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1、Your Logo微生物原生质体融合育种微生物原生质体融合育种微生物原生质体融合育种微生物原生质体融合育种姓名：付凤根姓名：付凤根一、概述一、概述原生质体融合(protoplast fusion)是20世纪70年代发展起来的基因重组技术。原生质体：细胞内由原生质组成的各种结构统称为原生质体,包括细胞膜、细胞质(包括各种细胞器、细胞骨架系统及胞基质)和细胞核等部分,原生质体是由原生质特化而来。植物细胞即细胞壁内的原生质部分;动物细胞就是原生质体。原生质体融合：利用物理、化学或生物学方法，诱导遗传特性不同的两个亲本原生质体融合，经染色体交换、重组而达到杂交的目的，经筛选获得集双亲优良性状于一体的稳
2、定融合子。大幅提高亲本间的重组频率扩大重组的亲本范围原生质体融合时亲本整套染色体参与交换、遗传物质转移和重组性状较多，集中双亲优良性状机会更大。与常规杂交相比，原生质体融合具有的优势：不足之处：原生质体融合后DNA交换和重组随机发生，增加重组体分离筛选的难度。二、微生物原生质体融合步骤与方法二、微生物原生质体融合步骤与方法遗传标记亲株筛选原生质体制备原生质体再生原生质体融合异核体检出重组体检出和鉴定重组体的形态、生理生化和遗传分析原原原原生生生生质质质质体体体体融融融融合合合合步步步步骤骤骤骤根据融合的目的选择适宜的直接亲本。现在一般认为亲本应采用具有较大遗传差异的近亲菌株，重组后的新个体具有
3、更大的杂种优势。作为原生质体融合的二亲本都应该有一定的遗传标记，便于重组体的检出。常用的遗传标记有：带隐性性状的营养缺陷、抗性标记、热致死、孢子颜色和菌落形态等作为标记。实际应用时究竟采用哪各遗传标记，可以根据试验目的确定。1 1、亲本及遗传标记的选择、亲本及遗传标记的选择2、原生质体制备、原生质体制备原生质体的分离收集纯化活性鉴定保存制备流程制备原生质体，是原生质体技术的前提和基础，但是不同微生物的细胞壁组成各不相同，所以制备其原生质体的最佳条件也存在着很大差异。早期人们曾探索使用研磨等机械方法和超声波等物理方法来制备原生质，制备效果都不理想，目前人们主要运用酶法来制备原生质体。人们多倾向于
4、使用复合酶进行处理，常用的酶有纤维素酶、蜗牛酶和几丁质酶等 不同微生物在制备原生质体时所需酶和种类不同，而且所需酶量也存在着差异。适宜的酶浓度是影响原生质体制备的重要因素，酶浓度过大时，酶中往往含有对原生质体有害的酶类(如过氧化物酶、核糖核酸酶等)，随着酶量的增加，杂酶的浓度也会随之增加，当达到一定浓度时，必然会影响原生质体的活性；酶浓度过大，易使菌体凝集，难于原生质体化；而且，细胞脱壁太彻底，必然降低原生质体的再生率。2、原生质体制备、原生质体制备菌龄：在菌龄的选择上，多采用对数生长期或生长中后期的菌，这是因为，菌体的不同生理状态直接影响到细胞壁的结构，对数生长期细菌的细胞壁中肤聚糖含量最低
5、，细胞壁对酶的作用最敏感，但是对数生长早期的菌相对较为脆弱，受酶的过度作用会影响原生质体的再生率。酶解时间在原生质体制备过程中也是一个非常重要的因素。原生质体制备液的p H值，也可以直接影响到原生质体的制备。因为只有在最适p H值时，酶的活性才最高，酶促反应速率才最大 影响原生质体形成的因素：渗透压稳定剂：由于原生质体对渗透压非常敏感，渗透压稳定剂对于原生质体的制备起着重要作用。常用的渗透压稳定剂有KCl,NaCl,CaCl2,Mg SO4，等无机盐和蔗糖、甘露糖、山梨醇等，一般说来，丝状真菌以无机盐作为稳定剂比较适宜，而酵母菌则使用糖或醇做稳定剂比较好。原生质体再形成有生活能力的菌丝称为再生
6、。不同微生物的原生质体最适再生条件存在一定的差异 培养基：在再生培养基中会添加一些营养物质 这些物质可能是作为细胞壁合成的前体物质 也可能通过代谢转化成细胞壁的前体物质或起到促进代谢 加速细胞壁合成的作用。菌龄：菌龄过短的菌丝经酶解破壁形成小原生质体，有的细胞器不完全，营养供给不足再生能力也较低；菌龄长的原生质体再生率高。Ca2+：Ca2+主要是通过维系膜结构的完整性来实现原生质体的稳定性与活性。3、原生质体再生、原生质体再生原生质体悬浮液未酶解的细菌无菌水稀释高渗溶液稀释高渗溶液稀释培养培养培养计数再生率（%）=再生培养基上总菌落数酶处理后未原生质体化菌落数原生质体数100%总菌落数(A)未
