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1、关于免疫组化技术第1页，讲稿共87张，创作于星期日第一节第一节 免疫组织化学理论基础免疫组织化学理论基础 一、免疫反应一、免疫反应 免疫组织化学技术以免疫学的抗原抗免疫组织化学技术以免疫学的抗原抗体反应为理论基础。体反应为理论基础。n （一）抗原（一）抗原 抗原是一种化学物质，能刺激机体免疫抗原是一种化学物质，能刺激机体免疫系统产生相应的抗体，并能在体内和体外特异性结合形成系统产生相应的抗体，并能在体内和体外特异性结合形成抗原抗原-抗体复合物。抗体复合物。抗原具有免疫原性和反应原性抗原具有免疫原性和反应原性，免疫原性免疫原性指抗原分子具有诱导机体产生免疫应答的特性，指抗原分子具有诱导机体产生免
2、疫应答的特性，反应原性反应原性指抗指抗原分子与抗体或效应原分子与抗体或效应T细胞等免疫应答物质发生特异性反细胞等免疫应答物质发生特异性反应的特性。抗原可以是可溶性物质（如毒素或蛋白质）或应的特性。抗原可以是可溶性物质（如毒素或蛋白质）或微粒（细菌或组织细胞）。微粒（细菌或组织细胞）。第2页，讲稿共87张，创作于星期日T细胞细胞B细胞细胞AgT TB BT T浆细胞浆细胞致敏致敏T细胞细胞抗体抗体第3页，讲稿共87张，创作于星期日n 1抗原的性质抗原的性质n （1）异物性：）异物性：机体能对进入体内的异机体能对进入体内的异种、异体的大分子物质产生免疫应答，该物种、异体的大分子物质产生免疫应答，该
3、物质与机体的种系关系越远，其免疫原性越强，质与机体的种系关系越远，其免疫原性越强，机体的免疫反应也越强。同种异体物质也可机体的免疫反应也越强。同种异体物质也可作为抗原，如人红细胞作为抗原，如人红细胞ABO血型抗原，人类血型抗原，人类白细胞组织相容性抗原（白细胞组织相容性抗原（HLA）。）。第4页，讲稿共87张，创作于星期日 1.1.免疫原性免疫原性 指抗原分子能够刺激机体产生指抗原分子能够刺激机体产生免疫应答免疫应答(产生特异性抗体及免疫效应细胞产生特异性抗体及免疫效应细胞)的性质。的性质。AgT TB BT T浆细胞浆细胞致敏致敏T细胞细胞抗体抗体第5页，讲稿共87张，创作于星期日 2.2.
4、反应原性反应原性(又称免疫反应性又称免疫反应性)指抗原分子与免疫应答产物指抗原分子与免疫应答产物(抗体或免疫效应细抗体或免疫效应细胞胞)发生特异性结合的性质。发生特异性结合的性质。AgT TB BT T浆细胞浆细胞致敏致敏T细胞细胞抗体抗体第6页，讲稿共87张，创作于星期日第7页，讲稿共87张，创作于星期日第8页，讲稿共87张，创作于星期日n （2）大分子胶体）大分子胶体：抗原分子量越大，其表面积越大，：抗原分子量越大，其表面积越大，接触免疫细胞的机会越多，在体内停留时间长而不易排除，接触免疫细胞的机会越多，在体内停留时间长而不易排除，因而对机体的刺激作用也越强。一般具有免疫原性的物质，因而对
5、机体的刺激作用也越强。一般具有免疫原性的物质，分子量常在分子量常在10000以上。小于以上。小于500010000的蛋白质分子，免疫的蛋白质分子，免疫原性很弱或完全没有。原性很弱或完全没有。n （3）特异性：）特异性：一种抗体只能与相应的抗原反应而不能与其一种抗体只能与相应的抗原反应而不能与其他抗原反应，这种抗原称为特异性抗原（他抗原反应，这种抗原称为特异性抗原（specific antigen）。）。不同的抗原物质常含有共同的抗原成分，即一种抗体可以与二种或不同的抗原物质常含有共同的抗原成分，即一种抗体可以与二种或二种以上不同抗原反应，这些抗原称为共同抗原（二种以上不同抗原反应，这些抗原称为
6、共同抗原（common antigen）。）。第9页，讲稿共87张，创作于星期日n 3抗原的种类抗原的种类 分类方法很多。根据抗原的性质分为完全分类方法很多。根据抗原的性质分为完全抗原和不完全抗原：抗原和不完全抗原：n （1）完全抗原：）完全抗原：同时具有免疫原性和反应原性的物质，能在同时具有免疫原性和反应原性的物质，能在体内诱导免疫应答，产生效应物质，并可与产生的效应物质特异体内诱导免疫应答，产生效应物质，并可与产生的效应物质特异性结合，如细菌、蛋白质等。性结合，如细菌、蛋白质等。n （2）不完全抗原）不完全抗原 或半抗原，指在体内单独存在时时免或半抗原，指在体内单独存在时时免疫原性、但能与
