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1、免疫组化实验课第1页，此课件共48页哦实验实验一一 实验动实验动物取物取样样、固定与保存（、固定与保存（4学学时时）实验室规章制度及实验室安全讲解实验室规章制度及实验室安全讲解学生分组学生分组分小组配置相关溶液：操作分小组配置相关溶液：操作动物的致死法及取材动物的致死法及取材:操作操作 细胞标本的制备：操作细胞标本的制备：操作尸体解剖的取材：讲解尸体解剖的取材：讲解活检标本的取材：讲解活检标本的取材：讲解组织样品的固定：操作组织样品的固定：操作第2页，此课件共48页哦实验室规章制度及实验室安全实验室规章制度及实验室安全 熟悉你所使用的化学物质的特性和潜在危害。熟悉你所使用的化学物质的特性和潜在
2、危害。检查设备的性能，充分考虑到使用设备的局限性。检查设备的性能，充分考虑到使用设备的局限性。工作中碰到疑问，及时请教技术负责人以及有丰富知识的专业人员，不得盲目操作。工作中碰到疑问，及时请教技术负责人以及有丰富知识的专业人员，不得盲目操作。不得在实验室储藏食品、吃食品、抽烟、使用化妆品以及清洗隐形眼镜。不得将家属、小孩、亲友带进化不得在实验室储藏食品、吃食品、抽烟、使用化妆品以及清洗隐形眼镜。不得将家属、小孩、亲友带进化学实验室。学实验室。必须戴防护镜，穿工作服，包括不露脚趾的满口鞋，长发必须束起。必须戴防护镜，穿工作服，包括不露脚趾的满口鞋，长发必须束起。熟悉在紧急情况下的逃离路线和紧急疏
3、散方法；清楚灭火器材、安全淋浴间、眼睛冲洗器的位置、急救电话。熟悉在紧急情况下的逃离路线和紧急疏散方法；清楚灭火器材、安全淋浴间、眼睛冲洗器的位置、急救电话。保持实验室门和走道畅通，最小化存放实验室的试剂数量，未经允许严禁储存剧毒药品。保持实验室门和走道畅通，最小化存放实验室的试剂数量，未经允许严禁储存剧毒药品。实验必须在合适的通风柜内进行，密闭和有压力的实验必须在特种实验室进行。实验必须在合适的通风柜内进行，密闭和有压力的实验必须在特种实验室进行。离开实验室前须洗手，不可穿着实验室服装和戴手套进入清洁场所，如餐厅和休息室等。离开实验室前须洗手，不可穿着实验室服装和戴手套进入清洁场所，如餐厅和
4、休息室等。遇试剂溢出，应当立即清除。如溢出物有剧毒气体挥发，当事人无法处理，必须及时疏散人员并封闭现场，立即报遇试剂溢出，应当立即清除。如溢出物有剧毒气体挥发，当事人无法处理，必须及时疏散人员并封闭现场，立即报告室主任和安全部门。告室主任和安全部门。保持实验室干净整洁，无堆积，每天至少清理一次实验台面，通常在下班前或完成某个特定实验后进行。保持实验室干净整洁，无堆积，每天至少清理一次实验台面，通常在下班前或完成某个特定实验后进行。做实验期间严禁脱岗。过夜实验按所做实验期间严禁脱岗。过夜实验按所“过夜实验管理办法过夜实验管理办法”执行。执行。及时按规定处理废弃化学品，包括化学废弃物、过期化合物、
5、生物废弃物。每周在指定时间送往指定地点。及时按规定处理废弃化学品，包括化学废弃物、过期化合物、生物废弃物。每周在指定时间送往指定地点。实验室及禁烟区内禁止吸烟，禁止吸游烟。严禁违章使用明火。实验室及禁烟区内禁止吸烟，禁止吸游烟。严禁违章使用明火。工作时间之外，任何人都不允许在实验室单独操作大型仪器和危险化学品，或单独处于具潜在危险工作时间之外，任何人都不允许在实验室单独操作大型仪器和危险化学品，或单独处于具潜在危险的场所。的场所。第3页，此课件共48页哦学生分组学生分组1 1 学生分为学生分为6 6组，每组组，每组3 3个人，每组选一个小组长个人，每组选一个小组长2 2 安排值日生安排值日生第
