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1、关于酶的化学修饰现在学习的是第1页，共53页一、为什么要对酶进行化学修饰 虽虽然然酶酶催催化化化化学学反反应应有有专专一一性性强强、效效率率高高、条条件件温温和和等等优优点点，但但也也有有一一些些严严重重的的缺缺点点，正正是是这这些些缺缺点点使使得得酶酶的的应应用用受受到到很很大大的的限限制制，酶酶的的用用途途还还不不够够广广泛泛，大大规规模使用酶的工业生产还很少。模使用酶的工业生产还很少。现在学习的是第2页，共53页酶应用的缺点a.稳稳定定性性：酶酶是是由由细细胞胞产产生生的的生生物物活活性性大大分分子子，一一旦旦离离开开细细胞胞这这个个特特殊殊的的环环境境，常常常常显显得得不不够够稳稳定定
2、，容容易易变变性性失活。失活。b.催催化化反反应应时时的的条条件件：一一般般酶酶反反应应是是在在pH基基本本接接近近中中性性，温温度度接接近近室室温温的的水水溶溶液液中中进进行行的的。但但在在工工业业应应用用上上，由由于于底底物物和和产产物物带带来来的的影影响响，反反应应时时的的pH常常常常不不在在中中性性范范围围内内。温温度度升升高高有有利利于于提提高高反反应应速速度度，但但酶酶失失活也加快。当底物不溶于水时，酶难以发挥作用。活也加快。当底物不溶于水时，酶难以发挥作用。现在学习的是第3页，共53页酶应用的缺点c.酶酶的的主主要要动动力力学学性性质质不不适适应应：米米氏氏常常数数(Km)值值过
3、过大大时时，反反应应不不能能在在低低底底物物浓浓度度下下高高速速进进行行。由由于于人人体体内内各各种种代代谢谢物物质质的的浓浓度度通通常常较较低低，Km值值过过大大的的酶酶用用于于临临床床检检测测和和治治疗疗时时，往往往往不不能能得得到到良良好好的的效效果果。有有些些底底物物或或产产物物对对酶酶活活性性有有抑抑制制作作用用，也也会会影影响酶反应的速度。响酶反应的速度。现在学习的是第4页，共53页酶应用的缺点d.临临床床应应用用的的特特殊殊要要求求：当当前前临临床床应应用用的的大大多多数数酶酶来来自自动动物物、植植物物和和微微生生物物，对对人人体体来来说说这这些些酶酶都都是是外外源源蛋蛋白白质质
4、，它它们们具具有有抗抗原原性性，有有可可能能引引起起人人体体的的过过敏敏反反应应。这这不不但但影影响响临临床床上上的的连连续续使使用用，还还可可能能导导致致生生命命危危险险。另另外外，酶酶进进入入人人体体后后也也常常会会因因一一些些蛋蛋白白酶酶、抑抑制制剂剂或或抗抗体体的的作作用用而而失失去去活活性性，特特别别是是当当酶酶进进入入人人体体后后不不能能迅迅速速到到达达或或集集中中于于病病灶灶时时，这这种情况尤为明显。种情况尤为明显。现在学习的是第5页，共53页酶改造的两个水平基基因因水水平平：有有目目的的的的改改变变基基因因中中的的核核苷苷酸酸顺顺序序，从从而而改改变变酶酶的的氨氨基基酸酸顺顺序
