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1、微生物的培养技术及应用微生物的培养技术及应用（第（第2课时）课时）高二人教版生物学选择性必修3第1章课题背景 自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想要想从中分离出需要的特定微生物从中分离出需要的特定微生物并不容并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，更难实现不是优势种群时，更难实现。稀释涂布平板法呈现的杂菌群那么我们又如何达成这一目标呢？科学家们应用选择性培养基解决了这一难题。科学实例科学实例：寻找耐高温的DNA聚合酶启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。筛选原因：因为热泉的高
2、温条件淘汰了绝大多数微生物，使耐热的Taq细菌保留下来。PCR是一种在体外DNA复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。1966年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的Taq细菌，并分离到耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）。耐高温的酶耐高温生物体高温环境（热泉、火山口）寻找寻找一、选择培养基一、选择培养基在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。培养基。（一）（一）概念：概念：（二）（二）原理：原理：人为提供人为提供有利于目的菌生长有利于目的菌生
3、长的条件（包括的条件（包括营养、温度营养、温度和和pH等），同时等），同时抑制或阻止其他微生物抑制或阻止其他微生物的生长的生长。（三）（三）类型：类型：1.利用改变培养条件进行选择培养。利用改变培养条件进行选择培养。7080的高温的高温分离耐高温的水生栖热菌分离耐高温的水生栖热菌使用使用将将pH调至酸性调至酸性的培养基的培养基分离耐酸菌分离耐酸菌2.利用添加某种化学物质进行选择培养利用添加某种化学物质进行选择培养加入青霉素加入青霉素分离酵母菌、霉菌等真菌分离酵母菌、霉菌等真菌无氧环境无氧环境分离厌氧菌分离厌氧菌3.利用营养条件（营养缺陷）进行选择培养利用营养条件（营养缺陷）进行选择培养不加碳源
4、（含碳有机物）的培养基不加碳源（含碳有机物）的培养基分离出自养型微生物分离出自养型微生物不加氮源的培养基不加氮源的培养基分离出固氮菌分离出固氮菌思考：如果让你分离土壤中分解思考：如果让你分离土壤中分解尿素的细菌，尿素的细菌，你你应该怎样设计培应该怎样设计培养基呢？养基呢？思考-讨论选择培养基配方的设计尿素的立体结构 尿素尿素尿素尿素CO(NHCO(NHCO(NHCO(NH2 2 2 2)2 2 2 2含氮量高，化学性质稳定，是现代含氮量高，化学性质稳定，是现代含氮量高，化学性质稳定，是现代含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的农业生产中一种重要的农业生产中一种重要的农业生产中一种重
5、要的氮肥。氮肥。氮肥。氮肥。尿素被土壤中某些细菌分尿素被土壤中某些细菌分尿素被土壤中某些细菌分尿素被土壤中某些细菌分解成解成解成解成NHNHNHNH3 3 3 3,再被转化为再被转化为再被转化为再被转化为NONONONO3 3 3 3-、NHNHNHNH4 4 4 4+等被植物吸收。等被植物吸收。等被植物吸收。等被植物吸收。这些细菌之所以能分解尿素，是因为能合成这些细菌之所以能分解尿素，是因为能合成这些细菌之所以能分解尿素，是因为能合成这些细菌之所以能分解尿素，是因为能合成脲酶脲酶脲酶脲酶，来催化尿素分解。，来催化尿素分解。，来催化尿素分解。，来催化尿素分解。讨论：1.1.你如何设计培养基配方
6、，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来？你如何设计培养基配方，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来？2.2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？培养基添加培养基添加培养基添加培养基添加尿素作唯一氮源尿素作唯一氮源尿素作唯一氮源尿素作唯一氮源，只有能合成，只有能合成，只有能合成，只有能合成脲酶脲酶脲酶脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素、微生物由于不能分解尿素、微生物由于不能分解尿素、微生物由于不能分解尿素、缺乏氮源缺乏氮源缺乏
