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1、烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第第6 6章章 原生质体融合育种原生质体融合育种烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人本节重点本节重点l原生质体融合亲本及其遗传标记的选择原生质体融合亲本及其遗传标记的选择l原生质体制备原生质体制备l原生质体融合原生质体融合l检出融合体的方法检出融合体的方法烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人本
2、节难点本节难点l融合体和重组体的检出及鉴别的方法融合体和重组体的检出及鉴别的方法l提高重组效率的方法提高重组效率的方法烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第第1 1节节 微生物杂交育种微生物杂交育种概念：杂交育种通过微生物杂交将概念：杂交育种通过微生物杂交将不同菌不同菌株株的遗传物质进行的遗传物质进行交换、重组交换、重组，使不同菌，使不同菌株的优良特性株的优良特性集中集中于一个重组体中。于一个重组体中。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们
3、想一想如何来治疗该病人杂交杂交甲生长快、产量低生长快、产量低乙生长慢、产量高生长慢、产量高生长快、产量高生长快、产量高烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人应用应用 面面包包酵酵母母:对对麦麦芽芽糖糖及及葡葡萄萄糖糖的的发发酵酵力力强强，产产生生 COCO2 2 多，生长快；多，生长快；酒酒精精酵酵母母:产产酒酒率率高高，而而对对麦麦芽芽糖糖、葡葡萄萄糖糖的的发发酵力弱酵力弱 杂杂杂杂交交交交:就就得得到到了了既既能能生生产产酒酒精精，又又能能将将其其残残余余菌菌体用作面包厂和家用发面酵母的优良菌种。体用作
4、面包厂和家用发面酵母的优良菌种。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人杂交育种的优点：杂交育种的优点：a)可将两个或多个可将两个或多个优良性状优良性状集中在一个个体上。集中在一个个体上。b)由于杂交育种选用了由于杂交育种选用了已知性状已知性状的供体菌和受体菌作为亲本，因的供体菌和受体菌作为亲本，因此，不论在此，不论在方向性方向性还是还是自觉性自觉性方面，均比诱变育种前进了一大方面，均比诱变育种前进了一大步。步。c)利用杂交育种往往还可以消除某一菌株在经过长期诱变处理后利用杂交育种往往还可以消除某一菌株在经过
5、长期诱变处理后所出现的产量上升缓慢的现象。所出现的产量上升缓慢的现象。d)杂交育种有助于总结遗传物质的杂交育种有助于总结遗传物质的转移和传递转移和传递规律，丰富和促进规律，丰富和促进遗传学理论的发展。遗传学理论的发展。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人杂交育种缺陷：杂交育种缺陷：a)只能利用已有的基因组，并不能产生新的基因；只能利用已有的基因组，并不能产生新的基因；b)杂交杂交进程缓慢进程缓慢，过程繁琐，育种时间长；，过程繁琐，育种时间长；c)只能进行只能进行本物种或亲缘关系较近本物种或亲缘关系较近的物
6、种杂交，的物种杂交，不能克服远源杂交不亲和的障碍。不能克服远源杂交不亲和的障碍。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人微生物杂交的方式微生物杂交的方式原核：原核：原核：原核：接合接合 原生质体融合原生质体融合真核：真核：真核：真核：有性杂交有性杂交 准性杂交准性杂交 原生质体融合原生质体融合烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第第2 2节节 原生质体融合育种原生质体融合育种n原生质体:脱去细胞壁的植物、真菌或细菌细胞。
7、烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人原生质体融合原生质体融合l原生质体融合（原生质体融合（protoplast fusion）是）是20世纪世纪70年代发展起年代发展起来的育种技术。来的育种技术。l用水解酶除去遗传物质转移的最大障碍用水解酶除去遗传物质转移的最大障碍细胞壁，制成由细胞壁，制成由原生质膜包被的原生质膜包被的裸细胞裸细胞，然后用物理、化学或生物学方法，然后用物理、化学或生物学方法，诱导遗传特性不同的两亲本原生质体诱导遗传特性不同的两亲本原生质体融合融合，经染色体交换、，经染色体交换、重组而达到
