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1、纸层析法分别氨基酸一、前言纸层析法纸层析法又称纸色谱法，是目前广泛应用的一种分别技术。本世纪初俄国植物学家M.Tswett 觉察并使用这一技术证明白植物的叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素。现在层析法已成为生物化学、分子生物学及其它学科领域有效的分别分析工具之一。它是一种以纸为载体的色谱法。固定相一般为纸纤维上吸附的水分，流淌相为不与水相溶的有机溶剂；也可使纸吸留其他物质作为固定相，如缓冲液，甲酰胺等。将试样点在纸条的一端，然后在密闭的槽中用适宜溶剂进展开放。当组分移动肯定距离后，各组分移动距离不同，最终形成相互分别的斑点。将纸取出，待溶剂挥发后，用显色剂或其他适宜方法确定斑点位置。依据组分移动
2、距离(Rf 值)与样比较，进展定性。用斑点扫描仪或将组分点取下，以溶剂溶出组分，用适宜方法定量(如光度法、比色法等)。纸层析法(paper chromatography)是生物化学上分别、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定;也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗菌素等物质的一种分别分析工具。纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的安排层析法，其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的有 机溶溶剂是流淌相。在环境分析测试中，有时用纸层析法分别试样组分，它用于一些精度不高的分析，如 3，4-苯并芘。但不如GC、HPLC 应用普遍。做叶绿体色素分别时用
3、到,将叶片碾碎，浸出绿色液体，将液体与层析液(石油醚)混合，将滤纸一段进入混合液体，四种色素在层析液中的溶解度不同，在滤纸上留下 4 条色素带。由此观查出各种色素的相对含量和种类。纸层析法一般用于叶绿体中色素的分别，叶绿体中色素主要包括胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b，它们在层析液中的溶解度不同，溶解度大的随层析液在滤纸上集中地快，反之则慢;含量较多者色素带也较宽。最终在滤纸上留下 4 条色素带，所以利用纸层析法能清楚地将叶绿体中的色素分别。氨基酸氨基酸是构成蛋白质的根本单位，广泛用于食品、医药、添加剂及化装品德业。随着生物工程技术产业的进展渐渐成为 2l 世纪全球的主要产业之一，氨基酸的
4、需求量越来越大，品种变更越来越快，工艺改革越来越。目前全世界氨基酸每年的产量为 100 万吨，而需求总量是 800 万吨。我国自 20 世纪 60 年月起，氨基酸的应用在食品工业占 61,，在饮料工业占30,，医药、日用化工、农业、冶金、环保、轻工、生物工程技术等方面占用的比例逐年增加。氨基酸在人类生活的很多方面都有着应用:（1） 在食品德业的应用（2） 在医药工业的应用（3） 在饲料添加剂行业的应用（4） 在化装品德业的应用（5） 在农业上的应用（6） 在其他行业的应用氨基酸工业还有着宽阔的进展前景:（1） 传统的氨基酸生产方法（2） 运用基因工程手段生产氨基酸（3） 大力进展药用中间体,具
5、体为:氨基酸及其衍生物渐渐成为药用中间体非自然氨基酸是合成活性药物的重要原料生产高附加值的非自然氨基酸二、试验目的1. 把握安排层析的原理，学习氨基酸纸层析法的操作技术 (包括点样、平衡、展层、显色、鉴定及定量)。2. 学习未知样品的氨基酸成分(水解、层析及鉴定)分析的方法。三、试验原理1. 纸层析是以滤纸为惰性支持物的安排层析。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流淌相。当有机相流经固定相时，物质在两相间不断安排而得到分别。2. 溶质在滤纸上的移动速度用比移值Rf 值表示：3. Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离4. 在肯定的条件下某种物质的Rf 值
6、是常数。Rf 值的大小与物质的构造、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本试验利用纸层析法分别氨基酸。四、试验试剂和器材试验试剂：1. 氨基酸标准液(1mg/mL)亮氨酸、甘氨酸和脯氨酸标准液。2.80%甲酸3.0.1%茚三酮丙酮溶液4. 氨基酸混合液(每种氨基酸 500mg/mL)5. 正丁醇试验器材：1. 华滤纸2. 培育皿3. 电热鼓风枯燥箱4. 吹风机5. 毛细管6. 针、线、尺。7. 钟罩(高约 430mm,直径约 290mm，具磨口塞)五、操作步骤标准氨基酸纸上层析单向上行层析氨基酸 Rf 值的测定1. 滤纸：选用国产华 1 号滤纸， 6cm7cm。在距滤纸 2cm
