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1、本节难点本节难点融合体和重组体的检出及鉴别的方法融合体和重组体的检出及鉴别的方法提高重组效率的方法提高重组效率的方法第1页/共62页第第1 1节节 微生物杂交育种微生物杂交育种概念：杂交育种通过微生物杂交将概念：杂交育种通过微生物杂交将不同菌株不同菌株的遗传物质进行的遗传物质进行交换、重组交换、重组，使，使不同菌株的优良特性不同菌株的优良特性集中集中于一个重组体中。于一个重组体中。第2页/共62页杂交甲生长快、产量低生长快、产量低乙生长慢、产量高生长慢、产量高生长快、产量高生长快、产量高第3页/共62页应用应用 面面包包酵酵母母:对对麦麦芽芽糖糖及及葡葡萄萄糖糖的的发发酵酵力力强强，产产生生
2、COCO2 2 多，生长快；多，生长快；酒酒精精酵酵母母:产产酒酒率率高高，而而对对麦麦芽芽糖糖、葡葡萄萄糖糖的的发酵力弱发酵力弱 杂杂杂杂交交交交:就就得得到到了了既既能能生生产产酒酒精精，又又能能将将其其残残余余菌体用作面包厂和家用发面酵母的优良菌种。菌体用作面包厂和家用发面酵母的优良菌种。第4页/共62页杂交育种的优点：杂交育种的优点：a)可将两个或多个可将两个或多个优良性状优良性状集中在一个个体上。集中在一个个体上。b)由于杂交育种选用了由于杂交育种选用了已知性状已知性状的供体菌和受体菌作为亲本，的供体菌和受体菌作为亲本，因此，不论在因此，不论在方向性方向性还是还是自觉性自觉性方面，均
3、比诱变育种前进方面，均比诱变育种前进了一大步。了一大步。c)利用杂交育种往往还可以消除某一菌株在经过长期诱变处利用杂交育种往往还可以消除某一菌株在经过长期诱变处理后所出现的产量上升缓慢的现象。理后所出现的产量上升缓慢的现象。d)杂交育种有助于总结遗传物质的杂交育种有助于总结遗传物质的转移和传递转移和传递规律，丰富和规律，丰富和促进遗传学理论的发展。促进遗传学理论的发展。第5页/共62页杂交育种缺陷：杂交育种缺陷：a)只能利用已有的基因组，并不能产生新的基因；只能利用已有的基因组，并不能产生新的基因；b)杂交杂交进程缓慢进程缓慢，过程繁琐，育种时间长；，过程繁琐，育种时间长；c)只能进行只能进行
4、本物种或亲缘关系较近本物种或亲缘关系较近的物种杂交，不能克服远源的物种杂交，不能克服远源杂交不亲和的障碍。杂交不亲和的障碍。第6页/共62页微生物杂交的方式微生物杂交的方式原核：原核：原核：原核：接合接合 原生质体融合原生质体融合真核：真核：真核：真核：有性杂交有性杂交 准性杂交准性杂交 原生质体融合原生质体融合第7页/共62页第第2 2节节 原生质体融合育种原生质体融合育种原生质体:脱去细胞壁的植物、真菌或细菌细胞。第8页/共62页原生质体融合原生质体融合原生质体融合（原生质体融合（protoplast fusion）是）是20世纪世纪70年代发年代发展起来的育种技术。展起来的育种技术。用水
5、解酶除去遗传物质转移的最大障碍用水解酶除去遗传物质转移的最大障碍细胞壁，制成细胞壁，制成由原生质膜包被的由原生质膜包被的裸细胞裸细胞，然后用物理、化学或生物学，然后用物理、化学或生物学方法，诱导遗传特性不同的两亲本原生质体方法，诱导遗传特性不同的两亲本原生质体融合融合，经染，经染色体交换、重组而达到色体交换、重组而达到杂交杂交的目的，经筛选获得集双亲的目的，经筛选获得集双亲优良性状于一体的稳定优良性状于一体的稳定融合子融合子。第9页/共62页Microbe AMicrobe BADD ENZYME第10页/共62页第11页/共62页ADD FUSION PROMOTER第12页/共62页原生质
