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1、纸层析法分离氨基酸纸层析法分离氨基酸一、前言一、前言纸层析法纸层析法纸层析法又称纸色谱法,是目前广泛应用的一种分离技术。本世纪初俄国植物学家 M.Tswett 发现并使用这一技术证明了植物的叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素。 现在层析法已成为生物化学、 分子生物学及其它学科领域有效的分离分析工具之一。 它是一种以纸为载体的色谱法。固定相一般为纸纤维上吸附的水分,流动相为不与水相溶的有机溶剂； 也可使纸吸留其他物质作为固定相,如缓冲液,甲酰胺等。 将试样点在纸条的一端,然后在密闭的槽中用适宜溶剂进行展开。当组分移动一定距离后,各组分移动距离不同,最后形成互相分离的斑点。 将纸取出,待溶剂挥发后,
2、用显色剂或其他适宜方法确定斑点位置。根据组分移动距离与已知样比较,进行定性。用斑点扫描仪或将组分点取下,以溶剂溶出组分,用适宜方法定量。纸层析法是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术,可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定;也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗菌素等物质的一种分离分析工具。 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法,其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相,展层用的有机溶溶剂是流动相。在环境分析测试中,有时用纸层析法分离试样组分,它用于一些1 / 9精度不高的分析,如 3,4-苯并芘。但不如 GC、HPLC 应用普遍。做叶绿体色素分离时用到,将叶片碾碎
3、,浸出绿色液体,将液体与层析液混合,将滤纸一段进入混合液体,四种色素在层析液中的溶解度不同,在滤纸上留下 4 条色素带。由此观查出各种色素的相对含量和种类。纸层析法一般用于叶绿体中色素的分离,叶绿体中色素主要包括胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b,它们在层析液中的溶解度不同,溶解度大的随层析液在滤纸上扩散地快,反之则慢;含量较多者色素带也较宽。最后在滤纸上留下 4 条色素带,所以利用纸层析法能清楚地将叶绿体中的色素分离。氨基酸氨基酸氨基酸是构成蛋白质的基本单位,广泛用于食品、医药、添加剂及化妆品行业。随着生物工程技术产业的发展逐渐成为2l 世纪全球的主要产业之一,氨基酸的需求量越来越大,品种
4、变更越来越快,工艺改革越来越新。目前全世界氨基酸每年的产量为100 万吨,而需求总量是 800 万吨。我国自 20 世纪 60 年代起,氨基酸的应用在食品工业占 61,在饮料工业占 30,医药、日用化工、农业、冶金、环保、轻工、生物工程技术等方面占用的比例逐年增加。氨基酸在人类生活的很多方面都有着应用:1 在食品行业的应用2 在医药工业的应用3 在饲料添加剂行业的应用2 / 94 在化妆品行业的应用5 在农业上的应用6 在其他行业的应用氨基酸工业还有着广阔的发展前景:1 传统的氨基酸生产方法2 运用基因工程手段生产氨基酸3 大力发展药用中间体,具体为:氨基酸及其衍生物逐渐成为药用中间体非天然氨
5、基酸是合成活性药物的重要原料生产高附加值的非天然氨基酸二、实验目的二、实验目的1.掌握分配层析的原理,学习氨基酸纸层析法的操作技术 。2.学习未知样品的氨基酸成分分析的方法。三、实验原理三、实验原理1.纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。 滤纸纤维上的羟基具有亲水性,吸附一层水作为固定相,有机溶剂为流动相。 当有机相流经固定相时,物质在两相间不断分配而得到分离。2.溶质在滤纸上的移动速度用比移值 Rf 值表示：3.Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离4.在一定的条件下某种物质的 Rf 值是常数。Rf 值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。3
6、 / 9本实验利用纸层析法分离氨基酸。四、实验试剂和器材四、实验试剂和器材实验试剂：实验试剂： 1.氨基酸标准液亮氨酸、甘氨酸和脯氨酸标准液。 2.80%甲酸 3.0.1%茚三酮丙酮溶液 4.氨基酸混合液 5.正丁醇实验器材：实验器材： 1.新华滤纸 2.培养皿 3.电热鼓风干燥箱 4.吹风机 5.毛细管 6.针、线、尺。 7.钟罩五、操作步骤五、操作步骤标准氨基酸纸上层析标准氨基酸纸上层析单向上行层析单向上行层析氨基酸氨基酸 RfRf 值的测定值的测定1.滤纸：选用国产新华 1 号滤纸, 6cm7cm。在距滤纸 2cm 处划4 / 9线,用铅笔在线上标上四个点作为点样位子留出缝线空间。2.点