7、相应抗体特异性结合的低分子化合物或化学疫原性、但能与相应抗体特异性结合的低分子化合物或化学基团。能与半抗原结合使其具有免疫原性的蛋白质部分称为基团。能与半抗原结合使其具有免疫原性的蛋白质部分称为载体（载体（carrier），载体使结合物具有免疫原性，半抗原决定），载体使结合物具有免疫原性，半抗原决定结合物的特异性。结合物的特异性。第10页，讲稿共87张，创作于星期日 3 3、完全抗原与半抗原、完全抗原与半抗原 1 1）完全抗原（完全抗原（complete antigen)complete antigen)具具有免疫原性和反应原性的物质。有免疫原性和反应原性的物质。2 2）半抗原（半抗原（hap
8、tenhapten，又称不完全抗原，又称不完全抗原incomplete antigenincomplete antigen），无反应原性，只有），无反应原性，只有抗原性的物质。抗原性的物质。半抗原半抗原 +蛋白质蛋白质 完全抗原完全抗原第11页，讲稿共87张，创作于星期日n2抗原决定簇抗原决定簇（ADAD）n概念：抗原分子中决定抗原特异性的特殊化概念：抗原分子中决定抗原特异性的特殊化n 学基团，又称为表位学基团，又称为表位nADAD的数目、性质和空间构象决定抗原特异性的数目、性质和空间构象决定抗原特异性n抗原以抗原以ADAD与相应抗原受体及抗体特异性结合与相应抗原受体及抗体特异性结合第13页，
9、讲稿共87张，创作于星期日n （二）抗体（二）抗体n 机体的免疫活性淋巴细胞在抗原的刺激下成为致敏淋巴细胞，机体的免疫活性淋巴细胞在抗原的刺激下成为致敏淋巴细胞，进而分化、增殖为记忆细胞和淋巴母细胞，后者再分化为进而分化、增殖为记忆细胞和淋巴母细胞，后者再分化为浆细胞，浆细胞，产生和分泌相应的抗体产生和分泌相应的抗体。根据抗体发挥功能的不同可以称为凝。根据抗体发挥功能的不同可以称为凝集素、调理素和沉淀素等。集素、调理素和沉淀素等。n 1抗体的性质抗体的性质 1972年，国际免疫学联合会正式将化学年，国际免疫学联合会正式将化学机构与抗体相同或相似的一类球蛋白分子统一命名为免疫球机构与抗体相同或相
10、似的一类球蛋白分子统一命名为免疫球蛋白（蛋白（Ig）。人类）。人类Ig有有Ig G、IgA、IgM、IgD、IgE，五种，五种Ig都具有都具有IgG的基本结构。的基本结构。IgG分子有分子有4条对称的多肽链，两条轻链条对称的多肽链，两条轻链（L链）和重链（链）和重链（H链），以共价和非共价二硫键连接组成，通常用链），以共价和非共价二硫键连接组成，通常用L2H2表示。表示。多肽链的氨基多肽链的氨基(N)第14页，讲稿共87张，创作于星期日n末端的氨基酸组成及序列随结合抗原的特异性而异，称可变区（末端的氨基酸组成及序列随结合抗原的特异性而异，称可变区（V），），是与抗原结合的部位是与抗原结合的部位
11、，也称也称Fab段段；羧基（羧基（C）末端的氨基末端的氨基酸组成及序列比较稳定，称为稳定区（酸组成及序列比较稳定，称为稳定区（C），），是与是与Fc受体结合受体结合的部位，也称的部位，也称Fc段段。n 2抗体的产生抗体的产生 抗原初次抗原初次进进入机体后，首先被抗原呈入机体后，首先被抗原呈递细递细胞（胞（APC）如巨噬）如巨噬细细胞吞噬，胞吞噬，经经消化降解保留其有效的抗原决消化降解保留其有效的抗原决定簇（特异性抗原成分），并呈定簇（特异性抗原成分），并呈递给递给T淋巴淋巴细细胞。胞。T淋巴细胞受淋巴细胞受到抗原信息刺激后，活化、增殖、分化为效应到抗原信息刺激后，活化、增殖、分化为效应T细胞，
12、同时分泌大细胞，同时分泌大量细胞因子，辅助量细胞因子，辅助B细胞细胞活化、增殖、分化为浆细胞，合成和分泌抗活化、增殖、分化为浆细胞，合成和分泌抗体。体。第15页，讲稿共87张，创作于星期日 3抗体的种类抗体的种类 根据获得抗体的途径或来源不同，分为免疫抗根据获得抗体的途径或来源不同，分为免疫抗体、天然抗体和自身抗体。根据抗原与抗体在试管内是否出现肉眼体、天然抗体和自身抗体。根据抗原与抗体在试管内是否出现肉眼可见的免疫反应，分为完全抗体和不完全抗体。可见的免疫反应，分为完全抗体和不完全抗体。n （三）抗原抗体反应（三）抗原抗体反应n 抗原与抗体在抗原与抗体在体内体内进进行的反行的反应应称称为为免
13、疫反免疫反应应，在，在体外体外进进行的行的反反应应称称为为血清学反血清学反应应，二者，二者统统称称为为免疫学反免疫学反应应，具有高度的特异性。，具有高度的特异性。主要有凝集反主要有凝集反应应、沉淀反、沉淀反应应和和补补体参加的各种血清学反体参加的各种血清学反应应。抗原与抗。抗原与抗体所形成的抗原抗体复合物不是靠化学共价体所形成的抗原抗体复合物不是靠化学共价键结键结合，而是抗原决定簇合，而是抗原决定簇与抗体分子的抗原与抗体分子的抗原结结合位点的相互吸引，同合位点的相互吸引，同时还时还有静有静电电引力、范德引力、范德华华力、力、氢键氢键、疏水、疏水键键等参与。等参与。第16页，讲稿共87张，创作于