6、4页，此课件共48页哦分小组配置相关溶液分小组配置相关溶液1 配制配制10XPBS及及1XPBS10Phosphate Buffered Solution（PBS）(pH 7.4)：ReagentWeightFinal concentrationNaCl MW=58.4481.816 g1.4 MKCl MW=74.55 2.01 g27 mMNa2HPO412H2O MW=358.14 35.8 g100 mMKH2PO4 MW=136.092.45 g18 mMH2OUp to 1000 ml注：1000 ml溶液用约1ml 10 M NaOH调节pH值至 7.4。因为实验室所用蒸馏水、三
7、蒸水和去离子水的本底pH值有一定差异，加之NaOH可能由于放置时间而产生pH值的变化，故实际用量需根据情况调整。第5页，此课件共48页哦2 配制配制1N HCl，1N NaOH3 配制组织固定液：配制组织固定液：4%PFA4 配制热修复液：配制热修复液：Tris-EDTA5 配制梯度酒精：配制梯度酒精：75%，85%，95%6 酒精：二甲苯酒精：二甲苯=1:17 石蜡：二甲苯石蜡：二甲苯=1:1分小组配置相关溶液分小组配置相关溶液第6页，此课件共48页哦动物的致死法动物的致死法动物处死方法：动物处死方法：1.1.麻醉法麻醉法 乙醚或乙醚或4 4戊巴比妥静注戊巴比妥静注 2.2.空气栓塞法空气栓
8、塞法 3.3.断头法断头法 4.4.断颈法断颈法 5.5.二氧化碳窒息法二氧化碳窒息法第7页，此课件共48页哦病人死亡后，一般要在数小时后才能做尸检，因此，病人死亡后，一般要在数小时后才能做尸检，因此，及时取材，尽早固定是开展及时取材，尽早固定是开展IHC IHC 检测的关键。检测的关键。尸检组织的取材尸检组织的取材第8页，此课件共48页哦第9页，此课件共48页哦抗原在组织中的分布常不均一，取材时应考虑：主要抗原在组织中的分布常不均一，取材时应考虑：主要病灶，病灶与正常组织交界处，远离病灶的正常组织。病灶，病灶与正常组织交界处，远离病灶的正常组织。组织大小：长组织大小：长1cm1cm宽宽1cm
9、1cm厚厚0.20.20.3cm0.3cm。手术切除标本的取材手术切除标本的取材第10页，此课件共48页哦1.1.组织要求离体后组织要求离体后30min30min内浸入固定液，尤其是开展分子生物学工作。内浸入固定液，尤其是开展分子生物学工作。动物动物组织取材要求心脏还在跳动时取材。组织取材要求心脏还在跳动时取材。2.2.注意防止人为因素的影响注意防止人为因素的影响 刀和剪要快，刀要足够长。刀和剪要快，刀要足够长。3.3.组织块的大小组织块的大小 厚为厚为0.10.10.3cm0.3cm，大小可根据需要而定，大小可根据需要而定4.4.组织的取材位置组织的取材位置 要视研究目的，观察部位而定要视研
10、究目的，观察部位而定5.5.取材时间取材时间 原则上，应尽快取材，但比较大的手术标本如胃、肺、肠等器官，最好先固定后取材。原则上，应尽快取材，但比较大的手术标本如胃、肺、肠等器官，最好先固定后取材。组织取材注意事项组织取材注意事项第11页，此课件共48页哦培养的活细胞可分贴壁和悬浮二种。培养的活细胞可分贴壁和悬浮二种。贴壁细胞可将贴壁细胞可将（1 1）细胞大量培养后，经消化将细胞制成悬液（）细胞大量培养后，经消化将细胞制成悬液（10106 6）涂在涂有切）涂在涂有切片粘合剂的载玻片上，凉干后固定。片粘合剂的载玻片上，凉干后固定。（2 2）将细胞直接培养在盖玻片上。）将细胞直接培养在盖玻片上。（
11、3 3）将细胞直接培养在）将细胞直接培养在6 6孔或孔或9 9孔板上，经固定后可行孔板上，经固定后可行IHCIHC。活细胞标本的制备法活细胞标本的制备法第12页，此课件共48页哦目的目的 (1)防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。(2)使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它原使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。有的结构与生活时相仿。（3）使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率，造成光学上的差异，以便
