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1、细胞培养的一点经验第1页，共38页，编辑于2022年，星期一消消 化化 传传 代代 第2页，共38页，编辑于2022年，星期一 将培养液倒干净，加入将培养液倒干净，加入PBS轻轻冲洗轻轻冲洗以去除剩余培养液，然后加入胰酶，放以去除剩余培养液，然后加入胰酶，放置置1至至2min，倒掉胰酶，放入，倒掉胰酶，放入37，仅，仅靠剩余胰酶消化。如果消化有困难，可靠剩余胰酶消化。如果消化有困难，可以加入以加入EDTA与胰酶协同作用。与胰酶协同作用。第3页，共38页，编辑于2022年，星期一 传代时，尽量避免吹打细胞，传代时，尽量避免吹打细胞，如果必须要吹打，动作要轻柔不要如果必须要吹打，动作要轻柔不要用力
2、过猛并避免用力过猛并避免气泡气泡出现，这些都出现，这些都对细胞有损伤。对细胞有损伤。第4页，共38页，编辑于2022年，星期一 气泡对细胞的损伤表现在气泡对细胞的损伤表现在多个方面。多个方面。第5页，共38页，编辑于2022年，星期一 a.泡破裂的瞬间，与泡相连的细胞会泡破裂的瞬间，与泡相连的细胞会受到相对较高的张力，这种张力的强受到相对较高的张力，这种张力的强度足以导致细胞膜的破裂；度足以导致细胞膜的破裂；第6页，共38页，编辑于2022年，星期一 b.当泡沫移动时，会对附着在上面的当泡沫移动时，会对附着在上面的细胞产生牵引力，泡沫以不同的速度细胞产生牵引力，泡沫以不同的速度或向不同的方向移
3、动所产生的剪切力或向不同的方向移动所产生的剪切力也会导致细胞的损伤。也会导致细胞的损伤。第7页，共38页，编辑于2022年，星期一 c.此外，气泡还可以导致与之接触此外，气泡还可以导致与之接触的细胞与培养液的接触面积减少而的细胞与培养液的接触面积减少而营养不足。营养不足。第8页，共38页，编辑于2022年，星期一冻冻 存存 与与 复复 苏苏 第9页，共38页，编辑于2022年，星期一 选择生长状态良好，处于对数生长选择生长状态良好，处于对数生长期的细胞冻存；期的细胞冻存；防冻剂可使用防冻剂可使用510的的DMSO或或1015的甘油；的甘油；第10页，共38页，编辑于2022年，星期一 冻存液中
4、加入高浓度血清可以提冻存液中加入高浓度血清可以提高细胞的存活率，可加至高细胞的存活率，可加至50100，即可以使用纯血清加防冻剂作，即可以使用纯血清加防冻剂作为冻存液。用无血清培养基培养的为冻存液。用无血清培养基培养的细胞，在复苏时可以离心以去除血细胞，在复苏时可以离心以去除血清。清。第11页，共38页，编辑于2022年，星期一 冻存速率不得大于冻存速率不得大于10 min，最好，最好为为1 min：a.使用冻存盒；使用冻存盒；b.4，30min；20，1h；80，过夜；，过夜；第12页，共38页，编辑于2022年，星期一 c.将冻存管用棉花、纱布和塑料泡沫严将冻存管用棉花、纱布和塑料泡沫严密
5、包裹以达到良好隔温效果，可以直接密包裹以达到良好隔温效果，可以直接放入放入 80 过夜；过夜；d.之后，细胞应尽快转入液氮。之后，细胞应尽快转入液氮。第13页，共38页，编辑于2022年，星期一 复苏时应迅速复温，缓慢复苏时应迅速复温，缓慢稀释，并保证较高的细胞密度。稀释，并保证较高的细胞密度。第14页，共38页，编辑于2022年，星期一 稀释细胞时应缓慢加入培养液，稀释细胞时应缓慢加入培养液，加入加入10ml 培养液的时间应不小于培养液的时间应不小于2分分钟。开始时应逐滴缓慢加入，稍后可钟。开始时应逐滴缓慢加入，稍后可逐渐加快。如果稀释速度过快，可因逐渐加快。如果稀释速度过快，可因为渗透压的