14、星期日所以，所以，抗原抗体复合物的结合不仅具有特异性，而且结合得十分稳抗原抗体复合物的结合不仅具有特异性，而且结合得十分稳定定，二者在复合物中仍可保留各自原有的结构和化学特性，只有在，二者在复合物中仍可保留各自原有的结构和化学特性，只有在特殊条件下才能解离，如低特殊条件下才能解离，如低pH高浓度盐（高浓度盐（3mol/L硫氢化钾，硫氢化钾，7mol/L尿素）。在免疫组化操作过程中，已形成复合物的抗体不可尿素）。在免疫组化操作过程中，已形成复合物的抗体不可能被缓冲液从组织中洗脱，所洗去的只是未结合的或结合后多余的能被缓冲液从组织中洗脱，所洗去的只是未结合的或结合后多余的抗体。抗体。一个抗体分子有
15、两个抗原结合位点（二价），但一个抗原分子一个抗体分子有两个抗原结合位点（二价），但一个抗原分子可有多个结合位点（多价），抗原与抗体的反应不受数量比例的限可有多个结合位点（多价），抗原与抗体的反应不受数量比例的限制，但要出现肉眼可见的反应，抗原抗体需保持一定的比例。制，但要出现肉眼可见的反应，抗原抗体需保持一定的比例。第17页，讲稿共87张，创作于星期日n 二、免疫组织化学基本技术方法二、免疫组织化学基本技术方法n 不同的免疫组织化学技术各有独特的试剂和方法，但基不同的免疫组织化学技术各有独特的试剂和方法，但基本技术方法是一致的，一般包括抗体制备、标本处理、免疫染本技术方法是一致的，一般包括抗体
16、制备、标本处理、免疫染色、对照实验和显微镜观察等。色、对照实验和显微镜观察等。n 1抗体的制备抗体的制备 高敏感特异性抗体是免疫组织化学技术高敏感特异性抗体是免疫组织化学技术的首要条件。抗体有单克隆抗体和多克隆抗体两大类，目前已商的首要条件。抗体有单克隆抗体和多克隆抗体两大类，目前已商品化。品化。n 新购买的抗体应根据生产厂家提供的效价分装保存，在新购买的抗体应根据生产厂家提供的效价分装保存，在-20-70冰箱中可保存冰箱中可保存12年。小量抗体最好一次用完，避免反复冻年。小量抗体最好一次用完，避免反复冻溶，以免降低效价。溶，以免降低效价。第18页，讲稿共87张，创作于星期日n 2标本的处理标
17、本的处理 标本的采集和处理是免疫组织化学标本的采集和处理是免疫组织化学技术成功的前提，技术成功的前提，要保证待检组织新鲜，选用合适的固定液及要保证待检组织新鲜，选用合适的固定液及时固定、切片等。时固定、切片等。n 3免疫染色免疫染色 由于在组织和细胞进行的抗原抗体反应由于在组织和细胞进行的抗原抗体反应一般是不可见的，需要一般是不可见的，需要用标记方法将某种标记物或荧光素结用标记方法将某种标记物或荧光素结合到抗体上，合到抗体上，再用组织化学方法显示此标记物或在荧光显微再用组织化学方法显示此标记物或在荧光显微镜下观察荧光素发出的荧光。用这些标记的抗体可以在组织镜下观察荧光素发出的荧光。用这些标记的
18、抗体可以在组织切片上鉴别是否发生了特异的抗原抗体反应，并可对与抗体切片上鉴别是否发生了特异的抗原抗体反应，并可对与抗体结合的抗原进行定位。结合的抗原进行定位。第19页，讲稿共87张，创作于星期日n 三、结果判断结果判断 对免疫组织化学结果的判断应持科学慎重的态对免疫组织化学结果的判断应持科学慎重的态度。要准确判断阴性和阳性，排除假阳性和假阴性结果以及非特异性度。要准确判断阴性和阳性，排除假阳性和假阴性结果以及非特异性染色，必须严格对照实验。染色，必须严格对照实验。n 1阳性细胞的染色特征阳性细胞的染色特征n 有胞浆、胞核和胞膜表面着色三种类型有胞浆、胞核和胞膜表面着色三种类型，大部分抗原位，大
19、部分抗原位于胞浆，可见于整个或部分胞浆；于胞浆，可见于整个或部分胞浆；阳性细胞阳性细胞可呈灶性和弥漫性可呈灶性和弥漫性分布；因抗原含量不同，染色强度不一，如细胞之间染色相同，分布；因抗原含量不同，染色强度不一，如细胞之间染色相同，常提示为非特异性染色；常提示为非特异性染色；阳性细胞阳性细胞定位于定位于单个细胞单个细胞，且与阴性细胞，且与阴性细胞混杂分布，而非特异性染色常波及一片细胞；切片边缘、刀痕、皱摺，混杂分布，而非特异性染色常波及一片细胞；切片边缘、刀痕、皱摺，坏死重叠细胞区，胶原结缔组织等，常表现为相同的染色强度，不能坏死重叠细胞区，胶原结缔组织等，常表现为相同的染色强度，不能用于判断阳