6、体融合原生质体融合原生质体融合原生质体融合第13页/共62页融合后再生融合后再生第14页/共62页原生质体融合后基因重组第15页/共62页与常规杂交相比，原生质体融合具有多方面的优与常规杂交相比，原生质体融合具有多方面的优势势 大幅度提高亲本之间大幅度提高亲本之间重组频率重组频率。扩大重组的扩大重组的亲本范围亲本范围。原生质体融合时亲本整套染色体参与交换，遗原生质体融合时亲本整套染色体参与交换，遗传物质转移和重组性状较多，集中双亲本传物质转移和重组性状较多，集中双亲本优良优良性状性状机会更大。机会更大。第16页/共62页不足之处不足之处原生质体融合后原生质体融合后DNADNA交换和重组随机发生
7、，增加交换和重组随机发生，增加重组体重组体分离筛选分离筛选的难度。的难度。细胞对异体遗传物质的降解和排斥作用，以及细胞对异体遗传物质的降解和排斥作用，以及遗传物质非同源性等因素也会影响原生质体融遗传物质非同源性等因素也会影响原生质体融合的重组频率，使合的重组频率，使远缘融合杂交远缘融合杂交存在较大困难。存在较大困难。第17页/共62页第第3 3节节 原生质体融合育种的步骤原生质体融合育种的步骤一、直接亲本及其遗传标记的选择二、原生质体制备与再生三、原生质体融合四、融合体再生与检出五、重组体检出鉴别与遗传特性分析第18页/共62页 一、直接亲本及其遗传标记的选一、直接亲本及其遗传标记的选择择原生
8、质体融合的亲本应采用具有较大遗传差异的近亲菌株，重组后的新个体具有原生质体融合的亲本应采用具有较大遗传差异的近亲菌株，重组后的新个体具有更大的更大的杂种优势杂种优势。第19页/共62页一、直接亲本及其遗传标记的选择一、直接亲本及其遗传标记的选择作为原生质体融合的二亲本菌株都应该带有一定的遗传作为原生质体融合的二亲本菌株都应该带有一定的遗传标记，便于重组体的检出。标记，便于重组体的检出。常用遗传标记：常用遗传标记：（何谓何谓“遗传标记遗传标记”）营养缺陷营养缺陷抗性抗性热致死（灭活）热致死（灭活）孢子颜色孢子颜色菌落形态菌落形态 第20页/共62页热致死（灭活）热致死（灭活）把双亲中任何一方的原
9、生质体用热把双亲中任何一方的原生质体用热灭活（如灭活（如50，2h或或60，5 min)或用紫外线、药物灭活，使细胞内或用紫外线、药物灭活，使细胞内的某些的某些酶或代谢途径钝化（核酸不酶或代谢途径钝化（核酸不变性）变性），然后和另一方具有正常活，然后和另一方具有正常活性的原生质体融合而获得重组体。性的原生质体融合而获得重组体。采用灭活标记融合频率较低，但重采用灭活标记融合频率较低，但重组体产量较高。组体产量较高。灭活正常活性正常活性正常活性无活性A B第21页/共62页 二、原生质体制备与再生二、原生质体制备与再生（一）原生质体制备（一）原生质体制备制备大量具有活性的原生质体是微生物原生质体融
10、合育种的前提。制备大量具有活性的原生质体是微生物原生质体融合育种的前提。第22页/共62页1.1.原生质体制备方法原生质体制备方法机械法、非酶分离法和机械法、非酶分离法和酶法酶法。采用前两种方法制备的原生质体效果差，活性低，仅适用于某些特定菌株。采用前两种方法制备的原生质体效果差，活性低，仅适用于某些特定菌株。最有效和最常用的是酶法。该法时间短，效果好。最有效和最常用的是酶法。该法时间短，效果好。第23页/共62页Protoplast fusionProtoplast fusion allows genetic improvement(random mutation&recombination