12、）使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率，造成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。染色后易于鉴别和观察。（4）固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便于制片。）固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便于制片。（5）防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。）防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。（6）经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便于辨认。）经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便于辨认。组织标本的固定组织标本的固定第13页，此课件共48页哦(1)甲醛固定液甲醛固定液 10福尔马林福尔马林(2)4多聚甲醛固定液多聚甲醛固定
13、液(3)Bouin S液及改良液及改良Bouin S液液固定液的种类固定液的种类第14页，此课件共48页哦(1)大小大小 2cm2cm0.3cm(2)及时固定及时固定(3)固定时间固定时间 固定时间要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温度而定，原则上，固定时间要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温度而定，原则上，组织块大小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间成反组织块大小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。比。(4)组织固定后必须彻底冲洗。组织固定后必须彻底冲洗。固定方法的选择及注意事项固定方法的选择及注意事项第15页，此课件共48页哦实验步骤实验步骤组织组
14、织取材与取材与细细胞制胞制备备。组织取材：小鼠子宫、淋巴结、胸腺、脾、骨髓。组织组织洗洗涤涤。将取到的材料在灭菌预冷的PBS中洗净，尽量彻底洗掉血液，以免切片观察时红细胞影响结果；组织组织固定。固定。所取材料于4多聚甲醛中固定24小时（固定的时间依组织大小而定，组织较大可固定较长时间，如果一开始分小块固定，则固定时间应缩短，约6小时）；组织组织脱水。脱水。分别用50和70酒精脱水1h，样品在70酒精中置于4保存直至石蜡包埋；梯度脱水。梯度脱水。组织块从70酒精中取出，在80、95%、100、100酒精中各脱水1h；透明。透明。组织块在100酒精/二甲苯（1:1）中透明30min；再到二甲苯中透
15、明，具体时间根据组织块大小而定，以组织块完全透明为宜；浸蜡。浸蜡。包埋机可直接接取加温并过滤好的石蜡液体，组织块在二甲苯/石蜡(1:1)、石蜡、石蜡中各透蜡2h；第16页，此课件共48页哦实验完毕整理实验室及实验台实验完毕整理实验室及实验台第17页，此课件共48页哦实验二实验二 组织包埋与切片及组织包埋与切片及HEHE染色染色（4学学时时）实验内容：实验内容：1 经脱水，透明，浸蜡的组织样品进行包埋：操作经脱水，透明，浸蜡的组织样品进行包埋：操作2 包埋样品的切片：石蜡切片包埋样品的切片：石蜡切片3 切片的切片的HE染色染色：第18页，此课件共48页哦目的：目的：由于石蜡不溶于水和醇类试剂，只