20、性。用于判断阳性。第20页，讲稿共87张，创作于星期日n 2染色失败的常见原因染色失败的常见原因 通常有以下几种：通常有以下几种：n （1）均一阴性：可能是操作步骤，抗体质量，相关试）均一阴性：可能是操作步骤，抗体质量，相关试剂质量，剂质量，pH等出现了问题。等出现了问题。n （2）均一弱阳性：可能是抗体浓度过高或温育时间过）均一弱阳性：可能是抗体浓度过高或温育时间过长，长，H2O2浓度过高或显色反应时间过长，缓冲液未加浓度过高或显色反应时间过长，缓冲液未加NaCl或或pH有误，粘片剂太厚等因素。有误，粘片剂太厚等因素。n （3）背景过深：可能是未用酶处理切片，切片过厚，）背景过深：可能是未用
21、酶处理切片，切片过厚，漂洗时间不足，显色反应过长，封闭血清不足或血清溶血，漂洗时间不足，显色反应过长，封闭血清不足或血清溶血，全血清抗体稀释不够等因素。全血清抗体稀释不够等因素。n （4）阳性对照良好，待检切片阴性：标本固定和处理）阳性对照良好，待检切片阴性：标本固定和处理不当是最常见的原因。不当是最常见的原因。第21页，讲稿共87张，创作于星期日第二节第二节 免疫荧光组织化学技术免疫荧光组织化学技术n 一、免疫荧光的基本原理一、免疫荧光的基本原理n 免疫荧光组织化学技术系免疫荧光组织化学技术系将抗体或抗原以荧光素标记，将抗体或抗原以荧光素标记，然后与相应抗原或抗体结合，在然后与相应抗原或抗体
22、结合，在荧光显微镜荧光显微镜或紫外线照射或紫外线照射下，呈现荧光的一种特异性免疫荧光检测方法。该技术下，呈现荧光的一种特异性免疫荧光检测方法。该技术结合了免疫反应的特异性和在黑色背景中发光物质易被结合了免疫反应的特异性和在黑色背景中发光物质易被发现的敏感性优点，因而能准确检测少量的抗原或抗体发现的敏感性优点，因而能准确检测少量的抗原或抗体成分在组织细胞内的定位分布。成分在组织细胞内的定位分布。第22页，讲稿共87张，创作于星期日 二、免疫荧光技术的条件二、免疫荧光技术的条件 （一）（一）荧光素荧光素 当某些物质经光线的照射，特别是经短波长的光线当某些物质经光线的照射，特别是经短波长的光线(能量
23、强能量强)照照射后，该物质原子的电子层中的电子吸收光能，由低能级的电子射后，该物质原子的电子层中的电子吸收光能，由低能级的电子层跃迁到高能级的电子层，或跃迁到同一电子层的高能带，称为层跃迁到高能级的电子层，或跃迁到同一电子层的高能带，称为能级跃迁。处于高能级状态的电子极不稳定（激发态），经过约能级跃迁。处于高能级状态的电子极不稳定（激发态），经过约10-8秒后，以辐射光量子的形式释放所吸收的能量，而回到原秒后，以辐射光量子的形式释放所吸收的能量，而回到原来的能级状态（基态）。这种辐射出的能量即荧光。引起荧光来的能级状态（基态）。这种辐射出的能量即荧光。引起荧光最有效的光是激光、紫外光和蓝紫光。
24、根据不同荧光素的标本，最有效的光是激光、紫外光和蓝紫光。根据不同荧光素的标本，可产生红、橙、黄、绿、青、蓝、紫色的荧光。可产生红、橙、黄、绿、青、蓝、紫色的荧光。第23页，讲稿共87张，创作于星期日n 荧光素是一种染料，可以吸收激发光的光能并发射荧光。荧光素是一种染料，可以吸收激发光的光能并发射荧光。一定的荧光素可以与组织或细胞的某些成分（如染色体）一定的荧光素可以与组织或细胞的某些成分（如染色体）中的分子或功能基团进行特异性结合，呈现一定颜色的荧中的分子或功能基团进行特异性结合，呈现一定颜色的荧光。光。荧光显微镜荧光显微镜就是利用组织和细胞与荧光素特异性结合就是利用组织和细胞与荧光素特异性结
25、合的特性，通过激发滤光片产生一定波长的的特性，通过激发滤光片产生一定波长的激发光源激发光源，照射照射结合在组织和细胞中的荧光素产生激光结合在组织和细胞中的荧光素产生激光，再通过阻断滤光片，再通过阻断滤光片观察所产生的荧光。即可观察组织细胞的结构、细胞内某些观察所产生的荧光。即可观察组织细胞的结构、细胞内某些成分含量的变化，并探讨细胞的功能状态。或用某些荧光素成分含量的变化，并探讨细胞的功能状态。或用某些荧光素标记免疫球蛋白，进行免疫荧光细胞学研究。标记免疫球蛋白，进行免疫荧光细胞学研究。第24页，讲稿共87张，创作于星期日n 用于标记蛋白质的荧光素用于标记蛋白质的荧光素必须具备必须具备有有化学