7、原生质化细胞（B)再生菌落(C)=CBAB100%再生率及其计算再生率及其计算 所谓原生质体融合，就是将双亲株的微生物细胞分别通过酶解脱壁，使之形成原生质体，然后在高渗的条件下混合，并加人物理的或者化学的或者生物的助融条件，使双亲株的原生质体间发生相互凝集，通过细胞质融合，核融合，而后发生基因组间的交换重组，进而可以在适宜的条件下再生出微生物的细胞壁来，从而获得重组子的过程。4、原生质体融合、原生质体融合聚乙二醇是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚体。PEG 分子中常有醚键，使其显示出弱的负电荷，可与水、蛋白质、糖类分子的正电基团形成氢键，而使原生质体连在一起发生凝集，这种作用还可
8、以由于Ca+的存在而加强。为了发挥PEG 促进细胞融合的效力，必须采用较高的浓度(40 5 0%，分子量为6 0 0 0)，但PEG 在高浓度下，细胞可能因脱水而受到显著的破坏。因此，选择合适的分子量、浓度及作用时间是P E G融合技术的关键。PEG诱导细胞融合由于具有容易制备和控制、活性稳定、使用方便等特点，在细胞融合领域取得了可喜的成绩，大量的研究仍采用此法。虽然PE G 作为融合剂有很多成功的报道，但存在着对细胞损伤大、残存有毒性、融合率较低及经验性大等缺陷。近年来，一种物理融合技术 细胞电融合技术迅速崛起并显示出强大的生命力。PEG融合法融合法从野生型或突变型菌株中选择两亲本收集菌体，
9、酶解，获取原生质体以107108ml-1 的浓度混合加入30%50%PEG及适量的CaCl2、MgCl2维持在一定pH值的渗透压稳定剂中，适温处理110min再生培养基稀释45倍低速离心数分钟除去上清液，收集沉淀物0.1 mol/L CaCl2洗涤两次用融合液悬浮制备的融合体原生质融合过程原生质体融合的影响因素原生质体融合的影响因素JPEG浓度：PEG既是促融剂又是渗透压稳定剂，低浓度低分子量的PEG促融效果不好，也容易导致原生质体破裂。但是高浓度的PEG会导致原生质体收缩，降低融合频率，而且过高浓度的PEG对原生质体有毒害作用。一般为40%。J促融时间：促融时间增加可以使原生质体融合机会增多
10、，但是，PEG对原生质体有毒，为保证原生质体的再生能力，促融时间不宜过长。J无机离子：原生质体融合过程中需要一定量的 Ca2+和Mg2+促进融合，而 K+、Na+会显著降低融合率，融合时一般 Ca2+0.01 mol/L、Mg2+0.02 mol/L 为佳。各菌种间略有差异。融合体中除重组体外，还有异核体或部分结合子、杂合二倍体或杂合系，这些都会在平板上形成菌落，检出融合体的方法有多种，在育种工作中可根据实验目的和微生物的不同加以选择。1.利用营养缺陷型标记选择融合体2.利用抗药性选择融合体3.利用灭活原生质体检出融合体4.利用荧光染色法选择融合体5.双亲对碳源利用不同而检出融合体6.利用形态
11、差异检出5、融合体的检出与分离、融合体的检出与分离这是一种传统而有效的选择方法，其检出原则是：融合的双亲带有不同的营养缺陷型标记，在分离培养基上只有融合体生长而不能让双亲形成的原生质体形成菌落。其原理是因为缺陷型的双亲由于丧失了合成某种物质的能力，它们在基体培养基上不能生长、繁殖，部分单亲原生质体的同源融合体也不能在基体培养基上形成菌落，只有双亲原生质体的融合体因营养物质互补而形成菌落。利用营养缺陷型标记选择融合体利用营养缺陷型标记选择融合体 荧光染色法是事先使双亲染色而携带不同荧光色素标记，然后在显微操作器和荧光显微镜下，挑取现时带有双亲原生质体荧光标记的融合体，直接分离到再生培养基上再生，最后得到融合体。具体方法：制备原生质体时，在酶解液中加入荧光色素，使双亲分别携带有不同的荧光标记。它对原生质体活力无影响，携带色素的原生质体能正常进行融合并具有再生能力。使用这种方法时，两种荧光染料的区分要明显，并注意染料的浓度和处理时间。利用荧光染色法选择融合体利用荧光染色法选择融合体融合原生质体悬浮液稀释完全再生培养基选择性再生培养基培养培养重组体100%融合率（%）=选择性培养基上再生的菌落数完全培养基上再生的菌落数三、原生质体融合的应用三、原生质体融合的应用提高产量或质量，合成新物质改良菌种遗传物性优化菌种发酵物性质粒转移原生质体与细胞核融合进行遗传分析