8、重组而达到杂交杂交的目的，经筛选获得集双亲优良性状于一的目的，经筛选获得集双亲优良性状于一体的稳定体的稳定融合子融合子。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人Microbe AMicrobe BADD ENZYME烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人ADD FUSION PROMOTER烧伤病人
9、的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人原生质体融合原生质体融合原生质体融合原生质体融合烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人融合后再生融合后再生烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人原原生生质质体体融融合合后后基基因因重重组组烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治
10、疗该病人与常规杂交相比，原生质体融合具有多方面的优势与常规杂交相比，原生质体融合具有多方面的优势 大幅度提高亲本之间大幅度提高亲本之间重组频率重组频率。扩大重组的扩大重组的亲本范围亲本范围。原生质体融合时亲本整套染色体参与交换，遗传原生质体融合时亲本整套染色体参与交换，遗传物质转移和重组性状较多，集中双亲本物质转移和重组性状较多，集中双亲本优良性状优良性状机会更大。机会更大。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人不足之处不足之处原生质体融合后原生质体融合后DNADNA交换和重组随机发生，增加重交换和重组随机
11、发生，增加重组体组体分离筛选分离筛选的难度。的难度。细胞对异体遗传物质的降解和排斥作用，以及遗细胞对异体遗传物质的降解和排斥作用，以及遗传物质非同源性等因素也会影响原生质体融合的传物质非同源性等因素也会影响原生质体融合的重组频率，使重组频率，使远缘融合杂交远缘融合杂交存在较大困难。存在较大困难。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第第3 3节节 原生质体融合育种的步骤原生质体融合育种的步骤一、直接亲本及其遗传标记的选择一、直接亲本及其遗传标记的选择二、原生质体制备与再生二、原生质体制备与再生三、原生质体融
12、合三、原生质体融合四、融合体再生与检出四、融合体再生与检出五、重组体检出鉴别与遗传特性分析五、重组体检出鉴别与遗传特性分析烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人 一、直接亲本及其遗传标记的选择一、直接亲本及其遗传标记的选择原生质体融合的亲本应采用具有较大遗传差原生质体融合的亲本应采用具有较大遗传差异的近亲菌株，重组后的新个体具有更大的异的近亲菌株，重组后的新个体具有更大的杂种优势杂种优势。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗
13、该病人一、直接亲本及其遗传标记的选择一、直接亲本及其遗传标记的选择l作为原生质体融合的二亲本菌株都应该带有一定的遗传标作为原生质体融合的二亲本菌株都应该带有一定的遗传标记，便于重组体的检出。记，便于重组体的检出。l常用遗传标记：常用遗传标记：（何谓何谓“遗传标记遗传标记”）营养缺陷营养缺陷抗性抗性热致死（灭活）热致死（灭活）孢子颜色孢子颜色菌落形态菌落形态 烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人热致死（灭活）热致死（灭活）l把双亲中任何一方的原生质体用热灭把双亲中任何一方的原生质体用热灭活（如活（如50，2
14、h或或60，5 min)或用或用紫外线、药物灭活，使细胞内的某些紫外线、药物灭活，使细胞内的某些酶或代谢途径钝化（核酸不变性）酶或代谢途径钝化（核酸不变性），然后和另一方具有正常活性的原生质然后和另一方具有正常活性的原生质体融合而获得重组体。体融合而获得重组体。l采用灭活标记融合频率较低，但重组采用灭活标记融合频率较低，但重组体产量较高。体产量较高。灭活灭活正常活性正常活性正常活性正常活性正常活性正常活性无活性无活性A B烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人 二、原生质体制备与再生二、原生质体制备与再生（