26、上的活泼基团，化学上的活泼基团，易与蛋白质稳定结合；易与蛋白质稳定结合；能发射可见的、对视觉敏感的荧光颜色；能发射可见的、对视觉敏感的荧光颜色；荧光效应强，性质比较稳定，不影响标记物的活性。常用荧光效应强，性质比较稳定，不影响标记物的活性。常用于免疫标记的荧光素有于免疫标记的荧光素有异硫氰酸荧光素（异硫氰酸荧光素（FITC）、四甲基异硫）、四甲基异硫氰酸罗丹明（氰酸罗丹明（TRITC）、四乙基罗丹明（、四乙基罗丹明（RB200）、二甲基氨基萘）、二甲基氨基萘-5-磺酸（磺酸（DANS）、）、4-乙酰胺乙酰胺-4-异硫氰基异硫氰基-二苯乙烯二苯乙烯-2,2二磺酸二磺酸（SITS）呈兰色荧光、）呈
27、兰色荧光、得克萨斯红、藻红素得克萨斯红、藻红素R、花青，、花青，DANS因荧因荧光迅速猝灭，已很少用。光迅速猝灭，已很少用。第25页，讲稿共87张，创作于星期日 （二）荧光标记抗体（二）荧光标记抗体 用于荧光素标记的蛋白质，多用特异性抗体或抗原成分，用于荧光素标记的蛋白质，多用特异性抗体或抗原成分，因因不同抗原的理化特性差别甚大，不易高效标记，不同抗原的理化特性差别甚大，不易高效标记，远较标记抗体少。远较标记抗体少。用于标记的抗体要求效价高，特异性强，标记后活性损失小。用于标记的抗体要求效价高，特异性强，标记后活性损失小。虽虽然单抗的效价高，特异性强，亲和力强，但经荧光素标记后，然单抗的效价高
28、，特异性强，亲和力强，但经荧光素标记后，理论活性仅是标记前的理论活性仅是标记前的50%50%，故常用标记抗鼠免疫球蛋白的方，故常用标记抗鼠免疫球蛋白的方法以弥补单抗标记的缺点。法以弥补单抗标记的缺点。1 1FITCFITC标记抗体标记抗体 FITCFITC为黄橙色或黄褐色粉末或结晶，分为黄橙色或黄褐色粉末或结晶，分子量子量389.4389.4，性质稳定，室温可保存，性质稳定，室温可保存2 2年以上，低温可保存多年，年以上，低温可保存多年，易溶于水和乙醇。易溶于水和乙醇。最大吸收光谱最大吸收光谱490490495nm495nm，最大发射光谱，最大发射光谱520520530nm530nm，呈现黄绿
29、色荧光，呈现黄绿色荧光。第26页，讲稿共87张，创作于星期日n在碱性条件下，在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基的异硫氰酸基在水溶液中与在水溶液中与IgG的自由氨的自由氨基经碳酰胺化而形成硫碳氨基键基经碳酰胺化而形成硫碳氨基键，结合成为标记荧光素的，结合成为标记荧光素的IgG荧光抗体。一个荧光抗体。一个IgG分子最多可以标记分子最多可以标记1520个个FITC分子。分子。n 2TRITC标记抗体标记抗体 TRITC为紫红色粉末，分子量为紫红色粉末，分子量580，较稳定。较稳定。最大吸收光谱为最大吸收光谱为550nm，最大发射光谱为，最大发射光谱为620nm，呈现呈现橙红色荧光橙红色荧光，与，与F
30、ITC的黄绿色荧光对比清晰。与蛋白质结合的黄绿色荧光对比清晰。与蛋白质结合方式同方式同FITC相似。相似。TRITC亦分无定型和结晶型两种，前者与蛋白亦分无定型和结晶型两种，前者与蛋白质以质以2040g/mg为宜，后者则为为宜，后者则为12.5g/mg。第27页，讲稿共87张，创作于星期日n 3RB200标记抗体标记抗体 RB200为褐红色粉末，分子量为褐红色粉末，分子量580，不溶于水，易溶于乙醇或丙酮，性质稳定，室温下可长期保不溶于水，易溶于乙醇或丙酮，性质稳定，室温下可长期保存。最大吸收光谱为存。最大吸收光谱为570nm，最大发射光谱为，最大发射光谱为595600nm，呈，呈现明亮橙红色
31、荧光。现明亮橙红色荧光。RB200在在PCl5作用下转变成磺酰氯（作用下转变成磺酰氯（SO2Cl），在碱性条件下易与蛋白质的赖氨酸），在碱性条件下易与蛋白质的赖氨酸-氨基反应而标记在蛋白分氨基反应而标记在蛋白分子上。子上。n （三）荧光抗体的贮存（三）荧光抗体的贮存n 合格的荧光抗体，加合格的荧光抗体，加0.1%硫柳汞防腐。小剂量分装于安瓶硫柳汞防腐。小剂量分装于安瓶内熔封后，内熔封后，4保存保存1年，年，-20保存保存2年，冷冻真空干燥成干粉后年，冷冻真空干燥成干粉后熔封，熔封，4保存保存5年效果尚好。年效果尚好。第28页，讲稿共87张，创作于星期日n 三、免疫荧光技术的分类三、免疫荧光技术