7、 处划线，用铅笔在线上标上四个点作为点样位子留出缝线空间。2. 点样：点样要适宜，样品点的太浓，斑点易集中或拉长，以致分别不清；用毛细管吸取氨基酸样品，与滤纸垂直方向轻轻碰触点样处的中心，这时样品就自动流出；点样的集中直径把握在 0.5cm 之内，点样过程中必需在第一滴样品干后再点其次滴，为使样品加速枯燥，可用吹风机吹干，但要留意温度不行过高，以免氨基酸破坏，影响定量结果；将点好样品的滤纸两侧比齐，用线缝好，揉成筒状。留意缝线处纸的两边不要接触。避开由于毛细管现象使溶剂沿两边移动特别快而造成溶剂前沿不齐，影响Rf 值。3. 将揉成圆筒状的滤纸放入培育皿内 (留意滤纸不要碰皿壁)， 当溶剂展层至
8、距离纸的上沿约 1cm 时，取出滤纸，马上用铅笔标出溶剂前沿位置。4. 显色：待展层根本完毕后, 置 65鼓风箱中 10-20min，鼓风保温，滤纸上即显出紫红色/黄色斑点。5. Rf 值的计算：用尺测量显色斑点的中心与原点(点样中心)之间的距离和原点到溶剂前沿的距离，求出此值，即得氨基酸的 Rf 值。计算出 3 种氨基酸在酸系统中的Rf 值，推断待测样组成。酸溶剂系统：正丁醇： 80%甲酸：水=15:3:2(体积比)，茚三酮2ml。温度 25，时间 1h。六、试验结果亮氨酸甘氨酸脯氨酸待测氨基酸原点到层析斑点中2.61心的距离6.052.903.493.746.47原点到溶剂前沿的距离7.2
9、47.247.247.240.840.400.480.36Rf0.520.89推断待测氨基酸亮氨酸甘氨酸脯氨酸甘氨酸脯氨酸亮氨酸理论Rf0.790.300.48七、留意事项1. 点样过程中必需在第一滴样品干后再点其次滴；2. 为使样品加速枯燥，可用吹风机吹干，但要留意温度不行过高， 以免氨基酸破坏，影响定量结果；3. 将揉成圆筒状的滤纸放入培育皿内时，留意滤纸不要碰皿壁；4. 使用的溶剂系统需颖配制，并要摇匀；5. 点样要适宜，样品点的太浓，斑点易集中或拉长，以致分别不清；6. 使用茚三酮显色法，必需在整个层析操作中避开手直接接触层析纸，由于手上经常有少量含氮物质。显色时它也呈现紫色斑点。污染
10、了层析结果，因此操作时应戴橡皮手套或指套。同时也要防止空气中的氨；7. 展层开放时切勿是样品点浸入溶剂中。八、思考题1. 为什么在展层时有时用一种溶剂系统，而有时用两种溶剂系统？答：这是依据 Nernst 在 1891 年提出的安排定律：一种溶质在两种给定的互不相溶的溶剂中安排时，在肯定温度下到达平衡后，溶质在两相中的浓度比为一常数，即安排系数(Kd)。Kd=Ca/Cb Ca 和Cb 是互不相溶的两相，即A 相和B 相的浓度。这里的两相可以使固相、液相和气相。意思就是溶质在 A 和B 两种溶剂组成的混合溶剂里安排时，安排比是恒定的。2. 酸性溶剂系统(或碱性溶剂系统)对氨基酸极性基团的解离有何
11、影响?答：酸性溶液中，有利于氨基酸的碱式电离，氨基结合质子，整个分子带正电荷；反之，碱性溶液中有利于羧基的酸式电离，氨基酸分子整体带负电荷。3. 酸性溶剂系统(或碱性溶剂系统)对碱性氨基酸(赖、精、组) 和酸性氨基酸(天冬、谷)的 Rf 值有什么影响?答：酸性溶剂系统对碱性氨基酸的溶解性加强，在层析过程中易溶于 流淌相。所以跑得比较快，因此 Rf 值增大。反之，碱性性溶剂系统中酸性氨基酸 Rf 值增大。4. 什么是安排系数？答：安排系数是指肯定温度下，处于平衡状态时，组分在固定相中的浓度和在流淌相中的浓度之比，以K 表示。九、争辩经过本次利用纸层析法分别氨基酸试验，使我较为娴熟的把握了利用纸层
12、析法分别氨基酸的具体流程及方法，并且了解了其工作原 理，这对于以后的学习是有很大帮助的。经查阅资料得，亮氨酸的理论Rf 值为 0.79酸相，脯氨酸的理论Rf 值为 0.48酸相，甘氨酸的理论Rf 值为 0.30酸相。通过比对滤纸上单一氨基酸层析位置、计算出其试验Rf 值并查阅资料得知，滤纸上待测氨基酸的种类及具体位置，较为粗略地分别了亮氨酸、脯氨酸及甘氨酸这三种氨基酸。总体来讲，本次试验三种氨基酸试验Rf 值偏小，。经过分析后， 得出几点影响试验结果的因素，如下：1. 点样过程中未在第一滴样品干后再点其次滴；2. 虽用玻璃罩将滤纸罩住，但还是会有些许空气中的氨在其中， 影响试验结果；3. 将揉成圆筒状的滤纸放入培育皿内时，滤纸不留神触遇到皿壁，消灭虹吸现象；4. 使用颖配制的溶剂系统时，并未完全摇匀；5. 使用茚三酮显色法，必需在整个层析操作中避开手直接接触层析纸，由于手上经常有少量含氮物质。显色时它也呈现紫色斑点。污染了层析结果，因此操作时应戴橡皮手套或指套，但试验操作过程中， 并未戴橡皮手套或指套，在制作滤纸筒时手不留神触遇到滤纸内侧 面，导致手上的物质沾染到滤纸内侧，影响了试验结果；综上所述，本次试验的误差主要是由于操作误差导致，因此在以后的学习试验过程中，会更加着重留意试验前对试验器材完好程度的检查以及试验操作的标准性，严格要求自己，努力做到更好！