5、序，以以期期获获得得化化学学结结构构更更为为合合理理的的酶蛋白。这是蛋白质工程的研究内容。酶蛋白。这是蛋白质工程的研究内容。蛋蛋白白质质水水平平：人人们们用用化化学学法法或或酶酶法法对对已已合合成成的的酶酶的的结结构构进进行行改改造造，一一方方面面是是切切除除部部分分肽肽链链和和置置换换某某些些氨氨基基酸酸，另另一一方方面面是是使使酶酶分分子子中中的的某某些些氨氨基基酸酸残残基基与与一一些些化化学学试试剂剂反反应应，加加上上一一些些特特定定的的基基团团，即即酶酶的的化化学学修修饰饰。由由于于后后一一方方面面技技术术较较为为简简单单，容容易易见见效效，所所以以这这方方面面的工作做得最多。的工作做
6、得最多。现在学习的是第6页，共53页二、酶化学修饰的基本原理1提高酶的热稳定性提高酶的热稳定性 高高度度有有序序的的天天然然构构象象是是酶酶表表现现活活性性的的必必要要条条件件，天天然然构构象象是是在在酶酶分分子子内内各各种种次次级级键键（氢氢键键、离离子子键键、范范德德华华力力）的的作作用用下下维维持持的的。当当温温度度升升高高时时，有有些些次次级级键键遭遭到到了了破破坏坏，原原先先平平衡衡的的力力失失去去了了平平衡衡，导导致致分分子子的的构构象象发发生生变变化化，并并可可能能产产生生一一些些新新的的次次级级键键，形形成成有有序序度度降降低低的的新新构构象象，使使酶酶变变性性失失活活。通通过
7、过酶酶与与化化学学修修饰饰剂剂的的反反应应，有有可可能能使使酶酶的的天天然然构构象象产产生生“刚刚性性”，不不易易发发生生变变化化，同同时时减减少少分分子内基团的热振动，从而增强了酶的热稳定性。子内基团的热振动，从而增强了酶的热稳定性。现在学习的是第7页，共53页酶化学修饰的基本原理2抗抑制剂抗抑制剂 酶酶活活性性抑抑制制剂剂是是通通过过直直接接结结合合于于酶酶的的活活性性部部位位来来阻阻止止酶酶与与底底物物的的结结合合，或或是是结结合合于于酶酶的的其其它它部部位位后后，影影响响了了酶酶活活性性部部位位将将底底物物转转变变成成产产物物。因因此此，阻阻止止抑抑制制剂剂与与酶酶的的结结合合是是防防
8、止止酶酶活活性性被被抑抑制制的的关关键键。酶酶经经过过化化学学修修饰饰交交联联上上大大分分子子修修饰饰剂剂后后，大大分分子子修修饰饰剂剂产产生生的的空空间间障障碍碍或或静静电电斥斥力力就就可可能能有有效效地地阻阻挡挡抑抑制制剂剂与与酶酶的的结结合合，使使酶酶抗抗抑抑制制剂的能力增强。剂的能力增强。现在学习的是第8页，共53页酶化学修饰的基本原理3抗蛋白水解酶抗蛋白水解酶 酶酶分分子子的的基基本本结结构构是是蛋蛋白白质质，所所以以易易受受蛋蛋白白酶酶的的攻攻击击而而遭遭破破坏坏。蛋蛋白白酶酶一一般般是是作作用用于于某某些些特特定定氨氨基基酸酸残残基基之之间间的的酰酰胺胺键键，修修饰饰这这些些氨氨
9、基基酸酸残残基基，可可以以阻阻止止蛋蛋白白酶酶对对这这些些酰酰胺胺键键的的攻攻击击。另另外外，交交联联于于酶酶分分子子上上的的大大分分子子修修饰饰剂剂能能产产生生空空间间障障碍碍，阻阻止止蛋蛋白白酶酶接接近近攻攻击击点点，起起到到“遮盖遮盖”敏感键的作用。敏感键的作用。现在学习的是第9页，共53页酶化学修饰的基本原理4降低酶的抗原性降低酶的抗原性 酶酶分分子子中中有有些些氨氨基基酸酸残残基基组组成成了了抗抗原原决决定定簇簇，当当外外源源蛋蛋白白进进入入人人体体后后就就会会诱诱发发产产生生抗抗体体，抗抗原原抗抗体体反反应应不不仅仅会会使使酶酶失失活活，而而且且会会对对人人体体造造成成伤伤害害和和