6、改变导致细胞存活率至少为渗透压的改变导致细胞存活率至少下降下降50。第15页，共38页，编辑于2022年，星期一 DMSO可以轻易透过各种合成的及可以轻易透过各种合成的及天然的膜，包括橡胶和皮肤，可以将任天然的膜，包括橡胶和皮肤，可以将任何与之结合的物质携带透过皮肤（即使何与之结合的物质携带透过皮肤（即使戴着橡胶手套）。因此处理戴着橡胶手套）。因此处理DMSO时应时应小心并尽量避免与有毒物质同时操作。小心并尽量避免与有毒物质同时操作。第16页，共38页，编辑于2022年，星期一 复苏时应严格操作，避免污染：复苏时应严格操作，避免污染：由于复苏时与有菌环境接触较由于复苏时与有菌环境接触较多，如果
7、操作不慎，污染的机会极多，如果操作不慎，污染的机会极大。因此在复温之后，应将冻存管大。因此在复温之后，应将冻存管浸泡在浸泡在70酒精中至少酒精中至少30s1min，在超净台内吹干后按复苏常规步，在超净台内吹干后按复苏常规步骤处理。骤处理。第17页，共38页，编辑于2022年，星期一细细 胞胞 的的 运运 输输 第18页，共38页，编辑于2022年，星期一 冻存运输冻存运输 使用干冰置于塑料泡沫盒中，处理得当，使用干冰置于塑料泡沫盒中，处理得当，可以保存可以保存3天。一旦出现融解，细胞活力将急天。一旦出现融解，细胞活力将急剧下降。剧下降。将细胞冻存管严密包裹，所用塑料泡沫盒将细胞冻存管严密包裹，
8、所用塑料泡沫盒应该不小于应该不小于300 300 300mm，壁的厚度约为，壁的厚度约为50mm，内部空间为，内部空间为200 200 200mm，这样，这样大的空间需放入大的空间需放入5kg干冰。干冰。第19页，共38页，编辑于2022年，星期一 以最快的速度将细胞从液氮转入干冰中，否以最快的速度将细胞从液氮转入干冰中，否则细胞将以则细胞将以1020 min的速度升温。的速度升温。绝对不能让温度高于绝对不能让温度高于50。到达目的地后，即可按常规复苏处理。到达目的地后，即可按常规复苏处理。第20页，共38页，编辑于2022年，星期一 活细胞运输活细胞运输 细胞应该处于对数生长期早期或中期，状
9、态良好。如果细胞应该处于对数生长期早期或中期，状态良好。如果细胞密度过大，培养液会消耗过快，细胞也易于脱落。细胞密度过大，培养液会消耗过快，细胞也易于脱落。培培养液应该加满，拧紧瓶盖，这样液体的晃动幅度就不会太养液应该加满，拧紧瓶盖，这样液体的晃动幅度就不会太大。严密封紧瓶盖边缘，用防震材料包裹培养瓶。即可运大。严密封紧瓶盖边缘，用防震材料包裹培养瓶。即可运输。输。运输标签上应注明运输标签上应注明“易碎品易碎品”、“切勿冷冻切勿冷冻”等字样。等字样。第21页，共38页，编辑于2022年，星期一 到达目的地后，可将大部分培养液倒掉，余到达目的地后，可将大部分培养液倒掉，余留正常量的培养液继续培养
10、。待细胞生长至可以留正常量的培养液继续培养。待细胞生长至可以传代时，换新的培养液。传代时，换新的培养液。一般不要立刻更换新培养液，以免细胞不一般不要立刻更换新培养液，以免细胞不适应。适应。第22页，共38页，编辑于2022年，星期一污污 染染 与与 防防 治治 第23页，共38页，编辑于2022年，星期一 对于一个刚刚接触细胞培养的人，其所面临的对于一个刚刚接触细胞培养的人，其所面临的最大难题之一就是防止污染。最大难题之一就是防止污染。而即使是经验丰富的研究人员，有时也难以避免污而即使是经验丰富的研究人员，有时也难以避免污染。染。第24页，共38页，编辑于2022年，星期一 操作技术方面：操作