7、氮源缺乏氮源而不能生长发育繁殖，所以用此培养基就能够而不能生长发育繁殖，所以用此培养基就能够而不能生长发育繁殖，所以用此培养基就能够而不能生长发育繁殖，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。选择出分解尿素的微生物。选择出分解尿素的微生物。选择出分解尿素的微生物。见见P18页培养基配方页培养基配方1.1.从物理性质来讲，两者属于从物理性质来讲，两者属于_培养基，培养基，判断依据是判断依据是_；该类培养基的主要用途为该类培养基的主要用途为_；2.2.从用途上来讲，培养基二属于从用途上来讲，培养基二属于_培养基，培养基，目的是为了获得目的是为了获得_；3.3.两种培养基共有的培养基成分有：两种
8、培养基共有的培养基成分有：_；培养基一的碳源为培养基一的碳源为_，氮源为，氮源为_；培养基二的碳源为培养基二的碳源为_，氮源为，氮源为_。培养基一培养基一牛肉膏牛肉膏5.0g5.0g蛋白胨蛋白胨10.0g10.0gNaClNaCl5.0g5.0g琼脂琼脂20.0g20.0g蒸馏水蒸馏水定容到定容到1000ml1000ml培养基二培养基二KHKH2 2POPO4 41.4g1.4gNaHNaH2 2POPO4 42.1g2.1gMgSOMgSO4 47H7H2 2O O0.2g0.2g葡萄糖葡萄糖10.0g10.0g尿素尿素CO(NHCO(NH2 2)2 21.0g1.0g琼脂琼脂15.0g15
9、.0g蒸馏水蒸馏水定容到定容到1000ml1000ml固体固体添加了凝固剂琼脂，且比例为添加了凝固剂琼脂，且比例为1.5%1.5%2%2%分离、鉴定、计数分离、鉴定、计数选择选择能分解尿素的微生物能分解尿素的微生物碳源、氮源、无机盐、水碳源、氮源、无机盐、水牛肉膏牛肉膏蛋白胨蛋白胨葡萄糖葡萄糖尿素尿素讨论：资料一：通过资料一：通过1g土壤中有几亿到几百亿个土壤微生物，其中，细菌的数量最多，能分解尿素的细土壤中有几亿到几百亿个土壤微生物，其中，细菌的数量最多，能分解尿素的细菌只是其中的一部分。菌只是其中的一部分。资料二：当菌液稀释倍数足够高时，培养基表面生长的一个单菌落来源于一个活菌（如图资料二
10、：当菌液稀释倍数足够高时，培养基表面生长的一个单菌落来源于一个活菌（如图2所示）。所示）。资料三：用平板划线法接种培养的结果（如图资料三：用平板划线法接种培养的结果（如图3所示）。所示）。1.能否直接制备土壤溶液，接种到选择培养基上进行培养？为什么？如不能，需做怎样的处理？能否直接制备土壤溶液，接种到选择培养基上进行培养？为什么？如不能，需做怎样的处理？2.能否利用平板划线法能否利用平板划线法对细菌进行计数？为什么？对细菌进行计数？为什么？思考思考讨论：讨论：图图2图图3不不能。能。因为土壤中细菌的数量庞大，直接制备土壤溶液接种到选择培养基上无法统计数量因为土壤中细菌的数量庞大，直接制备土壤溶
11、液接种到选择培养基上无法统计数量。接种到选择培养基前需要对土壤溶液进行充分稀释接种到选择培养基前需要对土壤溶液进行充分稀释。不不能。能。平板划线法最开始的划线很可能菌平板划线法最开始的划线很可能菌落落会长成一片，导致无法计数，此外会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分菌类。灼烧接种环的时候也会杀死一部分菌类。如果想知道如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌，我们应该如何统计呢土壤中有多少能分解尿素的细菌，我们应该如何统计呢？二、微生物的选择培养二、微生物的选择培养稀释涂布平板法稀释涂布平板法稀释涂布平板法1.原理：将菌液进行一系列的梯度稀释梯度稀释，然后将不同稀释度的
12、菌液分别涂布涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。稀释度足够高时稀释度足够高时，能在培养基表面形成，能在培养基表面形成单个菌落单个菌落。如果想知道如果想知道1g1g土壤中有多少能分解尿素的细菌，还需对土壤菌液进行土壤中有多少能分解尿素的细菌，还需对土壤菌液进行稀释稀释及科学的微生物及科学的微生物数量测定数量测定方法方法-稀释涂布平板法。稀释涂布平板法。6 6支试管，分别加入支试管，分别加入9ml9ml无菌水无菌水1ml1021ml1031ml1041ml1051ml1061ml1072.2.样品梯度稀释：样品梯度稀释：微量微量 移液器移液器稀释稀释10倍倍菌液菌液101土壤土壤土壤土壤10g1