32、的分类：n 据标记的抗体和抗原不同分为荧光抗体法和荧光抗原法，据标记的抗体和抗原不同分为荧光抗体法和荧光抗原法，以荧光抗体法较为常用。以荧光抗体法较为常用。据标记的抗体不同又分为直接法和据标记的抗体不同又分为直接法和间接法间接法 1直接法直接法 用荧光素直接标记已知的特异性第一抗体用荧光素直接标记已知的特异性第一抗体（或抗原），检测相应的待测抗原（或抗体），本法简便、快速、（或抗原），检测相应的待测抗原（或抗体），本法简便、快速、特异性强，但敏感性差。特异性强，但敏感性差。第29页，讲稿共87张，创作于星期日第30页，讲稿共87张，创作于星期日 2间接法间接法 间接法不需直接标记特异抗体间接法
33、不需直接标记特异抗体(一抗），一抗），而是标记第二或第三抗体。而是标记第二或第三抗体。（1）夹心法：）夹心法：先用特异性抗原与组织内的抗体反应，先用特异性抗原与组织内的抗体反应，再用此抗原的特异性荧光抗体与结合在组织内抗体上的抗再用此抗原的特异性荧光抗体与结合在组织内抗体上的抗原结合，原结合，抗原夹在组织抗体与荧光抗体之间，抗原夹在组织抗体与荧光抗体之间，故称为夹心法故称为夹心法。（2）检测抗体法：）检测抗体法：用用已知抗原的组织切片，已知抗原的组织切片，加上加上 待测血清，其中的特异性抗体与切片中的已知抗原结待测血清，其中的特异性抗体与切片中的已知抗原结 合，再用合，再用间接荧光抗体（抗种属
34、特异性间接荧光抗体（抗种属特异性IgG荧光抗体）荧光抗体）与结合在抗原上的抗体反应（与结合在抗原上的抗体反应（如检测人血清中的抗体如检测人血清中的抗体 必须用抗人必须用抗人IgG荧光抗体）。在荧光显微镜下就可以荧光抗体）。在荧光显微镜下就可以第31页，讲稿共87张，创作于星期日n见到抗原抗体反应部位呈现特异性荧光。此法是常规检测血清见到抗原抗体反应部位呈现特异性荧光。此法是常规检测血清中自身抗体和多种病原体抗体的重要手段。中自身抗体和多种病原体抗体的重要手段。n （3）检测抗原法：）检测抗原法：先用特异性抗体与标本中的待测抗先用特异性抗体与标本中的待测抗原反应，随后用缓冲液洗去未与抗原结合的抗
35、体，再用间接荧原反应，随后用缓冲液洗去未与抗原结合的抗体，再用间接荧光抗体（二抗）与结合在抗原上的一抗结合，形成光抗体（二抗）与结合在抗原上的一抗结合，形成抗原抗原-抗体抗体-荧光抗体复合物。荧光抗体复合物。本法只需要制备一种种属间荧光抗体，本法只需要制备一种种属间荧光抗体，不但简便快速，而且特异性强、敏感性高。不但简便快速，而且特异性强、敏感性高。第32页，讲稿共87张，创作于星期日第33页，讲稿共87张，创作于星期日n 3补体法补体法n （1）直接检测组织内免疫复合物：用抗补体）直接检测组织内免疫复合物：用抗补体C3等荧光抗体等荧光抗体直接作用于组织切片，直接作用于组织切片，与其中结合在抗
36、原抗体复合物上的与其中结合在抗原抗体复合物上的补体反补体反应，应，形成形成抗原抗原-抗体抗体-补体补体-抗补体荧光抗体抗补体荧光抗体复合物，在抗原复合物，在抗原-抗体抗体-补体复合物存在的部位呈现特异性荧光。补体复合物存在的部位呈现特异性荧光。n （2）间接检测组织内抗原：将新鲜补体与一抗混合，）间接检测组织内抗原：将新鲜补体与一抗混合，同同时加在抗原标本上，时加在抗原标本上，37孵育后如发生抗原抗体反应，补体就结合孵育后如发生抗原抗体反应，补体就结合在此复合物上，再用抗补体荧光抗体与结合的补体反应，形成抗原在此复合物上，再用抗补体荧光抗体与结合的补体反应，形成抗原-抗抗体体-补体补体-荧光抗
37、体复合物。荧光抗体复合物。第34页，讲稿共87张，创作于星期日利用补体反应，通过形成抗原利用补体反应，通过形成抗原-抗体抗体-补体复合物发射荧光补体复合物发射荧光第35页，讲稿共87张，创作于星期日 四、常用四、常用荧荧光染色方法光染色方法 1直接法直接法 (1）向切片滴加最佳效价的）向切片滴加最佳效价的荧荧光光标记标记一抗，室温或一抗，室温或37避光作用避光作用30min；（2）倾倾去残留的去残留的荧荧光一抗，浸入光一抗，浸入PBS(pH7.27.4)，电电磁振磁振动动，洗，洗涤涤5min2次；次；（3）蒸）蒸馏馏水洗水洗涤涤1min除去除去盐结盐结晶；晶；（4）用）用50%缓缓冲甘油封固（
38、冲甘油封固（0.5mol/L碳酸碳酸缓缓冲液，冲液，pH9.09.5），），荧荧光光显显微微镜观镜观察。察。（5）对对照照实验实验：1）抗体）抗体对对照：用正常血清代替照：用正常血清代替荧荧光抗体血清，如上述方法光抗体血清，如上述方法处处理，理，结结果果应为应为阴性；阴性；2）抗原）抗原对对照：照：类类属抗原染色，属抗原染色，结结果果应为应为阳性；阳性；第36页，讲稿共87张，创作于星期日 2间接法间接法 （1）向切片滴加最佳效价的一抗，室温或）向切片滴加最佳效价的一抗，室温或37避光作避光作用用30min；（2）倾去残留的一抗，用）倾去残留的一抗，用0.1mol/L PBS（pH7.2）洗）