15、一）原生质体制备（一）原生质体制备l制备大量具有活性的原生质体是微生物原生制备大量具有活性的原生质体是微生物原生质体融合育种的前提。质体融合育种的前提。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人1.1.原生质体制备方法原生质体制备方法l机械法、非酶分离法和机械法、非酶分离法和酶法酶法。l采用前两种方法制备的原生质体效果差，活采用前两种方法制备的原生质体效果差，活性低，仅适用于某些特定菌株。性低，仅适用于某些特定菌株。l最有效和最常用的是酶法。该法时间短，效最有效和最常用的是酶法。该法时间短，效果好。果好。烧伤病
16、人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人Protoplast fusionProtoplast fusion allows genetic improvement(random mutation&recombination)of asexual micro-organisms protoplasts preparation:cells are grown in isotonic solution while inhibiting growth of cell wall,and partly dissociation
17、 it(lysozyme)烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人 2.2.原生质体的鉴定原生质体的鉴定(1)低渗爆破法低渗爆破法：直接在显微镜下观察原生质体在：直接在显微镜下观察原生质体在低渗溶液中吸水膨胀、破裂的过程。低渗溶液中吸水膨胀、破裂的过程。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人2.2.原生质体的鉴定原生质体的鉴定(2)荧光染色法荧光染色法：原生质体混悬液用荧光增白剂（：原生质体混悬液用荧光增白剂（VBL）染）
18、染色，洗涤后在荧光显微镜下观察，发出红色光则为完全原色，洗涤后在荧光显微镜下观察，发出红色光则为完全原生质体，发出绿色光则表明还有细胞壁成分存在。生质体，发出绿色光则表明还有细胞壁成分存在。（区别（区别细胞壁与细胞膜的不同）细胞壁与细胞膜的不同）烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人 3.3.原生质体的收集和纯化原生质体的收集和纯化l纯化方法有以下几种（纯化方法有以下几种（这些方法基于什么原理？这些方法基于什么原理？）(1)过滤法过滤法(2)密度梯度离心法密度梯度离心法(3)界面法界面法(4)漂浮法漂浮法l
19、通常采用离心法。通常采用离心法。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人(1)(1)过滤法过滤法l根据细胞大小，选用孔根据细胞大小，选用孔径略小于细胞的砂芯漏径略小于细胞的砂芯漏斗，过滤。斗，过滤。l原生质体由于外层细胞原生质体由于外层细胞膜柔软可膜柔软可变形变形，可以由，可以由比它小的微孔中穿过，比它小的微孔中穿过，而未酶解细胞或细胞团而未酶解细胞或细胞团却不能。却不能。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人(2)(2)
20、密度梯度离心法密度梯度离心法l用蔗糖或氯化铯等制成浓度用蔗糖或氯化铯等制成浓度（密度）梯度溶液，由于密（密度）梯度溶液，由于密度差别，经离心后原生质体度差别，经离心后原生质体漂浮于上部，未酶解细胞和漂浮于上部，未酶解细胞和细胞碎片沉于溶液下部。细胞碎片沉于溶液下部。原生质体原生质体细胞碎片、细胞碎片、未酶解细胞未酶解细胞烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人(3)(3)界面法界面法l原理：原理：选两种不同浓度的溶液，其中一种溶液密度大于原选两种不同浓度的溶液，其中一种溶液密度大于原生质体的密度，另一种溶液小
21、于原生质体的密度。生质体的密度，另一种溶液小于原生质体的密度。离心后离心后原生质体就集中在两层液面交界处而得到纯化。原生质体就集中在两层液面交界处而得到纯化。原生质体原生质体13%甘露醇溶液甘露醇溶液25%蔗糖溶液蔗糖溶液烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人(4)(4)漂浮法漂浮法l适用于一些细胞较大的微生物。适用于一些细胞较大的微生物。l原生质体与细胞比重不同，原生质体的比重小于细胞，能原生质体与细胞比重不同，原生质体的比重小于细胞，能在一定浓度的溶液中漂浮在液面上，从而得到纯化。在一定浓度的溶液中漂浮