13、0g10g10g 在火焰旁称取土壤在火焰旁称取土壤在火焰旁称取土壤在火焰旁称取土壤10g10g10g10g，加入，加入，加入，加入90909090ml无菌水无菌水中，中，摇匀摇匀，制成稀释，制成稀释10倍的土壤菌液。倍的土壤菌液。分别取分别取1ml1ml上清液，上清液，加入盛有加入盛有加入盛有加入盛有9 9 9 9mlml无菌水无菌水的试管中，制成不同稀释倍数的菌液。的试管中，制成不同稀释倍数的菌液。取取6 6支试管，分别加入支试管，分别加入9ml9ml无菌水。无菌水。灼灼将涂布器在火焰上灼烧，待酒精燃尽后，涂布器冷却后，再进行涂布。涂涂用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿
14、，使涂布均匀。各梯度分别涂布3个平板1个不涂布作空白对照3.3.取样涂布取样涂布平板：平板：滴滴取0.1ml菌液（不超过），滴加到培养基表面 将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中 浸浸放入放入3737恒温箱中培养恒温箱中培养1 12d2d4.4.培养与观察培养与观察稀释稀释10103 3倍倍稀释稀释10104 4倍倍稀释稀释10105 5倍倍空白对照空白对照恒温培养箱恒温培养箱疑问解答平板划线法和稀释涂布平板法有什么不同平板划线法和稀释涂布平板法有什么不同？平板划线法平板划线法稀释涂布平板法稀释涂布平板法纯化原理纯化原理接种工具接种工具用途用途接种效果图接种效果图相同点相同点将菌液进行一系列的梯度稀释
15、，然后将不将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释程度的菌液分别涂布到固体培养基同稀释程度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养得到单菌落的表面，进行培养得到单菌落接种环接种环涂布器涂布器都能分离纯化菌种；都能分离纯化菌种；通过连续划线的操作，将聚通过连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散集的菌种逐步稀释分散，进进行培养得到单菌落行培养得到单菌落分离纯化菌种，获得单菌落分离纯化菌种，获得单菌落分离纯化菌种，获得单菌落分离纯化菌种，获得单菌落；用于计数用于计数都是在固体培养基上进行。都是在固体培养基上进行。三、微生物的数量测定三、微生物的数量测定间接间接/活菌活菌计数法计数法（一）（一）
16、稀释涂布平板法稀释涂布平板法稀释涂布平板法除用于分离微生物外，也常用于统计样品中活菌数。在稀稀释涂布平板法除用于分离微生物外，也常用于统计样品中活菌数。在稀释度足够高时，培养基上表面生长的释度足够高时，培养基上表面生长的一个单菌落来源于样品稀释液中的一一个单菌落来源于样品稀释液中的一个活菌个活菌，通过统计平板上的，通过统计平板上的菌落数菌落数，可推测出样品中大约有多少，可推测出样品中大约有多少活菌活菌。1)原理：2)计数原则：一般选择菌落数一般选择菌落数在在3030030300的平的平板上进行计数。板上进行计数。注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在303
17、0030300的平板的平板上进行上进行计数。计数。为增强实验说服力与准确性，设计实验时，需要为增强实验说服力与准确性，设计实验时，需要涂布至少三个涂布至少三个平板平板作为重复组。作为重复组。（重复实验，减少误差）。统计的菌落往往比活菌的实际数目统计的菌落往往比活菌的实际数目低低。因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数表示。分析实验结果时，要考虑重复组分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近结果是否接近，如果相差太大，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。意味着操作有误，需重新实验。因为当两个或多个细胞连在一起时，繁殖后形成的还是一个菌落实例分析：实例分析：甲同学做此实验在稀释倍数甲同学做此
