩增和PCR扩增产物的各类分析操作。基本设备：1.实验室应设有紫外灯；2.各类PCR扩增仪；3.电泳仪、电泳槽、紫外分析仪；4.照相设备或凝胶分析系统；5.台式小型高速离心机、孵育箱（水浴或恒温）；6.冰箱（4、-20）；7.微波炉；8
7、.配套移液器（若干）；9.高压灭菌的各种Eppendorf管和移液器吸嘴。10.电脑和专用文具用品、救护药箱；11.实验桌椅（实验台台面防酸、防碱和耐热）；12.自来水设备;13.其他仪器：根据检测方法不同而定。第14页/共36页定量技术比较第15页/共36页第16页/共36页试剂盒的检测灵敏度试剂盒的检测灵敏度第17页/共36页荧光定量PCR试剂盒检测HBV-DNA结果与临床的关系第18页/共36页经统计，经统计，X X2 2=1.15=1.15，P0.05P2log10）;停药标准：达显效病人，继续用药3-6个月，仍为显效者，可停药；停药后，继续随访观察6-12个月，每3-6个月复查HBV
8、 DNA。第24页/共36页丙型肝炎病毒的核酸检测丙肝：输血后肝炎主要原因 急性期226周（平均7.4周）潜伏期12个月酶免检出率：1月 17.4 26月 6080 1年 80病毒特点：滴度低；免疫反应弱；变异快第25页/共36页 HCV 病毒载量监测实验在常规病人护理中扮演的角色开始治疗改变治疗方案选择治疗方案确证疗效第26页/共36页通过监测HCV病毒滴度反映疗效WeeksMedian HCV RNA(copies/ml)第27页/共36页IFN-单次给药后HCV-1病毒滴度变化的定量监测N=32genomes/ml*1million第28页/共36页淋病双球菌（NG）的核酸检测标本取材：
9、男性：作尿道挤压和前列腺按摩以取得尿道口分泌物 女性：宫颈口分泌物诊断方法：1、涂片染色：在中性粒细胞中寻找革兰氏阴性的双球菌 简便易行，但灵敏度不高，女性病人检出率仅50%左右 2、分离培养：WHO推荐 培养较困难，生化鉴定复杂，时间长 3、ELISA检测抗原 存在交叉反应第29页/共36页由于PCR具有敏感性高、特异性强等优点，适用于淋病的快速诊断和流行病学调查。利用PCR可以帮助解决的主要问题有：（1）对分离培养的菌株进行鉴定和进一步分析。（2）提高检测临床标本的阳性率和准确性。（3）用于抗生素治疗的疗效观察。（4）对淋球菌菌株进行分子流行病学分析。第30页/共36页沙眼衣原体（CT）的
10、核酸检测标本取材：同淋球菌在非淋性尿道炎中，由衣原体引起的占50%以上，健康人群约有10%感染率。诊断方法：（1）细胞培养 繁琐、费时，且培养条件不适、标本运送不当、标本不足等因素均可影响检测敏感度。（2）免疫荧光法、酶联免疫法 简便快速，但灵敏度和特异性均低于培养法。第31页/共36页应用PCR检测方法灵敏度、特异性可达94100%，可做为临床上各种衣原体感染标本检测的实用方法，尤其适用于衣原体感染的早期诊断及无症状携带者的检查。第32页/共36页解脲支原体（UU）的核酸检测标本取材：同淋球菌非淋性尿道炎约2030%由UU引起。据报到男性不育患者精液中，UU检出率高达66.6%。检出率随精子
11、活动力下降而升高。认为UU感染可能与男性不育有关。诊断方法：（1）UU难以分离，培养需特殊培养基，操作费时，一般需13天才能得到初步结果。（2）血清学检查，仅10%UU尿道炎患者在病程中特异性抗体滴度升高4倍。因此PCR鉴定解脲支原体具有较高应用价值。第33页/共36页结核杆菌（TB）的核酸检测标本取材：1、对肺结核的可疑患者，留取清晨第一口痰液。2、有血尿或脓尿，疑肾和膀胱结核的患者收集尿液。3、结核性胸膜炎、腹膜炎，由专科医生收集胸水或腹水。4、鞘膜积液由专科医生抽取送检。5、结核性脑膜炎可疑患者，抽取脑脊液送检。6、肠结核患者收集带粘液的粪便送检。检测方法：1、涂片染色镜检 阳性率低，要每毫升痰中有10万个结核菌以上才能检出。第34页/共36页 2、分离培养 金标准 生长缓慢，接种46周才出现肉眼可见的菌落。3、免疫学途径 OT试验 PPD试验 只说明机体是否感染过结核杆菌，不能区分现行感染与既往感染，也不能说明标本中病原菌是否存在。PCR技术以检测结核杆菌的遗传物质为基础，其临床意义主要有：（1）提高检测结核杆菌的阳性率和准确性。（2）结核的早期诊断。（3）鉴别诊断。（4）抗痨治疗的疗效评价。第35页/共36页感谢您的观看！第36页/共36页