16、溶解在二甲苯类试剂由于石蜡不溶于水和醇类试剂，只溶解在二甲苯类试剂中。因而中。因而,组织经固定和水洗后含大量水分组织经固定和水洗后含大量水分,需用乙醇类试剂需用乙醇类试剂进行脱水进行脱水,水脱完后水脱完后,组织内含有大量的乙醇组织内含有大量的乙醇,还必须用能溶还必须用能溶解乙醇的二甲苯来置换解乙醇的二甲苯来置换,最后经浸蜡最后经浸蜡,组织细胞内被大量石蜡支组织细胞内被大量石蜡支撑撑,才使组织能用于石蜡切片。才使组织能用于石蜡切片。组织脱水、浸蜡及包埋组织脱水、浸蜡及包埋第19页，此课件共48页哦(1)脱水：脱水：75、85乙醇，乙醇，95、乙醇，无水乙醇乙醇，无水乙醇、。(2)透明：二甲苯透明
17、：二甲苯、二甲苯、二甲苯、二甲苯、二甲苯(3)浸蜡：石蜡浸蜡：石蜡、石蜡、石蜡、石蜡、石蜡(4)石蜡包埋：修蜡块，标号石蜡包埋：修蜡块，标号常规石蜡包埋过程常规石蜡包埋过程第20页，此课件共48页哦一般的组织化学染色切片厚度要求在一般的组织化学染色切片厚度要求在57 m左右，神经组织切片的左右，神经组织切片的厚度要求比较特殊，一般在厚度要求比较特殊，一般在20100 m之间，以便观察神经纤维的之间，以便观察神经纤维的走行。对于不同的组化反应在切片制作上有不同的要求。走行。对于不同的组化反应在切片制作上有不同的要求。目前的切片技术主要有：目前的切片技术主要有：冰冻切片、石蜡切片、超薄切片（电镜学
18、）。冰冻切片、石蜡切片、超薄切片（电镜学）。组织切片组织切片第21页，此课件共48页哦 骤冷（骤冷（Quenching）骤冷的目的骤冷的目的 最主要的目的是防止标本内的水结成最主要的目的是防止标本内的水结成 冰晶冰晶破坏标本结构。破坏标本结构。杀死组织（细胞）。杀死组织（细胞）。快捷制片。快捷制片。冰冻切片是酶组织化学和免疫组织化学最常用的方法。冰冻切片是酶组织化学和免疫组织化学最常用的方法。它它的的突突出出特特点点：能能比比较较好好地地保保存存组组织织的的酶酶活活性性，较较完完好好地地保保存存组组织织抗原的免疫活性。抗原的免疫活性。冰冻切片冰冻切片第22页，此课件共48页哦 切片切片 骤冷后
19、的组织块切片机上切片，目前的骤冷后的组织块切片机上切片，目前的 切片机有两类：切片机有两类：1）开放式冰冻切片机（半导体制冷切片机、）开放式冰冻切片机（半导体制冷切片机、甲醇制冷切片机及老式CO2、氯乙烷等切片 机）。开放式冰冻切片机由于暴露于空气 中，温度不易控制，技术难度大，现多已 淘汰。2）恒温冰冻切片机（）恒温冰冻切片机（Cryastat）常用 恒温冰冻切片机切片后如不染色，必须冷 风吹干，贮存于低温冰箱内或短暂预固定 后，冰箱贮存。冰冻切片冰冻切片第23页，此课件共48页哦LEICA冰冻切片机冰冻切片机第24页，此课件共48页哦石蜡切片石蜡切片Leica RM2235 Rotary
20、Microtome第25页，此课件共48页哦第26页，此课件共48页哦 (1)连续切片按序贴在玻片的下连续切片按序贴在玻片的下1/3。(2)5260烤片。烤片。(3)切片厚切片厚24m。(4)切片刀要快切片刀要快 (5)编上号编上号 (6)切片可在切片可在4保存数年（石蜡切片）保存数年（石蜡切片）(7)冰冻切片后需凉干后立即固定冰冻切片后需凉干后立即固定 (8)冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组织需经庶糖处理冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组织需经庶糖处理24h，冰冻切片。，冰冻切片。(9)冰冻切片固定后冰冻切片固定后-80保存备用保存备用切片要求及注意事项切片要求及注意事项第27页，此课件共48