10、危危险险。通通过过化化学学修修饰饰，有有些些组组成成抗抗原原决决定定簇簇的的基基团团与与修修饰饰剂剂形形成成了了共共价价键键，破破坏坏了了抗抗原原决决定定簇簇的的结结构构，使使酶酶分分子子的的抗抗原原性性降降低低甚甚至至消消除除。大大分分子子修修饰饰剂剂也也有有“遮遮盖盖”抗抗原原决决定定簇簇和和阻阻止止抗抗原原抗抗体体结结合的作用。合的作用。现在学习的是第10页，共53页酶化学修饰的基本原理5稳定酶的微环境稳定酶的微环境 由由于于酶酶分分子子各各基基团团的的极极性性和和带带电电荷荷的的不不同同，以以及及各各基基团团间间相相互互作作用用的的结结果果，使使酶酶分分子子的的局局部部形形成成了了一一
11、种种微微环环境境。这这种种微微环环境境可可以以是是极极性性的的，也也可可以以是是非非极极性性的的，但但都都直直接接影影响响着着酶酶活活性性部部位位氨氨基基酸酸残残基基的的电电离离状状态态，酶酶微微环环境境的的改改变变会会对对酶酶的的催催化化功功能能产产生生直直接接的的影响。影响。酶酶经经过过化化学学修修饰饰后后，除除能能稳稳定定酶酶的的构构象象外外，还还由由于于大大分分子子修修饰饰剂剂本本身身就就是是多多聚聚电电荷荷体体，可可在在酶酶分分子子表表面面形形成成一一层层“缓缓冲冲外外壳壳”，在在一一定定程程度度上上保保护护酶的微环境，使酶能在更广泛的条件下发挥作用。酶的微环境，使酶能在更广泛的条件
12、下发挥作用。现在学习的是第11页，共53页三、酶化学修饰方法的设计 酶酶化化学学修修饰饰的的基基本本原原则则都都是是充充分分利利用用修修饰饰剂剂所所具具有有的的各各类类化化学学基基团团的的特特性性，直直接接或或经经过过一一定定的的活活化化过过程后与酶分子上的某种氨基酸残基产生化学反应。程后与酶分子上的某种氨基酸残基产生化学反应。现在学习的是第12页，共53页设计酶化学修饰方法时的注意事项 a.对修饰剂的要求对修饰剂的要求 在在选选择择修修饰饰剂剂时时一一般般要要求求修修饰饰剂剂有有较较大大的的分分子子量量，良良好好的的生生物物相相容容性性和和水水溶溶性性，修修饰饰剂剂分分子子表表面面有有较较多
13、多的的反反应应活活性性基基团团，与与氨氨基基酸酸残残基基形形成成的的共共价价键键稳稳定定，容容易易鉴定鉴定。b.对酶性质的了解对酶性质的了解 应应了了解解被被修修饰饰酶酶的的活活性性部部位位情情况况，活活性性部部位位由由哪哪些些氨氨基基酸酸残残基基组组成成。酶酶的的稳稳定定条条件件，酶酶反反应应的的最最适适条条件件，有有哪哪些些侧侧链基团可供修饰，及这些基团的化学性质和反应活泼性等。链基团可供修饰，及这些基团的化学性质和反应活泼性等。现在学习的是第13页，共53页设计酶化学修饰方法时的注意事项c.修饰反应条件的选择修饰反应条件的选择 修修饰饰反反应应一一般般总总是是尽尽可可能能在在酶酶稳稳定定
14、的的条条件件下下进进行行，尽尽量量少少破破坏坏酶酶活活性性功功能能的的必必需需基基团团，得得到到高高的的修修饰饰率率和和高高的的酶酶活活回回收收率率。应应做做无无修修饰饰剂剂的的对对照照 。因因此此，选选择择反反应应条条件件时时要要注注意意酶酶与与修修饰饰剂剂分分子子的的比比例例，反反应应体体系系的的溶溶剂剂性性质质、盐盐浓浓度度和和pH，反反应应温温度度和和反反应应时时间间。修饰反应的最适条件一般要经大量的试验才能确定。修饰反应的最适条件一般要经大量的试验才能确定。现在学习的是第14页，共53页四、修饰剂及修饰反应1糖及糖的衍生物糖及糖的衍生物（1）右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯）右旋糖酐及右旋糖