18、实验在稀释倍数105获得获得3个平板，菌落数个平板，菌落数分别是分别是80、90、100，涂布平板时均使用，涂布平板时均使用0.1ml菌液，菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？每克样品中的菌落数(CV)M其中，其中，C C代表某一稀释度下平板上生长的代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数平均菌落数，V V代表代表涂布平板时所用的稀释液的涂布平板时所用的稀释液的体积体积(ml)(ml)，M M代表代表稀释倍数。稀释倍数。（80+90+10080+90+100）/3/30.10.1 10 105 5=9 10=9 107 7个个3)计算：三、微生物
19、的数量测定三、微生物的数量测定（二）（二）显微镜直接计数显微镜直接计数法法 直接计数法直接计数法1.原理：原理：利用特定的利用特定的细菌计数板细菌计数板或或血细胞计数板血细胞计数板在在显微镜显微镜下观察、计数，然后再计算下观察、计数，然后再计算一一定体积定体积的样品中微生物的数量。的样品中微生物的数量。（统计的是微生物本身的个体数）（统计的是微生物本身的个体数）每毫升原液所含细菌数每小格平均细菌数每毫升原液所含细菌数每小格平均细菌数40010000400100004001000040010000稀释倍稀释倍数数注意：统计结果一般是注意：统计结果一般是注意：统计结果一般是注意：统计结果一般是活菌
20、数和死菌数活菌数和死菌数活菌数和死菌数活菌数和死菌数的总和。（的总和。（的总和。（的总和。（“染色排除法染色排除法染色排除法染色排除法”）2.计数工具：计数工具：显微镜、血细胞显微镜、血细胞/细菌计数板细菌计数板计数池计数池0.1mm每个计数室面积每个计数室面积1mm2，液体高度，液体高度0.1mm，所含液体体，所含液体体积为积为0.1mm3，即即110-4mL（0.1mm3=0.110-3cm3=10-4mL）。中方格中方格血细胞计数板常用于血细胞计数板常用于_ 的计数的计数酵母菌等相对酵母菌等相对较大的细胞较大的细胞细菌计数板可对细菌计数板可对_ _的计数的计数细菌等较小的细胞细菌等较小的
21、细胞计数室计数室1mm大方格大方格小方格小方格血细胞计数板血细胞计数板2.计数工具：计数工具：显微镜、血细胞显微镜、血细胞/细菌计数板细菌计数板计数室计数室16个中方格个中方格25个中方格个中方格25个小方格个小方格16个小方格个小方格1625一个计数室有一个计数室有400个个小方格，每个小方小方格，每个小方格的面积为格的面积为1/400mm2，总体，总体积为积为0.1mm3。2516血细胞计数板血细胞计数板3.结果计算（以血细胞计数板为例）：结果计算（以血细胞计数板为例）：每个中方格平均菌株数每个中方格平均菌株数16/2510-4稀释倍数稀释倍数菌株个数菌株个数/mL=（2）计数规则：）计数
22、规则：（3）计算公式：）计算公式：（1）计数方法：）计数方法：五点五点/四点取样法四点取样法样方内样方线上的上、左两边及左顶角样方内样方线上的上、左两边及左顶角4.结果分析（以血细胞计数板为例）：结果分析（以血细胞计数板为例）：（取多个方格求平均值）（取多个方格求平均值）统计的细菌数目往往比活菌的实际数目多统计的细菌数目往往比活菌的实际数目多原因是原因是统计统计的的结果是活菌数和死菌数的总和结果是活菌数和死菌数的总和疑问解答稀释涂布平板法稀释涂布平板法(间接间接/活菌活菌计数法计数法)和和显微镜直接计数法显微镜直接计数法（直接计数法）（直接计数法）各有哪些优缺点？各有哪些优缺点？项目项目稀释涂
23、布平板法稀释涂布平板法(间接间接/活菌活菌计数法计数法)显微镜直接计数法显微镜直接计数法（直接计数法）（直接计数法）原理原理当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌大约含有多少活菌利用特定的血细胞计数板，在显微镜下计算利用特定的血细胞计数板，在显微镜下计算一定体积的样品中微生物的数量一定体积的样品中微生物的数量主要用具主要用具培养基培养基、涂布器涂布器显微镜、细菌计数板或血细胞计数
24、板显微镜、细菌计数板或血细胞计数板计数依据计数依据培养基上的菌落培养基上的菌落数数菌体本身菌体本身个数个数计算公式计算公式每毫升原液所含细菌数某一稀释度下培养基每毫升原液所含细菌数某一稀释度下培养基上生长的平均菌落数上生长的平均菌落数涂布平板时所用的稀释液涂布平板时所用的稀释液的体积的体积稀释倍数稀释倍数每毫升原液所含细菌数每毫升原液所含细菌数每每中中格平均菌体数格平均菌体数25/16104稀释倍数稀释倍数优点优点缺点缺点计数的是活菌计数的是活菌计数方便、操作简单计数方便、操作简单死菌、活菌都计算在内死菌、活菌都计算在内；操作较复杂操作较复杂。统计结果统计结果有一定误差有一定误差：统计的菌落数