7、样：点样要合适,样品点的太浓,斑点易扩散或拉长,以致分离不清；用毛细管吸取氨基酸样品,与滤纸垂直方向轻轻碰触点样处的中心,这时样品就自动流出；点样的扩散直径控制在 0.5cm 之内,点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴,为使样品加速干燥,可用吹风机吹干,但要注意温度不可过高,以免氨基酸破坏,影响定量结果；将点好样品的滤纸两侧比齐,用线缝好,揉成筒状。 注意缝线处纸的两边不要接触。 避免由于毛细管现象使溶剂沿两边移动特别快而造成溶剂前沿不齐,影响 Rf 值。3.将揉成圆筒状的滤纸放入培养皿内 ,当溶剂展层至距离纸的上沿约 1cm 时,取出滤纸,立即用铅笔标出溶剂前沿位置。4.显色： 待展层基
8、本结束后, 置 65鼓风箱中 10-20min,鼓风保温,滤纸上即显出紫红色/黄色斑点。5.Rf 值的计算：用尺测量显色斑点的中心与原点之间的距离和原点到溶剂前沿的距离,求出此值,即得氨基酸的 Rf 值。计算出 3 种氨基酸在酸系统中的 Rf 值,判断待测样组成。酸溶剂系统：正丁醇： 80%甲酸：水=15:3:2,茚三酮2ml。温度 25,时间 1h。5 / 9六、实验结果六、实验结果原点到层析斑点中心的距离亮氨酸6.05甘氨酸2.90脯氨酸3.49待测氨基酸2.613.746.47原点到溶剂前沿的距离Rf0.840.400.480.360.520.89判断待测氨基酸亮氨酸甘氨酸脯氨酸甘氨酸脯
9、氨酸亮氨酸理论 Rf0.790.300.487.247.247.247.24七、注意事项七、注意事项1.点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴；2.为使样品加速干燥,可用吹风机吹干,但要注意温度不可过高,以免氨基酸破坏,影响定量结果；3.将揉成圆筒状的滤纸放入培养皿内时,注意滤纸不要碰皿壁；4.使用的溶剂系统需新鲜配制,并要摇匀；5.点样要合适,样品点的太浓,斑点易扩散或拉长,以致分离不清；6 / 96.使用茚三酮显色法,必须在整个层析操作中避免手直接接触层析纸,因为手上常常有少量含氮物质。显色时它也呈现紫色斑点。污染了层析结果,因此操作时应戴橡皮手套或指套。同时也要防止空气中的氨；7.展层
10、展开时切勿是样品点浸入溶剂中。八、思考题八、思考题1.1.为什么在展层时有时用一种溶剂系统为什么在展层时有时用一种溶剂系统, ,而有时用两种溶剂系而有时用两种溶剂系统？统？答：这是根据 Nernst 在 1891 年提出的分配定律：一种溶质在两种给定的互不相溶的溶剂中分配时,在一定温度下达到平衡后,溶质在两相中的浓度比为一常数,即分配系数。Kd=Ca/Cb Ca和 Cb 是互不相溶的两相,即 A 相和 B 相的浓度。这里的两相可以使固相、液相和气相。 意思就是溶质在A和B两种溶剂组成的混合溶剂里分配时,分配比是恒定的。2.2.酸性溶剂系统酸性溶剂系统 对氨基酸极性基团的解离有对氨基酸极性基团的
11、解离有何影响何影响? ?答：酸性溶液中,有利于氨基酸的碱式电离,氨基结合质子,整个分子带正电荷； 反之,碱性溶液中有利于羧基的酸式电离,氨基酸分子整体带负电荷。3.3.酸性溶剂系统酸性溶剂系统 对碱性氨基酸对碱性氨基酸 和酸性氨基酸和酸性氨基酸 的的 RfRf 值有什么影响值有什么影响? ?答：酸性溶剂系统对碱性氨基酸的溶解性加强,在层析过程中易7 / 9溶于 流动相。所以跑得比较快,因此 Rf 值增大。反之,碱性性溶剂系统中酸性氨基酸 Rf 值增大。4.4.什么是分配系数？什么是分配系数？答： 分配系数是指一定温度下,处于平衡状态时,组分在固定相中的浓度和在流动相中的浓度之比,以 K 表示。
12、九、讨论九、讨论经过本次利用纸层析法分离氨基酸实验,使我较为熟练的掌握了利用纸层析法分离氨基酸的具体流程及方法,并且了解了其工作原理,这对于以后的学习是有很大帮助的。经查阅资料得,亮氨酸的理论 Rf值为 0.79酸相,脯氨酸的理论 Rf 值为 0.48酸相,甘氨酸的理论Rf 值为 0.30酸相。通过比对滤纸上单一氨基酸层析位置、计算出其实验Rf 值并查阅资料得知,滤纸上待测氨基酸的种类及具体位置,较为粗略地分离了亮氨酸、脯氨酸及甘氨酸这三种氨基酸。总体来讲,本次试验三种氨基酸实验 Rf 值偏小,。经过分析后,得出几点影响实验结果的因素,如下：1.点样过程中未在第一滴样品干后再点第二滴；2.虽用
13、玻璃罩将滤纸罩住,但还是会有些许空气中的氨在其中,影响实验结果；3.将揉成圆筒状的滤纸放入培养皿内时,滤纸不小心触碰到皿壁,出现虹吸现象；4.使用新鲜配制的溶剂系统时,并未完全摇匀；8 / 95.使用茚三酮显色法,必须在整个层析操作中避免手直接接触层析纸,因为手上常常有少量含氮物质。显色时它也呈现紫色斑点。污染了层析结果,因此操作时应戴橡皮手套或指套,但实验操作过程中,并未戴橡皮手套或指套,在制作滤纸筒时手不小心触碰到滤纸内侧面,导致手上的物质沾染到滤纸内侧,影响了实验结果；综上所述,本次实验的误差主要是由于操作误差导致,因此在以后的学习实验过程中,会更加着重注意实验前对实验器材完好程度的检查以及实验操作的规范性,严格要求自己,努力做到更好！9 / 9