39、洗涤涤10min2次，吸去残留液体；次，吸去残留液体；（3）滴加间接荧光抗体，室温或）滴加间接荧光抗体，室温或37避光作用避光作用30min，PBS振动洗涤振动洗涤10min2次；次；（4）50%缓冲甘油封固（缓冲甘油封固（0.5mol/L碳酸缓冲液，碳酸缓冲液，pH9.09.5），荧光显微镜观察。），荧光显微镜观察。（5）对照实验：）对照实验：1）抗体对照：用正常血清代替一抗血清，如上述方法处）抗体对照：用正常血清代替一抗血清，如上述方法处理，结果应为阴性；理，结果应为阴性；2）阳性对照：用阳性对照切片染色，如上述方法处理，）阳性对照：用阳性对照切片染色，如上述方法处理，结果应为阳性。结果应
40、为阳性。第37页，讲稿共87张，创作于星期日 3补体法补体法 （1）将固定切片（涂片）将固定切片（涂片）0.1mol/L PBS（pH7.2）洗涤）洗涤3min，吹干至表面无水分；，吹干至表面无水分；（2）滴加最佳效价免疫血清和补体的等量混合液，室）滴加最佳效价免疫血清和补体的等量混合液，室温或温或37避光作用避光作用30min；（3）用）用0.1mol/L PBS（pH7.2）洗）洗5min2次，搅拌或次，搅拌或振动，吸干标本周围液体；振动，吸干标本周围液体；（4）滴加最佳效价的抗补体荧光抗体，）滴加最佳效价的抗补体荧光抗体，37避光作用避光作用30min，水洗同（，水洗同（3）；）；（5）
41、蒸馏水洗涤）蒸馏水洗涤1 min，50%缓冲甘油封固，荧光显微缓冲甘油封固，荧光显微镜观察。镜观察。（6）对照实验：按间接法对照进行。）对照实验：按间接法对照进行。第38页，讲稿共87张，创作于星期日n 五、免疫荧光染色的注意事项五、免疫荧光染色的注意事项n 1载（盖）玻片载（盖）玻片 载玻片必须光滑均匀，无自发荧光，厚度载玻片必须光滑均匀，无自发荧光，厚度以以0.81.2mm为宜，盖玻片以为宜，盖玻片以0.17mm为宜。为宜。n 2组织切片组织切片 不宜太厚，以免激发光消耗过多和细胞重叠影不宜太厚，以免激发光消耗过多和细胞重叠影响观察，通常响观察，通常510 m。n 3封片剂封片剂 必须无自
42、发荧光，无色透明。通常用甘油。必须无自发荧光，无色透明。通常用甘油。n 4荧光观察荧光观察 暗室中观察，每次暗室中观察，每次12h为宜。为宜。n 荧光强度分四级，荧光强度分四级，“-”无或微弱自发荧光，无或微弱自发荧光，“+”明确可见的荧明确可见的荧光，光，“+”明亮的荧光，明亮的荧光，“+”耀眼的荧光。采用高速感光胶片耀眼的荧光。采用高速感光胶片（ASA200）摄影，或采用分光光度计、流式细胞仪、激光共）摄影，或采用分光光度计、流式细胞仪、激光共聚焦显微镜和图象分析仪观察、记录、分析。聚焦显微镜和图象分析仪观察、记录、分析。第39页，讲稿共87张，创作于星期日 六、非特异性染色的消除方法六、
43、非特异性染色的消除方法 1非特异性染色的主要因素非特异性染色的主要因素 （1）部分荧光素未与蛋白结合而形成聚合物或衍化物，不）部分荧光素未与蛋白结合而形成聚合物或衍化物，不能被透析除去而着色。能被透析除去而着色。（2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，与组织成分非特异结合。与组织成分非特异结合。（3）除待检抗原外，组织中可能存在类属抗原（如）除待检抗原外，组织中可能存在类属抗原（如Forssman抗原），可能与组织中特异性抗原以外的相应抗原），可能与组织中特异性抗原以外的相应抗体结合。抗体结合。（4）所制备的免疫血清混杂一些抗其他
44、组织成分的抗体，）所制备的免疫血清混杂一些抗其他组织成分的抗体，混淆不清。混淆不清。（5）荧光素分子太多，过量标记的抗体分子带有过多的阴离）荧光素分子太多，过量标记的抗体分子带有过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色，荧光素不纯、标本子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色，荧光素不纯、标本固定不当也可出现非特异性染色。固定不当也可出现非特异性染色。第40页，讲稿共87张，创作于星期日 2非特异性染色的消除方法非特异性染色的消除方法 根据非特异性染色的原因，通常采用下列方法：根据非特异性染色的原因，通常采用下列方法：（1）动物脏器粉末吸收法：常用猪或鼠肝粉或）动物脏器粉末吸收法：常