11、)of asexual micro-organisms protoplasts preparation:cells are grown in isotonic solution while inhibiting growth of cell wall,and partly dissociation it(lysozyme)第24页/共62页 2.2.原生质体的鉴定原生质体的鉴定(1)低渗爆破法低渗爆破法：直接在显微镜下观察原生质体：直接在显微镜下观察原生质体在低渗溶液中吸水膨胀、破裂的过程。在低渗溶液中吸水膨胀、破裂的过程。第25页/共62页2.2.原生质体的鉴定原生质体的鉴定(2)荧光染色法
12、荧光染色法：原生质体混悬液用荧光增白剂（：原生质体混悬液用荧光增白剂（VBL）染色，洗涤后在荧光显微镜下观察，发出红色光则为完染色，洗涤后在荧光显微镜下观察，发出红色光则为完全原生质体，发出绿色光则表明还有细胞壁成分存在。全原生质体，发出绿色光则表明还有细胞壁成分存在。（区别细胞壁与细胞膜的不同）（区别细胞壁与细胞膜的不同）第26页/共62页 3.3.原生质体的收集和纯化原生质体的收集和纯化纯化方法有以下几种（纯化方法有以下几种（这些方法基于什么原理这些方法基于什么原理？）(1)过滤法过滤法(2)密度梯度离心法密度梯度离心法(3)界面法界面法(4)漂浮法漂浮法通常采用离心法。通常采用离心法。第
13、27页/共62页(1)(1)过滤法过滤法根据细胞大小，选用孔根据细胞大小，选用孔径略小于细胞的砂芯漏径略小于细胞的砂芯漏斗，过滤。斗，过滤。原生质体由于外层细胞原生质体由于外层细胞膜柔软可膜柔软可变形变形，可以由，可以由比它小的微孔中穿过，比它小的微孔中穿过，而未酶解细胞或细胞团而未酶解细胞或细胞团却不能。却不能。第28页/共62页(2)(2)密度梯度离心法密度梯度离心法用蔗糖或氯化铯等制成浓用蔗糖或氯化铯等制成浓度（密度）梯度溶液，由度（密度）梯度溶液，由于密度差别，经离心后原于密度差别，经离心后原生质体漂浮于上部，未酶生质体漂浮于上部，未酶解细胞和细胞碎片沉于溶解细胞和细胞碎片沉于溶液下部
14、。液下部。原生质体细胞碎片、未酶解细胞第29页/共62页(3)(3)界面法界面法原理：选两种不同浓度的溶液，其中一种溶液密度大于原生质体的密度，另一种溶液小于原生质体的密度。离离心后原生质体就集中在两层液面交界处而得到纯化。心后原生质体就集中在两层液面交界处而得到纯化。原生质体13%甘露醇溶液25%蔗糖溶液第30页/共62页(4)(4)漂浮法漂浮法适用于一些细胞较大的微生物。适用于一些细胞较大的微生物。原生质体与细胞比重不同，原生质体的比重小于细胞，原生质体与细胞比重不同，原生质体的比重小于细胞，能在一定浓度的溶液中漂浮在液面上，从而得到纯化。能在一定浓度的溶液中漂浮在液面上，从而得到纯化。第
15、31页/共62页 4.4.原生质体的活力鉴定原生质体的活力鉴定分离纯化后的原生质体，用作再生或融合等育种的出发分离纯化后的原生质体，用作再生或融合等育种的出发材料，必须具有活力及再生能力，因此需要进行活力鉴材料，必须具有活力及再生能力，因此需要进行活力鉴定。定。原生质体活力鉴定方法主要有：原生质体活力鉴定方法主要有：（注意区别注意区别）荧光素双醋酸盐染色法荧光素双醋酸盐染色法酚藏花红染色法酚藏花红染色法伊文思蓝染色法伊文思蓝染色法第32页/共62页荧光素双醋酸盐（荧光素双醋酸盐（FDAFDA）染色法）染色法FDA本身不发荧光，被细胞吸收本身不发荧光，被细胞吸收脂解脂解后产生具有荧后产生具有荧光