11、技术方面：a.工作界面和设备不洁经常清洗工作区域并消毒。工作界面和设备不洁经常清洗工作区域并消毒。b.培养液溢出到瓶口或超净台经常用培养液溢出到瓶口或超净台经常用75酒精擦拭超净台；酒精擦拭超净台；转移液体最好使用一定的移液设备（注射器，吸管等）转移液体最好使用一定的移液设备（注射器，吸管等）；及时擦拭溢出物。；及时擦拭溢出物。c.拿吸管时位置过低，接触瓶口或瓶塞内部正确握持吸拿吸管时位置过低，接触瓶口或瓶塞内部正确握持吸管，不要在敞开的器皿上方操作。管，不要在敞开的器皿上方操作。d.拿取物品的操作不规范应注意拿取注射器、吸管、培拿取物品的操作不规范应注意拿取注射器、吸管、培养瓶、皿等的规范操
12、作。养瓶、皿等的规范操作。所有无菌物品的操作都应处于视野所有无菌物品的操作都应处于视野之内，以避免无意识的污染。之内，以避免无意识的污染。第25页，共38页，编辑于2022年，星期一 d.向污物缸内倾倒液体时位置不正确（过低）向污物缸内倾倒液体时位置不正确（过低）保持一定保持一定高度高度；在污物缸上加一个漏斗；使用负压抽吸装置。；在污物缸上加一个漏斗；使用负压抽吸装置。第26页，共38页，编辑于2022年，星期一 e.皮肤的分泌物或附着物掉落到培养器皿中戴橡胶手套；皮肤的分泌物或附着物掉落到培养器皿中戴橡胶手套；不要在敞开的器皿上方操作。不要在敞开的器皿上方操作。为避免在敞开的器皿上方操作，应
13、注意以下方面：为避免在敞开的器皿上方操作，应注意以下方面：1.培养无菌意识，及时将培养瓶盖、离心管盖拧好，将培养培养无菌意识，及时将培养瓶盖、离心管盖拧好，将培养皿皿 盖好；盖好；2.合理摆放超净台内的物品，避免不必要的操作经过敞合理摆放超净台内的物品，避免不必要的操作经过敞开的器皿上方。建议：不要一次性把过多的物品拿入超开的器皿上方。建议：不要一次性把过多的物品拿入超净台；台内物品以操作者为中心成弧形摆放，酒精灯放净台；台内物品以操作者为中心成弧形摆放，酒精灯放在与操作者正对的位置，左手使用的物品放在左边，右在与操作者正对的位置，左手使用的物品放在左边，右手使用的物品放在右边；哪只手向污物缸
14、内倒液体，就手使用的物品放在右边；哪只手向污物缸内倒液体，就将污物缸放在哪边。将污物缸放在哪边。第27页，共38页，编辑于2022年，星期一 f.工作台内的灰尘和溢出的液体在工作前，工作台内的灰尘和溢出的液体在工作前，工作后都要用工作后都要用70酒精擦拭台面，工作中溢酒精擦拭台面，工作中溢出的液体要立刻用出的液体要立刻用70酒精擦拭干净。酒精擦拭干净。第28页，共38页，编辑于2022年，星期一 总之，规范的操作和良好的习惯可以最总之，规范的操作和良好的习惯可以最大限度的避免污染，也是细胞培养最基本的大限度的避免污染，也是细胞培养最基本的技术要求。要经常注意向有经验的细胞培养技术要求。要经常注