21、页哦包埋。包埋。在包埋盒底先铺上一定厚度的石蜡，置于热台，将组织用镊子放入，调整好方向，将包埋盒置于凉台，使底部略微凝固，继续浇上石蜡，放上切片托，凉台冷冻，浇蜡，冷冻，直至整个蜡块成型。置于凉台，待石蜡彻底凝固后，利用切片托将蜡块取出。组织组织切片。切片。把切片刀架上，固定紧，然后利用切片托将蜡块在切片机固定器上夹紧。若位置不够平，可调整切片台的位置，同时修块。切片时，一开始可以将厚度调整至20m。右手匀速转动手柄，直到把组织全部切出，这时将厚度调为5m，继续切片。蜡片切成后，右手用小镊子摄蜡片，左手用毛笔沿刀锋轻轻把蜡片分开，切面朝下把切片放入42水中，展平后用镊子轻轻将连续蜡片分开，再用
22、载玻片捞起，晾干，放入切片盒。37烤片过夜。石蜡包埋及切片石蜡包埋及切片实验实验步步骤骤第28页，此课件共48页哦HE染色法，即是苏木精染色法，即是苏木精-伊红染色法。石蜡切片技术里常用的染伊红染色法。石蜡切片技术里常用的染色法之一色法之一。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。易于被碱性或酸性染料着色的性质分别称基质中的成分着红色。易于被碱性或酸性染料着色的性质分别称为嗜碱性和嗜酸性；若于两种染料的亲和力都
23、不强，则称中性。为嗜碱性和嗜酸性；若于两种染料的亲和力都不强，则称中性。一般的组织变化和组织产物都可以通过这一染色法显示出来。是一般的组织变化和组织产物都可以通过这一染色法显示出来。是形态学最常用的染色方法。形态学最常用的染色方法。HEHE染色染色第29页，此课件共48页哦HEHE染色染色步骤试剂时间次数1二甲苯10min32100酒精5min3395酒精5min1485酒精5min1570酒精5min1650酒精5min17蒸馏水5min38苏木精染液10 min9自来水（缓流水）10min10蒸馏水2min1111HCl 分色1-2s（浸入即取出）12自来水（缓流水）立即冲净13蒸馏水2m
24、in1140.1氨水 返蓝2-2.5min15蒸馏水2min11650酒精5min11770酒精5min11885酒精5min119伊红染液20s2095酒精 脱浮色5min12195酒精 5min122100酒精5min323二甲苯10min324二甲苯&封片剂封片25通风橱晾干4h或过夜第30页，此课件共48页哦实验三实验三 免疫组化染色免疫组化染色（4学学时时）实验内容：实验内容：1 免疫组化原理免疫组化原理2 免疫组化操作免疫组化操作第31页，此课件共48页哦免疫组化原理免疫组化原理抗原抗体（特异性）酶标记抗体，通过酶与底物作用生成有抗原抗体（特异性）酶标记抗体，通过酶与底物作用生成有
25、色反应物，定位组织或细胞内抗原的一门技术。色反应物，定位组织或细胞内抗原的一门技术。第32页，此课件共48页哦设对照的目的是为了排除假阴性和假阳性。设对照的目的是为了排除假阴性和假阳性。对照染色的目的对照染色的目的第33页，此课件共48页哦假阴性的原因主要有：假阴性的原因主要有：组织处理不当，抗原丢失过多或被遮蔽；组织处理不当，抗原丢失过多或被遮蔽；抗抗体体失失活活、效效价价过过低低或或稀稀释释度度不不合合适适（主主要要指指一一抗，即特异性抗体）；抗，即特异性抗体）；染染色色步步骤骤遗遗漏漏及及差差错错，或或显显色色剂剂的的选选择择、缓缓冲冲液液的的pH和离子强度不当等。和离子强度不当等。第3