16、的物质。能发出荧光的原生质体具有活性；（光的物质。能发出荧光的原生质体具有活性；（吸吸收收-代谢代谢-呈色呈色）第33页/共62页酚藏花红染色法酚藏花红染色法活性原生质体能吸收活性原生质体能吸收酚藏花红染料而成酚藏花红染料而成红色红色，无活性的死细胞不能吸无活性的死细胞不能吸收染料呈白色收染料呈白色;（吸收（吸收-呈色）呈色）伊文思蓝染色法伊文思蓝染色法活性原生质体不吸附活性原生质体不吸附染料为无色，死的无染料为无色，死的无活性细胞吸附染料呈活性细胞吸附染料呈蓝色。蓝色。（不吸收（不吸收-呈呈色）色）第34页/共62页 5.5.原生质体的保存原生质体的保存原生质体新鲜程度与其活性有关。原生质体
17、新鲜程度与其活性有关。如果不是立即使用，则必须在低温下保存。但如果不是立即使用，则必须在低温下保存。但是保藏时间很短。是保藏时间很短。第35页/共62页（二）原生质体再生（二）原生质体再生原生质体融合试验之前必须摸索出最佳的再生条件和完原生质体融合试验之前必须摸索出最佳的再生条件和完成再生实验，为融合体再生和复原做好准备。成再生实验，为融合体再生和复原做好准备。原生质体必须重新合成细胞壁物质，恢复至完整细胞形原生质体必须重新合成细胞壁物质，恢复至完整细胞形态，才能进一步生长、分裂和增殖，这一过程就是原生态，才能进一步生长、分裂和增殖，这一过程就是原生质体的再生。质体的再生。第36页/共62页影
18、响原生质体再生的因素（略）影响原生质体再生的因素（略）菌体生理状态菌体生理状态稳定剂稳定剂酶浓度与酶作用时间酶浓度与酶作用时间再生培养基的组成再生培养基的组成原生质体的密度原生质体的密度第37页/共62页 三、原生质体融合三、原生质体融合（一）融合剂和融合手段（一）融合剂和融合手段化学融合剂，化学融合剂，普遍采用普遍采用PEG介导的化学融合法。介导的化学融合法。在在PEG介导融合时，通常需要一定浓度的介导融合时，通常需要一定浓度的Ca2+和和Mg2+，能更有，能更有效地促进融合。效地促进融合。第38页/共62页（一）融合剂和融合手段（一）融合剂和融合手段物理融合手段物理融合手段，电融合，电融合
19、细胞产生偶极化，原生质体相互粘连，细胞沿电力方向排列细胞产生偶极化，原生质体相互粘连，细胞沿电力方向排列成串；成串；在外加瞬间高频直流强电压作用下，扰乱原生质体膜的分子在外加瞬间高频直流强电压作用下，扰乱原生质体膜的分子排列，使之穿孔，然后发生原生质体膜复原过程，原生质体排列，使之穿孔，然后发生原生质体膜复原过程，原生质体发生融合。发生融合。第39页/共62页电场作用下原生质膜被击穿的过程电场作用下原生质膜被击穿的过程 第40页/共62页（二）原生质体融合过程（二）原生质体融合过程在高渗稳定液中，两个或两个以上凝聚成团，相邻原生在高渗稳定液中，两个或两个以上凝聚成团，相邻原生质体紧密接触的质膜
20、面扩大，相互接触的质膜消失，细质体紧密接触的质膜面扩大，相互接触的质膜消失，细胞质融合，形成一个异核体细胞；胞质融合，形成一个异核体细胞；第41页/共62页 四、融合体再生与检出四、融合体再生与检出（一）融合体再生（一）融合体再生融合体的再生，包括融合体细胞壁合成、重建和融合体融合体的再生，包括融合体细胞壁合成、重建和融合体的再生。的再生。原生质体复原后，细胞的生理和生物学特性可恢复正常原生质体复原后，细胞的生理和生物学特性可恢复正常状态。但一些质粒可能会脱落。状态。但一些质粒可能会脱落。第42页/共62页（二）融合体的检出与分离（二）融合体的检出与分离1.利用利用营养缺陷型营养缺陷型标记选择