25、往往比统计的菌落数往往比活菌的实际数目活菌的实际数目少；少；统计结果统计结果有一定误差有一定误差：统计的数统计的数目目往往往往比活菌的实际数目比活菌的实际数目多。多。探究-实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数尿素的立体结构提出问题提出问题1.1.1.1.从土壤中分离出从土壤中分离出从土壤中分离出从土壤中分离出能够分解尿素的细菌能够分解尿素的细菌能够分解尿素的细菌能够分解尿素的细菌 2.2.2.2.统计统计统计统计每克土壤每克土壤每克土壤每克土壤样品中究竟含有样品中究竟含有样品中究竟含有样品中究竟含有多少这样的细菌多少这样的细菌多少这样的细菌多少这样的细菌研究思路研究思路土壤取样制备培养基样品
26、稀释与取样涂布微生物的培养与观察绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。基础知识基础知识1.1.制备培养基：制备培养基：（1 1）选择培养基：）选择培养基：以尿素作为唯一氮源以尿素作为唯一氮源（2 2）牛肉膏蛋白胨培养基）牛肉膏蛋白胨培养基组分组分含量含量牛肉膏牛肉膏5.0g5.0g蛋白胨蛋白胨10.0g10.0gNaClNaCl5.0g5.0g琼脂琼脂20.0g20.0g蒸馏水蒸馏水定容到定容到1000ml1000ml组分组分含量含量KHKH2 2POPO4 41.4g1.4gNaHNaH2
27、2POPO4 42.1g2.1gMgSOMgSO4 47H7H2 2O O0.2g0.2g葡萄糖葡萄糖10.0g10.0g尿素尿素CO(NHCO(NH2 2)2 21.0g1.0g琼脂琼脂15.0g15.0g蒸馏水蒸馏水定容到定容到1000ml1000ml（用来分离分解尿素的细菌）（用来分离分解尿素的细菌）（用来设计（用来设计对照组实验）对照组实验）实验设计实验设计2.2.土壤取样土壤取样：（1 1）取样地点要求：取样地点要求：（2 2）取样取样部位部位：铲去铲去表表层层土土（一般（一般3cm3cm左右）左右）。细菌绝大部分分布在距地表细菌绝大部分分布在距地表3 38cm8cm的土的土壤层壤层
28、。酸碱度接近中性的潮湿且酸碱度接近中性的潮湿且富含尿素富含尿素的土壤的土壤。在城市，常见的是公园里、街道旁、花盆中的土壤；在农村，则容易收集到农在城市，常见的是公园里、街道旁、花盆中的土壤；在农村，则容易收集到农田或菜园里的土壤。田或菜园里的土壤。思考与讨论：思考与讨论：（1 1）分离土壤中不同的微生物采用稀释范围相同吗？测定）分离土壤中不同的微生物采用稀释范围相同吗？测定土壤中细菌的总量稀释度高还是测定能分解尿素的细菌的土壤中细菌的总量稀释度高还是测定能分解尿素的细菌的数量稀释度高？数量稀释度高？（2 2）在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才）在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，
29、怎样做才能保证从中选择出菌落数在能保证从中选择出菌落数在3030300300的平板进行计数？如何的平板进行计数？如何证明已稀释成功证明已稀释成功？（3 3）每个稀释度至少涂几个平板？）每个稀释度至少涂几个平板？不同微生物在土壤中不同微生物在土壤中含量不同含量不同，分离不同的微生物采用，分离不同的微生物采用不同的稀释度，不同的稀释度，以保证获得菌落数在以保证获得菌落数在3030300300之间适于计数的平板。之间适于计数的平板。测定土壤中细菌的总量稀释度测定土壤中细菌的总量稀释度更高更高，因为细菌总数量高于，因为细菌总数量高于能分解尿素能分解尿素的细菌数量。的细菌数量。（1 1）测细菌数：一般用
30、）测细菌数：一般用10104 4、10105 5、10106 6稀释液稀释液（2 2）测放线菌数：一般用）测放线菌数：一般用10103 3、10104 4、10105 5稀释液稀释液（3 3）测真菌数：一般用）测真菌数：一般用10102 2、10103 3、10104 4稀释液稀释液3.3.样品的稀释与涂布平板样品的稀释与涂布平板思考与讨论：思考与讨论：（1 1）分离土壤中不同的微生物采用稀释范围相同吗？测定）分离土壤中不同的微生物采用稀释范围相同吗？测定土壤中细菌的总量稀释度高还是测定能分解尿素的细菌的土壤中细菌的总量稀释度高还是测定能分解尿素的细菌的数量稀释度高？数量稀释度高？思考与讨论：