22、在液面上，从而得到纯化。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人 4.4.原生质体的活力鉴定原生质体的活力鉴定l分离纯化后的原生质体，用作再生或融合等育种的出发材分离纯化后的原生质体，用作再生或融合等育种的出发材料，必须具有活力及再生能力，因此需要进行活力鉴定。料，必须具有活力及再生能力，因此需要进行活力鉴定。l原生质体活力鉴定方法主要有：原生质体活力鉴定方法主要有：（注意区别注意区别）荧光素双醋酸盐染色法荧光素双醋酸盐染色法酚藏花红染色法酚藏花红染色法伊文思蓝染色法伊文思蓝染色法烧伤病人的治疗通常是取烧伤病
23、人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人荧光素双醋酸盐（荧光素双醋酸盐（FDAFDA）染色法）染色法FDA本身不发荧光，被细胞吸收本身不发荧光，被细胞吸收脂解脂解后产生具有荧光后产生具有荧光的物质。能发出荧光的原生质体具有活性；（的物质。能发出荧光的原生质体具有活性；（吸收吸收-代代谢谢-呈色呈色）烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人酚藏花红染色法酚藏花红染色法活性原生质体能吸收酚活性原生质体能吸收酚藏花红染料而成藏花红染料而成红色红色，无，无活性
24、的死细胞不能吸收染活性的死细胞不能吸收染料呈白色料呈白色;（吸收（吸收-呈色）呈色）伊文思蓝染色法伊文思蓝染色法活性原生质体不吸附活性原生质体不吸附染料为无色，死的无染料为无色，死的无活性细胞吸附染料呈活性细胞吸附染料呈蓝色。蓝色。（不吸收（不吸收-呈呈色）色）烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人 5.5.原生质体的保存原生质体的保存l原生质体新鲜程度与其活性有关。原生质体新鲜程度与其活性有关。l如果不是立即使用，则必须在低温下保存。但是如果不是立即使用，则必须在低温下保存。但是保藏时间很短。保藏时间很短
25、。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人（二）原生质体再生（二）原生质体再生l原生质体融合试验之前必须摸索出最佳的再生条件和完成原生质体融合试验之前必须摸索出最佳的再生条件和完成再生实验，为融合体再生和复原做好准备。再生实验，为融合体再生和复原做好准备。l原生质体必须重新合成细胞壁物质，恢复至完整细胞形态，原生质体必须重新合成细胞壁物质，恢复至完整细胞形态，才能进一步生长、分裂和增殖，这一过程就是原生质体的才能进一步生长、分裂和增殖，这一过程就是原生质体的再生。再生。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤
26、进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人影响原生质体再生的因素（略）影响原生质体再生的因素（略）n菌体生理状态菌体生理状态n稳定剂稳定剂n酶浓度与酶作用时间酶浓度与酶作用时间n再生培养基的组成再生培养基的组成n原生质体的密度原生质体的密度烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人 三、原生质体融合三、原生质体融合（一）融合剂和融合手段（一）融合剂和融合手段l化学融合剂，化学融合剂，普遍采用普遍采用PEG介导的化学融合法。介导的化学融合法。在在PEG介导融合时，通常需
27、要一定浓度的介导融合时，通常需要一定浓度的Ca2+和和Mg2+，能更有效地，能更有效地促进融合。促进融合。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人（一）融合剂和融合手段（一）融合剂和融合手段n物理融合手段物理融合手段，电融合，电融合细胞产生偶极化，原生质体相互粘连，细胞沿电力方向排列成串；细胞产生偶极化，原生质体相互粘连，细胞沿电力方向排列成串；在外加瞬间高频直流强电压作用下，扰乱原生质体膜的分子排列，在外加瞬间高频直流强电压作用下，扰乱原生质体膜的分子排列，使之穿孔，然后发生原生质体膜复原过程，原生质体发生
28、融合。使之穿孔，然后发生原生质体膜复原过程，原生质体发生融合。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人电场作用下原生质膜被击穿的过程电场作用下原生质膜被击穿的过程 烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人（二）原生质体融合过程（二）原生质体融合过程l在高渗稳定液中，两个或两个以上凝聚成团，相邻原生质在高渗稳定液中，两个或两个以上凝聚成团，相邻原生质体紧密接触的质膜面扩大，相互接触的质膜消失，细胞质体紧密接触的质膜面扩大，相互