26、4页，此课件共48页哦假阳性均系由多种因素造成的非特异着色所致，原因主要假阳性均系由多种因素造成的非特异着色所致，原因主要有：有：自发荧光或内源酶等干扰；自发荧光或内源酶等干扰；抗体试剂不纯抗体试剂不纯(特别是一抗）；特别是一抗）；操作失误，如污染、切片干枯或显色剂操作不当等；操作失误，如污染、切片干枯或显色剂操作不当等；第35页，此课件共48页哦对照染色大致可分为阳性组织对照、阴性组织及阴性对照染色大致可分为阳性组织对照、阴性组织及阴性试剂对照和自身对照四大类：试剂对照和自身对照四大类：对照的种类及其选用目的对照的种类及其选用目的 第36页，此课件共48页哦阳性组织对照阳性组织对照 指用已证
27、实含有靶抗原的同源及不同源组织切片或细胞涂片与待检实验切片同时作同样处理和免疫染色的组织对照。正确的结果应呈现阳性，目的是为了证实所用免疫组化染色流程的有效性，排除假阴性的可能。对照的种类及其选用目的对照的种类及其选用目的 第37页，此课件共48页哦阴性组织对照阴性组织对照 指用已证实不含靶抗原的同步处理和免疫标记染色的组织对照。正确的结果应为阴性，目的是除外假阳性。对照的种类及其选用目的对照的种类及其选用目的 第38页，此课件共48页哦空白对照空白对照指以缓冲液（PBS、TBS等）取代第一抗体（主要的，必要时还可做第二抗体及桥联抗体的空白取代），其他各步不变的试剂对照染色，结果应为阴性。对照
28、的种类及其选用目的对照的种类及其选用目的 第39页，此课件共48页哦取代对照取代对照 指以所用方法第一抗体同源动物的正常血清，或与本实验无关的抗体(靶生物缺如的)取代第一抗体，其他步骤不变的试剂对照染色，结果应为阴性。吸收试验吸收试验 是指用事先经过量抗原吸收的第一抗体上清液取代第一抗体，其他步骤不变的免疫染色试剂对照。结果应是阴性或阳性着色明显减弱（吸收不全时）。对照的种类及其选用目的对照的种类及其选用目的 第40页，此课件共48页哦空白对照不能省，其他对照在预实验中应尽量多做，尤空白对照不能省，其他对照在预实验中应尽量多做，尤其是应用新抗体试剂；其是应用新抗体试剂；对照必需与实验片同步进行
29、染色；对照必需与实验片同步进行染色；对照的结果应附合要求。对照的结果应附合要求。阴性试剂对照的选用原则阴性试剂对照的选用原则第41页，此课件共48页哦第42页，此课件共48页哦免疫免疫组组化化实验实验步步骤骤第43页，此课件共48页哦实验四实验四 免疫组化结果采集与分析技术免疫组化结果采集与分析技术（4学学时时）实验内容：实验内容：1 阳性信号的判断阳性信号的判断2 免疫组化结果拍照免疫组化结果拍照3 结果分析结果分析第44页，此课件共48页哦免疫组化结果的判断原则：免疫组化结果的判断原则：必须同时设对照染色。必须同时设对照染色。没有对照染色的免疫组化染色结果是不可信的。没有对照染色的免疫组化
30、染色结果是不可信的。抗原表达必须在特定部位。抗原表达必须在特定部位。如如LCA应应定定位位在在细细胞胞膜膜上上；CK应应定定位位在在细细胞胞浆浆内内；PCNA及及p53蛋蛋白白应应定定位位在在细细胞胞核核内内；EMA应应定定位位在在细细胞胞膜膜上上，等等等等。不不在在抗抗原原所所在在部部位位的的阳性着色，一概不能视为阳性。阳性着色，一概不能视为阳性。免疫组化结果的判断免疫组化结果的判断第45页，此课件共48页哦 阴性结果不能视为抗原不表达。由于检测方法灵敏度阴性结果不能视为抗原不表达。由于检测方法灵敏度有高低之分，有时可因染色方法灵敏度不够，而导致阴有高低之分，有时可因染色方法灵敏度不够，而导致阴性反应，判断时应注意。性反应，判断时应注意。尽尽量量避避开开出出血血、坏坏死死及及切切片片刀刀痕痕和和界界面面边边缘缘细细胞胞的的阳阳性性表表达达，特特别别是是酶酶免免疫疫标标记记。因因为为这这类类阳阳性性着着色色多多系系内内源源干干扰扰，或或系系人为因素所致。人为因素所致。免疫组化结果的判断免疫组化结果的判断第46页，此课件共48页哦第47页，此课件共48页哦第48页，此课件共48页哦