21、融合体标记选择融合体2.利用利用抗药性抗药性选择融合体选择融合体3.利用利用灭活原生质体灭活原生质体检出融合体检出融合体4.利用利用荧光染色法荧光染色法选择融合体选择融合体5.利用利用双亲对碳源利用不同双亲对碳源利用不同而检出融而检出融合体合体ABABAABB第43页/共62页 1 1利用营养缺陷型标记选择融合体利用营养缺陷型标记选择融合体融合的双亲带有不同营养缺陷型标记，在基本培养基上融合的双亲带有不同营养缺陷型标记，在基本培养基上只有融合体生长只有融合体生长而双亲本原生质体不能形成菌落。而双亲本原生质体不能形成菌落。此法较为准确可靠，缺点是易使部分表型延迟的融合体此法较为准确可靠，缺点是易
22、使部分表型延迟的融合体漏选、工作量大，且营养缺陷型标记会使亲本的优良性漏选、工作量大，且营养缺陷型标记会使亲本的优良性状丧失或降低。状丧失或降低。融合体AB第44页/共62页 2.2.利用抗药性选择融合体利用抗药性选择融合体微生物的抗药性是菌种的重要特性。不同种的微生物对微生物的抗药性是菌种的重要特性。不同种的微生物对某一种药物的抗性存在差异。某一种药物的抗性存在差异。应用此法要注意药物的浓度，过高会使融合频率降低，应用此法要注意药物的浓度，过高会使融合频率降低，过低则会使亲本生长，影响融合体的检出。过低则会使亲本生长，影响融合体的检出。AmprKanr融合体AmprKanrAB第45页/共6
23、2页 3.3.利用灭活原生质体检出融合体利用灭活原生质体检出融合体产朊假丝酵母原生质体与酿酒酵母原生质体融合时，用产朊假丝酵母原生质体与酿酒酵母原生质体融合时，用碘乙酸使产朊假丝酵母原生质体灭活，然后双亲原生质碘乙酸使产朊假丝酵母原生质体灭活，然后双亲原生质体融合，体融合，利用形态差异选择融合体利用形态差异选择融合体。灭活法的不足之处：菌丝碎片或未酶解的完整细胞具有灭活法的不足之处：菌丝碎片或未酶解的完整细胞具有更强的抗性，在选择培养基会优先形成菌落，从而抑制更强的抗性，在选择培养基会优先形成菌落，从而抑制融合体生长。融合体生长。第46页/共62页 4.4.利用荧光染色法选择融合体利用荧光染色
24、法选择融合体荧光染色法是事先使双亲染色而携带荧光染色法是事先使双亲染色而携带不同荧光不同荧光色素标记色素标记，然后在显微操作器和荧光显微镜下，然后在显微操作器和荧光显微镜下，挑取同时带有双亲原生质体荧光标记的融合体。挑取同时带有双亲原生质体荧光标记的融合体。第47页/共62页 5.5.利用双亲对碳源利用不同而检出融合体利用双亲对碳源利用不同而检出融合体利用亲株对各种碳源利用差异，结合其他特性利用亲株对各种碳源利用差异，结合其他特性分离筛选融合体。分离筛选融合体。不利用木糖，抗放线菌酮能利用木糖，对放线菌酮敏感含有木糖和放线菌酮的选择培养基上检出融合体第48页/共62页 6 6融合体的其他选择方
25、法融合体的其他选择方法利用某些微生物对昆虫的利用某些微生物对昆虫的毒力毒力进行选择（略）；进行选择（略）；通过通过形态差异形态差异进行融合体选择。这一方法首先要求所采用的菌进行融合体选择。这一方法首先要求所采用的菌株具有可供肉眼直接观察的形态学差异；株具有可供肉眼直接观察的形态学差异；通过通过生化测定指标生化测定指标选择融合体。通常测定的生化项目有选择融合体。通常测定的生化项目有DNA含含量、氨基酸含量、酸性磷酸酶、同工酶电泳等。量、氨基酸含量、酸性磷酸酶、同工酶电泳等。实际应用中往往是将上述这些方法结合使用。如将营养缺陷型与实际应用中往往是将上述这些方法结合使用。如将营养缺陷型与抗药性，抗药