29、接触的质膜消失，细胞质融合，形成一个异核体细胞；融合，形成一个异核体细胞；烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人 四、融合体再生与检出四、融合体再生与检出（一）融合体再生（一）融合体再生l融合体的再生，包括融合体细胞壁合成、重建和融合体的融合体的再生，包括融合体细胞壁合成、重建和融合体的再生。再生。l原生质体复原后，细胞的生理和生物学特性可恢复正常状原生质体复原后，细胞的生理和生物学特性可恢复正常状态。但一些质粒可能会脱落。态。但一些质粒可能会脱落。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对
30、于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人（二）融合体的检出与分离（二）融合体的检出与分离1.利用利用营养缺陷型营养缺陷型标记选择融合体标记选择融合体2.利用利用抗药性抗药性选择融合体选择融合体3.利用利用灭活原生质体灭活原生质体检出融合体检出融合体4.利用利用荧光染色法荧光染色法选择融合体选择融合体5.利用利用双亲对碳源利用不同双亲对碳源利用不同而检出融合而检出融合体体ABABAABB烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人 1 1利用营养缺陷型标记选择融合体利用营养缺陷型标记选择
31、融合体l融合的双亲带有不同营养缺陷型标记，在基本培养基上融合的双亲带有不同营养缺陷型标记，在基本培养基上只只有融合体生长有融合体生长而双亲本原生质体不能形成菌落。而双亲本原生质体不能形成菌落。l此法较为准确可靠，缺点是易使部分表型延迟的融合体漏此法较为准确可靠，缺点是易使部分表型延迟的融合体漏选、工作量大，且营养缺陷型标记会使亲本的优良性状丧选、工作量大，且营养缺陷型标记会使亲本的优良性状丧失或降低。失或降低。融合体融合体AB烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人 2.2.利用抗药性选择融合体利用抗药性选择
32、融合体l微生物的抗药性是菌种的重要特性。不同种的微生物对某微生物的抗药性是菌种的重要特性。不同种的微生物对某一种药物的抗性存在差异。一种药物的抗性存在差异。l应用此法要注意药物的浓度，过高会使融合频率降低，过应用此法要注意药物的浓度，过高会使融合频率降低，过低则会使亲本生长，影响融合体的检出。低则会使亲本生长，影响融合体的检出。AmprKanr融合体融合体AmprKanrAB烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人 3.3.利用灭活原生质体检出融合体利用灭活原生质体检出融合体l产朊假丝酵母原生质体与酿酒酵母原
33、生质体融合时，用碘产朊假丝酵母原生质体与酿酒酵母原生质体融合时，用碘乙酸使产朊假丝酵母原生质体灭活，然后双亲原生质体融乙酸使产朊假丝酵母原生质体灭活，然后双亲原生质体融合，合，利用形态差异选择融合体利用形态差异选择融合体。l灭活法的不足之处：菌丝碎片或未酶解的完整细胞具有更灭活法的不足之处：菌丝碎片或未酶解的完整细胞具有更强的抗性，在选择培养基会优先形成菌落，从而抑制融合强的抗性，在选择培养基会优先形成菌落，从而抑制融合体生长。体生长。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人 4.4.利用荧光染色法选择融合体
34、利用荧光染色法选择融合体l荧光染色法是事先使双亲染色而携带荧光染色法是事先使双亲染色而携带不同荧光色不同荧光色素标记素标记，然后在显微操作器和荧光显微镜下，挑，然后在显微操作器和荧光显微镜下，挑取同时带有双亲原生质体荧光标记的融合体。取同时带有双亲原生质体荧光标记的融合体。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人 5.5.利用双亲对碳源利用不同而检出融合体利用双亲对碳源利用不同而检出融合体l利用亲株对各种碳源利用差异，结合其他特性分利用亲株对各种碳源利用差异，结合其他特性分离筛选融合体。离筛选融合体。不利用不
35、利用木糖木糖，抗，抗放线菌酮放线菌酮能利用能利用木糖木糖，对，对放线菌酮放线菌酮敏感敏感含有木糖和放线菌酮的选择培养基上检出融合体含有木糖和放线菌酮的选择培养基上检出融合体烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人 6 6融合体的其他选择方法融合体的其他选择方法l利用某些微生物对昆虫的利用某些微生物对昆虫的毒力毒力进行选择（略）；进行选择（略）；l通过通过形态差异形态差异进行融合体选择。这一方法首先要求所采用的菌株具进行融合体选择。这一方法首先要求所采用的菌株具有可供肉眼直接观察的形态学差异；有可供肉眼直接观察