31、思考与讨论：（2 2）在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才）在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选能保证从中选择出菌落数在择出菌落数在3030300300的平板进行计数？如何的平板进行计数？如何证明已稀释成功呢？证明已稀释成功呢？在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，应应选择一个选择一个比较宽比较宽的范围，的范围，例如可以例如可以将将1101103 31101107 7倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在证能从中选择出菌落数在3030300300的平板进行计数的
32、平板进行计数。3.3.样品的稀释与涂布平板样品的稀释与涂布平板如果得到如果得到2 2个或个或2 2个以上菌落数目在个以上菌落数目在30-30030-300的平板，且同一稀释倍数的三的平板，且同一稀释倍数的三个重复平板上菌落数个重复平板上菌落数相差不大，相差不大，可进行菌落计数，若菌落数可进行菌落计数，若菌落数相差太大，相差太大，说明实验误差大，需重新实验。说明实验误差大，需重新实验。如果得到如果得到2 2个或个或2 2个以上个以上菌落数目在菌落数目在30-30030-300的平板，说明稀释操作成功。的平板，说明稀释操作成功。思考与讨论：思考与讨论：3.3.样品的稀释与涂布平板样品的稀释与涂布平
33、板（3 3）每个稀释度至少涂几个平板？）每个稀释度至少涂几个平板？每个稀释度至少设置每个稀释度至少设置4 4个平板：个平板：11、2 2、3 3平板是平板是选择培养基选择培养基44平板为牛肉膏蛋白胨培养基平板为牛肉膏蛋白胨培养基此外，整个实验还要多设置此外，整个实验还要多设置2 2个平板：个平板：（作为对照，用来验证两种培养基中是否被杂菌（作为对照，用来验证两种培养基中是否被杂菌污染）污染）（作为实验组，且设置三个重复，（作为实验组，且设置三个重复，用来分离分解尿素的细菌用来分离分解尿素的细菌）（作为对照组，用来判断选择培养基是否具有选择作用）（作为对照组，用来判断选择培养基是否具有选择作用）
34、不涂布稀释液不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基。的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基。4.4.微生物的培养与观察微生物的培养与观察（1 1）培养条件：）培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度、培养温度、pHpH和培养时间和培养时间。细菌细菌一般在一般在30-3730-37的的温度下培养温度下培养1-2d1-2d。（2 2）观察：）观察：每隔每隔24h24h统计一次菌落数目，选取菌落数目统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定稳定时的记录作为结果。时的记录作为结果。（3 3）一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出）一般来说，在相同的培养条件下，
35、同种微生物表现出稳定的菌落特征稳定的菌落特征，如，如形状、大小、颜色、透形状、大小、颜色、透明度、光泽度和隆起程度明度、光泽度和隆起程度等。等。5.5.菌落计数菌落计数 当菌落当菌落数目稳定数目稳定时，选取菌落数在时，选取菌落数在3030300300的平板进行计数，同一稀释度下至少的平板进行计数，同一稀释度下至少计数计数3 3个平板，求出个平板，求出平均值平均值，并根据所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。，并根据所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。请尝试设计实验结果记录表。请尝试设计实验结果记录表。稀释度稀释度10104 410105 510106 610107 71 12 23 3平均值