45、用猪或鼠肝粉或 骨髓粉、骨髓粉、鼠脑粉和鸡胚粉等。每毫升荧光抗体中加肝粉鼠脑粉和鸡胚粉等。每毫升荧光抗体中加肝粉50100mg，混，混允，室温振动允，室温振动2h，4过夜，再搅拌过夜，再搅拌10min，300015000rpm高速离心高速离心30min，12次，即可使用其上清次，即可使用其上清液。一般在临用前进行，吸收后荧光抗体低温保存不要超过液。一般在临用前进行，吸收后荧光抗体低温保存不要超过2周。周。（2）透析法：荧光素（如）透析法：荧光素（如FITC）可以透过半透膜，而）可以透过半透膜，而蛋白质大分子不能透过，因此，透析法可以将未与抗体蛋白蛋白质大分子不能透过，因此，透析法可以将未与抗体
46、蛋白质分子结合的荧光素除去。质分子结合的荧光素除去。第41页，讲稿共87张，创作于星期日 （3）伊文蓝（）伊文蓝（Evan blue）衬染法：用含）衬染法：用含0.01%伊伊文蓝的文蓝的0.01mol/L（pH7.2）PBS溶液稀释荧光抗体，可将背溶液稀释荧光抗体，可将背景组织染成红色荧光，与特异性黄绿色荧光形成鲜明对比，景组织染成红色荧光，与特异性黄绿色荧光形成鲜明对比，减少非特异性荧光，宜常规使用。伊文蓝配成减少非特异性荧光，宜常规使用。伊文蓝配成1%溶液，溶液，4保存，用前稀释至保存，用前稀释至0.01%以稀释抗体。以稀释抗体。（4）其他：葡聚糖凝胶）其他：葡聚糖凝胶G-25或或G-50
47、层析法和层析法和DEAE纤维素柱层析法、荧光抗体稀释法、纯化抗原和纯化抗体法纤维素柱层析法、荧光抗体稀释法、纯化抗原和纯化抗体法、胰蛋白酶消化组织切片法、牛血清蛋白封闭法等。胰蛋白酶消化组织切片法、牛血清蛋白封闭法等。第42页，讲稿共87张，创作于星期日第三节第三节 免疫酶标组织化学技术免疫酶标组织化学技术n 免疫酶标记技术是在免疫荧光技术的基础上发展起来的。免疫酶标记技术是在免疫荧光技术的基础上发展起来的。通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，当抗原与抗体通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，当抗原与抗体在组织或细胞内特异性结合后，借助酶对相应底物的特异催化在组织或细胞内特异性结合后
48、，借助酶对相应底物的特异催化作用，生成有色不溶性产物（或高电子密度颗粒），在光镜作用，生成有色不溶性产物（或高电子密度颗粒），在光镜（或电镜）下进行细胞表面或细胞内各种抗原成分的定位、定（或电镜）下进行细胞表面或细胞内各种抗原成分的定位、定性和定量检测性和定量检测。第43页，讲稿共87张，创作于星期日n 一、标本制备一、标本制备n 基本原则是保持组织内抗原物质的不动性和免疫活性。基本原则是保持组织内抗原物质的不动性和免疫活性。n 1AMEX（acetone meth enzoate xylene）即改良冷）即改良冷冻置换法（冻置换法（freeze substitution）的简称，主要用于石蜡
49、包埋的）的简称，主要用于石蜡包埋的标本，具有同新鲜未固定组织冷冻切片同样的抗原保持性和石蜡标本，具有同新鲜未固定组织冷冻切片同样的抗原保持性和石蜡切片的良好组织结构保存性。其机制为：组织在丙酮中固定（脱切片的良好组织结构保存性。其机制为：组织在丙酮中固定（脱水），细胞内水分逐渐被丙酮取代，继而用苯甲酸酯取代丙酮，水），细胞内水分逐渐被丙酮取代，继而用苯甲酸酯取代丙酮，经二甲苯置换后，石蜡包埋。组织在经二甲苯置换后，石蜡包埋。组织在-20丙酮内过夜亦形成冰丙酮内过夜亦形成冰晶，所以将组织先置晶，所以将组织先置4丙酮丙酮2030min，再移入，再移入-20丙酮过夜，丙酮过夜，也可以在也可以在4丙酮
50、内过夜，效果基本相同。丙酮内过夜，效果基本相同。第44页，讲稿共87张，创作于星期日n 2微波固定微波固定 能保持良好的组织结构和抗原性，适用于各能保持良好的组织结构和抗原性，适用于各种切片固定。其机理可能与微波的频率具有被水分吸收的性质种切片固定。其机理可能与微波的频率具有被水分吸收的性质（通常所用微波频率（通常所用微波频率2450MHz）有关。生物材料含有大量水分，）有关。生物材料含有大量水分，照射后分子运动加快，温度升高，促进固定液向组织内渗透，照射后分子运动加快，温度升高，促进固定液向组织内渗透，加速与组织成分的反应，短时间内可达到固定的效果。经微加速与组织成分的反应，短时间内可达到固