36、的形态学差异；l通过通过生化测定指标生化测定指标选择融合体。通常测定的生化项目有选择融合体。通常测定的生化项目有DNA含量、含量、氨基酸含量、酸性磷酸酶、同工酶电泳等。氨基酸含量、酸性磷酸酶、同工酶电泳等。实际应用中往往是将上述这些方法结合使用。如将营养缺陷型与抗药实际应用中往往是将上述这些方法结合使用。如将营养缺陷型与抗药性，抗药性与原生质体灭活等相结合选择融合体。融合体检出后，还性，抗药性与原生质体灭活等相结合选择融合体。融合体检出后，还要结合一些生化分析方法对其进一步鉴定。要结合一些生化分析方法对其进一步鉴定。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲
37、，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人五、重组体检出鉴别与遗传特性分析五、重组体检出鉴别与遗传特性分析n双亲融合后形成的双亲融合后形成的融合体不等于重组体融合体不等于重组体，而可能是异核体或杂合二倍体。异核体细而可能是异核体或杂合二倍体。异核体细胞在繁殖过程中发生核的融合，形成杂合胞在繁殖过程中发生核的融合，形成杂合二倍体，通过染色体交换，产生各种重组二倍体，通过染色体交换，产生各种重组体。（体。（异核体异核体-杂合二倍体杂合二倍体-重组体重组体）n异核体、杂合体以及重组体都能在选择培异核体、杂合体以及重组体都能在选择培养基上生长。养基上生长。单倍体单倍体单倍体单倍体繁殖传代繁殖传代
38、异核体异核体杂合体杂合体单倍体化单倍体化烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人重组体常用的鉴别方法重组体常用的鉴别方法l菌体或孢子形态和大小菌体或孢子形态和大小的比较；的比较；lDNA含量含量的测定比较；的测定比较；l同工酶同工酶电泳谱带的比较；电泳谱带的比较；l酶活性酶活性的测定；的测定；l代谢产物代谢产物组成和产量的分析比较与测定；组成和产量的分析比较与测定；l对营养物质的利用对营养物质的利用以及以及超微结构超微结构的变化等。的变化等。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧
39、伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第第4 4节节 基因组改组育种基因组改组育种 基因组改组基因组改组=诱变育种诱变育种+多亲本递推原生质体融合多亲本递推原生质体融合多亲本递推原生质体融合的特点：多亲本递推原生质体融合的特点：多个带有不同遗传性状的亲本，一般多个带有不同遗传性状的亲本，一般4-11个亲本；个亲本；递推式：融合重组后代可重复进行第二轮、第三轮，递推式：融合重组后代可重复进行第二轮、第三轮，甚至更多轮融合。甚至更多轮融合。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人Genome
40、ShufflingE.coli K12烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人Why genome shuffling?传统诱变育种与基因组改组育种比较传统诱变育种与基因组改组育种比较Y.Zhang,et al.2002.Nature(415):644-646.烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人Four multiple auxotrophes of Streptomyces(“one-marker”)phenotyp
41、eArgCysProUra“marker”(prototrophy)parent-1-+(U)parent-2-+-(P)parent-3-+-(C)parent-4+-(A)Progeny(protoplast hybrids)“two-marker”+-(AC,AP,AU,CP,CU,PU)“three-marker”+-(ACP,ACU,APU,CPU)“four-marker”+(ACPU)烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人Four multiple auxotrophes of Strepto