26、性与原生质体灭活等相结合选择融合体。融合体检抗药性，抗药性与原生质体灭活等相结合选择融合体。融合体检出后，还要结合一些生化分析方法对其进一步鉴定。出后，还要结合一些生化分析方法对其进一步鉴定。第49页/共62页五、重组体检出鉴别与遗传特性分析五、重组体检出鉴别与遗传特性分析双亲融合后形成的双亲融合后形成的融合体不等于重组体融合体不等于重组体，而可能是异核体或杂合二倍体。异核体而可能是异核体或杂合二倍体。异核体细胞在繁殖过程中发生核的融合，形成细胞在繁殖过程中发生核的融合，形成杂合二倍体，通过染色体交换，产生各杂合二倍体，通过染色体交换，产生各种重组体。（种重组体。（异核体异核体-杂合二倍体杂合
27、二倍体-重组重组体体）异核体、杂合体以及重组体都能在选择异核体、杂合体以及重组体都能在选择培养基上生长。培养基上生长。单倍体单倍体单倍体单倍体繁殖传代异核体杂合体单倍体化第50页/共62页重组体常用的鉴别方法重组体常用的鉴别方法菌体或孢子形态和大小菌体或孢子形态和大小的比较；的比较；DNA含量含量的测定比较；的测定比较；同工酶同工酶电泳谱带的比较；电泳谱带的比较；酶活性酶活性的测定；的测定；代谢产物代谢产物组成和产量的分析比较与测定；组成和产量的分析比较与测定；对营养物质的利用对营养物质的利用以及以及超微结构超微结构的变化等。的变化等。第51页/共62页第第4 4节节 基因组改组育种基因组改组
28、育种 基因组改组基因组改组=诱变育种诱变育种+多亲本递推原生质体融多亲本递推原生质体融合合多亲本递推原生质体融合的特点：多亲本递推原生质体融合的特点：多个带有不同遗传性状的亲本，一般多个带有不同遗传性状的亲本，一般4-11个亲本；个亲本；递推式：融合重组后代可重复进行第二轮、第三轮，递推式：融合重组后代可重复进行第二轮、第三轮，甚至更多轮融合。甚至更多轮融合。第52页/共62页Genome ShufflingE.coli K12第53页/共62页Why genome shuffling?传统诱变育种与基因组改组育种比较Y.Zhang,et al.2002.Nature(415):644-646
29、.第54页/共62页Four multiple auxotrophes of Streptomyces(“one-marker”)phenotypeArgCysProUra“marker”(prototrophy)parent-1-+(U)parent-2-+-(P)parent-3-+-(C)parent-4+-(A)Progeny(protoplast hybrids)“two-marker”+-(AC,AP,AU,CP,CU,PU)“three-marker”+-(ACP,ACU,APU,CPU)“four-marker”+(ACPU)第55页/共62页Four multiple aux
30、otrophes of Streptomyces(“one-marker”)phenotypeArgCysProUra“marker”(prototrophy)parent-1-+(U)parent-2-+-(P)parent-3-+-(C)parent-4+-(A)Protoplast fusion-optimizing recombination efficiency Progeny(protoplast hybrids)“two-marker”+-“three-marker”+-“four-marker”+%in F110 0.4 0.00007%in F460(6倍)17(42.5倍)