15、意向有经验的细胞培养人员学习良好的操作习惯。人员学习良好的操作习惯。第29页，共38页，编辑于2022年，星期一 培养用耗材培养用耗材培养用液培养用液a.未灭菌的试剂高压或过滤除菌。未灭菌的试剂高压或过滤除菌。b.物品储放区不洁经常清洁并作灭菌处理。物品储放区不洁经常清洁并作灭菌处理。c.消毒过程不标准检查高压灭菌器是否工作消毒过程不标准检查高压灭菌器是否工作正常；过滤后检查滤膜是否破裂；灭菌后的正常；过滤后检查滤膜是否破裂；灭菌后的液体仍需做无菌试验。液体仍需做无菌试验。d.一次性无菌用品不合格进行质量检测或更换一次性无菌用品不合格进行质量检测或更换供应商。供应商。第30页，共38页，编辑于
16、2022年，星期一 取材：取材：原代组织来源有污染不要把动物带入原代组织来源有污染不要把动物带入培养室处理；可能有污染的组织应在酒培养室处理；可能有污染的组织应在酒精中浸泡精中浸泡30s1min，在清洗用的，在清洗用的PBS中加入抗生素。中加入抗生素。第31页，共38页，编辑于2022年，星期一 玻璃器皿玻璃器皿a.储存时灰尘或细菌孢子进入消毒后的器皿应严密包裹，储存时灰尘或细菌孢子进入消毒后的器皿应严密包裹，置于无菌物品专用放置区；未包裹物品放置不得超过置于无菌物品专用放置区；未包裹物品放置不得超过24小时。小时。b.高压灭菌不彻底（一次放入物品过多或放置不正确，瓶高压灭菌不彻底（一次放入物
17、品过多或放置不正确，瓶盖拧得过紧等）正确摆放高压锅内的物品，保持瓶盖拧得过紧等）正确摆放高压锅内的物品，保持瓶盖微松。盖微松。第32页，共38页，编辑于2022年，星期一 培养瓶及培养用液瓶培养瓶及培养用液瓶 灰尘或细菌孢子细胞拿出超净台时应拧紧瓶盖；任何灰尘或细菌孢子细胞拿出超净台时应拧紧瓶盖；任何物品在进入超净台前都要用酒精擦拭；怀疑污染者应作无物品在进入超净台前都要用酒精擦拭；怀疑污染者应作无菌试验，一旦证实，应重新消毒或丢弃。菌试验，一旦证实，应重新消毒或丢弃。第33页，共38页，编辑于2022年，星期一 设备和工作环境设备和工作环境 空气空气 空气的涡流，灰尘和气液混和物等经常打扫、
18、空气的涡流，灰尘和气液混和物等经常打扫、消毒，尽量减少工作区内的活动，与培养无关的工消毒，尽量减少工作区内的活动，与培养无关的工作不要在培养室内进行。作不要在培养室内进行。第34页，共38页，编辑于2022年，星期一 超净台超净台a.滤网破裂经常检查滤膜是否有破裂。滤网破裂经常检查滤膜是否有破裂。b.滤网需要更换检查透过滤网的风力是否正常。滤网需要更换检查透过滤网的风力是否正常。c.溢出的液体进入工作台下层或缝隙中经常全面清洗溢出的液体进入工作台下层或缝隙中经常全面清洗消毒工作台，让酒精进入缝隙。消毒工作台，让酒精进入缝隙。第35页，共38页，编辑于2022年，星期一 CO2孵箱孵箱a.霉菌和
19、细菌的生长用清洁剂清洗并用霉菌和细菌的生长用清洁剂清洗并用75酒精酒精消毒；培养瓶在放入孵箱前应用酒精擦拭。消毒；培养瓶在放入孵箱前应用酒精擦拭。b.开关孵箱时空气流动带起的细菌孢子开孵开关孵箱时空气流动带起的细菌孢子开孵箱前要用酒精喷手；在孵箱的水盒中加入杀菌箱前要用酒精喷手；在孵箱的水盒中加入杀菌剂。剂。第36页，共38页，编辑于2022年，星期一 昆虫严密包裹各种消毒物品；尽量不使用木昆虫严密包裹各种消毒物品；尽量不使用木制器具，如果使用了木制器具，应堵塞其上的缝制器具，如果使用了木制器具，应堵塞其上的缝隙并经常用杀虫剂清洗；不要将实验动物带入培隙并经常用杀虫剂清洗；不要将实验动物带入培养室。养室。第37页，共38页，编辑于2022年，星期一谢谢 谢谢!第38页，共38页，编辑于2022年，星期一