42、myces(“one-marker”)phenotypeArgCysProUra“marker”(prototrophy)parent-1-+(U)parent-2-+-(P)parent-3-+-(C)parent-4+-(A)Protoplast fusion-optimizing recombination efficiency Progeny(protoplast hybrids)“two-marker”+-“three-marker”+-“four-marker”+%in F110 0.4 0.00007%in F460(6倍)17(42.5倍)2.5(35700倍)Recursiv
43、e fusion of multiparent protoplasts is highly efficient烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人基因组改组育种的优势基因组改组育种的优势1.涉及多个亲本之间的重组，扩大了种群遗传的多样性，涉及多个亲本之间的重组，扩大了种群遗传的多样性，提高了种群内个体的作用；提高了种群内个体的作用；2.加速定向进化的速度，实现跳跃性进化。加速定向进化的速度，实现跳跃性进化。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同
44、学们想一想如何来治疗该病人应用实例一应用实例一l2002年美国科学家在年美国科学家在Nature杂志上发表了一篇题目为杂志上发表了一篇题目为“Genome shuffling leads to rapid phenotypic improvement in bacteria”的论文。的论文。在该文中他们首次提出了基因组改组在该文中他们首次提出了基因组改组（genome shuffling）的概念，）的概念，并运用基因组改组技术提高了弗氏链霉菌（并运用基因组改组技术提高了弗氏链霉菌（Streptomyces fradiae）合）合成泰乐菌素（成泰乐菌素（tylosin）的能力。）的能力。l他们首
45、先对自然分离得到的泰乐菌素产生菌他们首先对自然分离得到的泰乐菌素产生菌SF1进行一次经典诱变育进行一次经典诱变育种，从种，从22000个菌株中筛选得到个菌株中筛选得到11个产量有所提高的菌株作为递归原个产量有所提高的菌株作为递归原生质体融合（基因组改组）的亲本，进行循环原生质体融合。生质体融合（基因组改组）的亲本，进行循环原生质体融合。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人l最后从最后从1000株随机选择的菌株中筛选出株随机选择的菌株中筛选出7株产量最高的（其产量均明株产量最高的（其产量均明显高于显高于11
46、株融合所用的亲本），进行第二轮循环原生质体融合。株融合所用的亲本），进行第二轮循环原生质体融合。l经两轮循环原生质体融合，得到高产重排菌株经两轮循环原生质体融合，得到高产重排菌株GSl和和GS2，其生产能，其生产能力分别达到力分别达到8.1g/L和和6.2g/L，与经过，与经过20轮经典育种所得到的高产菌株轮经典育种所得到的高产菌株SF21的生产能力（的生产能力（6.2g/L）相当，比出发株）相当，比出发株SFl的生产能力（的生产能力（1.0g/L）提高了提高了9倍。倍。l两轮基因组改组加上一次经典诱变育种共筛选了两轮基因组改组加上一次经典诱变育种共筛选了24000个菌株，历时个菌株，历时一年
47、，而一年，而20轮经典育种共筛选了轮经典育种共筛选了1000000菌株，历时菌株，历时20年。年。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人应用实例二应用实例二l2002年在年在Nature Biotechnology上发表的另一例基因组上发表的另一例基因组改组的实例是乳酸杆菌耐酸菌株的选育。改组的实例是乳酸杆菌耐酸菌株的选育。l通过五轮循环原生质体融合得到的新菌株适合在出发菌株通过五轮循环原生质体融合得到的新菌株适合在出发菌株不能生长的低不能生长的低pH值值（pH3.5）培养环境中生长和分泌乳酸，）培养环境中生长和分泌乳酸，因而大大提高了乳酸杆菌合成乳酸的能力。因而大大提高了乳酸杆菌合成乳酸的能力。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人课堂活动激光诱变育种激光诱变育种微波微波离子束诱变、离子注入离子束诱变、离子注入航天航天体外随机引物重组体外随机引物重组外显子改组外显子改组酶法体外随机酶法体外随机-定位诱变定位诱变合成改组合成改组截断状模板重组延伸截断状模板重组延伸退火低核苷酸基因重排退火低核苷酸基因重排非依赖序列同源性的重组法非依赖序列同源性的重组法