31、2.5(35700倍)Recursive fusion of multiparent protoplasts is highly efficient第56页/共62页基因组改组育种的优势基因组改组育种的优势1.涉及多个亲本之间的重组，扩大了种群遗传的多样性，涉及多个亲本之间的重组，扩大了种群遗传的多样性，提高了种群内个体的作用；提高了种群内个体的作用；2.加速定向进化的速度，实现跳跃性进化。加速定向进化的速度，实现跳跃性进化。第57页/共62页应用实例一应用实例一2002年美国科学家在年美国科学家在Nature杂志上发表了一篇题目为杂志上发表了一篇题目为“Genome shuffling le
32、ads to rapid phenotypic improvement in bacteria”的论文。在该文中他们首次提出了基因组改的论文。在该文中他们首次提出了基因组改组组（genome shuffling）的概念，并运用基因组改组技术提高了弗氏链霉菌（）的概念，并运用基因组改组技术提高了弗氏链霉菌（Streptomyces fradiae）合成泰乐菌素（）合成泰乐菌素（tylosin）的能力。）的能力。他们首先对自然分离得到的泰乐菌素产生菌他们首先对自然分离得到的泰乐菌素产生菌SF1进行一次经典诱变育种，从进行一次经典诱变育种，从22000个菌株中个菌株中筛选得到筛选得到11个产量有所提
33、高的菌株作为递归原生质体融合（基因组改组）的亲本，进行循环个产量有所提高的菌株作为递归原生质体融合（基因组改组）的亲本，进行循环原生质体融合。原生质体融合。第58页/共62页最后从最后从1000株随机选择的菌株中筛选出株随机选择的菌株中筛选出7株产量最高的（其产量株产量最高的（其产量均明显高于均明显高于11株融合所用的亲本），进行第二轮循环原生质体融株融合所用的亲本），进行第二轮循环原生质体融合。合。经两轮循环原生质体融合，得到高产重排菌株经两轮循环原生质体融合，得到高产重排菌株GSl和和GS2，其生产，其生产能力分别达到能力分别达到8.1g/L和和6.2g/L，与经过，与经过20轮经典育种所
34、得到的高轮经典育种所得到的高产菌株产菌株SF21的生产能力（的生产能力（6.2g/L）相当，比出发株）相当，比出发株SFl的生产能的生产能力（力（1.0g/L）提高了）提高了9倍。倍。两轮基因组改组加上一次经典诱变育种共筛选了两轮基因组改组加上一次经典诱变育种共筛选了24000个菌株，个菌株，历时一年，而历时一年，而20轮经典育种共筛选了轮经典育种共筛选了1000000菌株，历时菌株，历时20年。年。第59页/共62页应用实例二应用实例二2002年在年在Nature Biotechnology上发表的另一例基上发表的另一例基因组改组的实例是乳酸杆菌耐酸菌株的选育。因组改组的实例是乳酸杆菌耐酸菌
35、株的选育。通过五轮循环原生质体融合得到的新菌株适合在出发菌通过五轮循环原生质体融合得到的新菌株适合在出发菌株不能生长的低株不能生长的低pH值值（pH3.5）培养环境中生长和分泌）培养环境中生长和分泌乳酸，因而大大提高了乳酸杆菌合成乳酸的能力。乳酸，因而大大提高了乳酸杆菌合成乳酸的能力。第60页/共62页课堂活动激光诱变育种激光诱变育种微波微波离子束诱变、离子注入离子束诱变、离子注入航天航天体外随机引物重组体外随机引物重组外显子改组外显子改组酶法体外随机酶法体外随机-定位诱变定位诱变合成改组合成改组截断状模板重组延伸截断状模板重组延伸退火低核苷酸基因重排退火低核苷酸基因重排非依赖序列同源性的重组法非依赖序列同源性的重组法第61页/共62页感谢您的观看！第62页/共62页