36、平均值1 12 23 3平均值平均值1 12 23 3平均值平均值1 12 23 3平均值平均值菌落数菌落数/平板平板实验结果记录表实验结果记录表：操作提示2）无菌操作3）做好标记本实验使用的平板和试管比较多，为避免混淆，使用前要做好标记4）制定计划对于耗时较长的生物实验，要事先规划时间，以便提对于耗时较长的生物实验，要事先规划时间，以便提高工作效率，在操作时更加有条不紊高工作效率，在操作时更加有条不紊1）不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。a.a.取土用的小铁铲的盛土样的信封取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。在使用前都需要灭菌。b.b.应在火焰旁称取土壤。在火
37、焰附近将称好的土样倒入应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入 锥形瓶中，塞好棉塞。锥形瓶中，塞好棉塞。c.c.在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。小结练一练1 1培培养养基基、培培养养皿皿、接接种种环环、实实验验操操作作者者的的双双手手、空空气气、牛牛奶奶所所采采用用的的灭灭菌或消毒方法依次是（菌或消毒方法依次是（）化学消毒法化学消毒法 灼烧灭菌法灼烧灭菌法 干热灭菌法干热灭菌法紫外线消毒法紫外线消毒法 高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法 巴氏消毒法巴氏消毒法A BC D 2下列培养基配方中，能作为选择培养基、鉴别培养基的依次是（下
38、列培养基配方中，能作为选择培养基、鉴别培养基的依次是（）A B C DA原料原料蛋白胨蛋白胨乳糖乳糖蔗糖蔗糖K2HPO4伊红伊红亚甲蓝亚甲蓝琼脂琼脂NaCl蒸馏水蒸馏水10g5g5g2g0.4g0.065g10g-1000mL10g5g5g2g-20g-1000mL10g5g5g2g-20g1000mL10g5g5g2g-1000mLB练一练3 3幽幽门门螺螺杆杆菌菌（HpHp）感感染染是是急急、慢慢性性胃胃炎炎和和消消化化性性溃溃疡疡的的主主要要致致病病因因素素。请回答下列有关问题：请回答下列有关问题：（1 1）图图中中4 4支支试试管管分分别别代代表表4 4种种微微生生物物在在半半固固体体
39、培培养养基基（琼琼脂脂含含量量为为3.5g/L3.5g/L）中中的的生生长长状状态态，其其中中号号试试管管代代表表HpHp的的生生长长状状态态，由由图图判判断断，HpHp在在_条件下不能生长。条件下不能生长。（2 2）下表所示是某种培养基的配方。）下表所示是某种培养基的配方。将将HpHp接接种种到到pHpH适适宜宜的的该该培培养养基基中中，置置于于3737下下培培养养一一段段时时间间后后，该该培培养养基基中中HpHp的数目比刚接种时的数目比刚接种时_，主要原因是，主要原因是_。成分成分葡萄糖葡萄糖KH2PO4MgSO4NaClCaSO4CaCO3琼脂琼脂蒸馏水蒸馏水含量含量10g0.2g0.2
40、g0.2g0.2g5g3.5g定容至定容至1L氧气浓度过高或过低氧气浓度过高或过低少少缺少氮源缺少氮源练一练3 3幽幽门门螺螺杆杆菌菌（HpHp）感感染染是是急急、慢慢性性胃胃炎炎和和消消化化性性溃溃疡疡的的主主要要致致病病因因素素。请回答下列有关问题：请回答下列有关问题：（3 3）研研究究人人在在患患者者体体内内采采集集样样本本并并制制成成菌菌液液后后，进进行行分分离离培培养养。实实验验基基本本步骤如下：步骤如下：配制培养基配制培养基灭菌、倒平板灭菌、倒平板X培养培养观察观察在在配配制制培培养养基基时时，要要加加入入尿尿素素和和酚酚红红指指示示剂剂，这这是是因因为为Hp能能合合成成_，它能以尿素作为氮源；若有，它能以尿素作为氮源；若有Hp，则菌落周围会出现，则菌落周围会出现_色环带。色环带。步步骤骤X表表示示_。在在无无菌菌条条件件下下操操作作时时，先先将将菌菌液液稀稀释释，然然后后将将菌菌液液_到培养基表面上。稀释菌液的目的是获得到培养基表面上。稀释菌液的目的是获得_菌落。菌落。在在培培养养时时，需需将将培培养养皿皿倒倒置置并并放放在在_中中。若若不不倒倒置置培培养养，将将导导致致_。临床上用临床上用14C标记的标记的_分解为分解为NH3和和14CO2。接种接种尿酶尿酶红红单单涂布涂布恒温培养箱恒温培养箱尿素尿素无法形成单菌落或污染无法形成单菌落或污染谢谢观看！谢谢观看！