15、酐硫酸酯 右右旋旋糖糖酐酐是是由由-葡葡萄萄糖糖通通过过-1,6-糖糖苷苷键键形形成成的的高高分分子子多多糖糖，具具有有较较好好的的水水溶溶性性和和生生物物相相容容性性，可可用用作作代代血血浆浆。右右旋旋糖糖酐酐硫硫酸酸酯酯是是右右旋旋糖糖酐酐分分子子中中的的羟羟基基与与硫硫酸酸成成酯酯而而得得。多多糖糖链链上上的的双双羟羟基基结结构构经经活活化化后后可可与与酶酶分分子子上上的的自自由由氨氨基基结结合合。双双羟羟基基的的活活化化除除溴溴化化氰氰法法外外，还还有有高高碘碘酸酸氧氧化化法法。高高碘碘酸酸能能通通过过氧氧化化邻邻双双羟羟基基结结构构而而将将葡葡萄萄糖糖环环打打开开，形形成成的的高高活
16、活性醛基与酶分子上的氨基反应，使右旋糖酐和酶共价结合。性醛基与酶分子上的氨基反应，使右旋糖酐和酶共价结合。现在学习的是第15页，共53页高碘酸氧化法 由由于于反反应应产产物物A不不稳稳定定，所所以以用用四四氢氢硼硼钠钠还还原原成成稳稳定定产产物物B。用用四四氢氢硼硼钠钠还还原原的的反反应应比比较较激激烈烈，对对酶酶活活性性影影响响较较大大，因因此此可可在在酶酶与与右右旋旋糖糖酐酐之之间间加加一一个个手手臂臂来来减减少少酶酶的的失失活活，如如加加一一个联苯胺。个联苯胺。现在学习的是第16页，共53页糖及糖的衍生物（2）糖肽）糖肽 糖糖肽肽一一般般是是通通过过纤纤维维蛋蛋白白酶酶降降解解人人纤纤维
17、维蛋蛋白白或或蛋蛋白白酶酶降降解解球球蛋蛋白白而而得得。由由于于糖糖肽肽结结构构上上含含有有氨氨基基，所所以以经经活活化化后后能能与与酶酶分分子子上上的的氨氨基基反反应应而而产产生共价生共价结结合。合。现在学习的是第17页，共53页糖肽修饰方法a.异异氰氰酸酸法法：糖糖肽肽在在低低温温条条件件下下用用2,3-异异氰氰酸酸甲甲苯苯活活化，再在碱性条件下与酶交联。化，再在碱性条件下与酶交联。现在学习的是第18页，共53页糖肽修饰方法b.戊戊二二醛醛法法：用用双双功功能能试试剂剂戊戊二二醛醛将将糖糖肽肽的的氨氨基基活活化化，然后与酶分子上的氨基反应生成修饰酶。然后与酶分子上的氨基反应生成修饰酶。现在
18、学习的是第19页，共53页糖及糖的衍生物（3）SephadexG-25可用高碘酸氧化法修饰。可用高碘酸氧化法修饰。现在学习的是第20页，共53页2聚乙二醇（Polyethylene Glycol，PEG）PEGHO-CH2-(CH2-O-CH2)n-CH2-OH和和MPEGCH3-O-CH2-(CH2-O-CH2)n-CH2-OH，单单甲甲氧氧基基聚聚乙乙二二醇醇是是线线性性分分子子，具具有有较较好好的的生生物物相相容容性性。PEG在在体体内内不不残残留留，无无毒毒性性和和抗抗原原性性，它它的的末末端端羟羟基基经经活活化化后后可可与与酶酶反反应应，产产生生交交联联。PEG修修饰饰酶酶的的主要优
19、点是能消除酶的抗原性。主要优点是能消除酶的抗原性。现在学习的是第21页，共53页聚乙二醇修饰方法（1）三氯均嗪法）三氯均嗪法 三三氯氯均均嗪嗪环环上上的的氯氯原原子子很很活活泼泼。当当环环上上的的一一个个氯氯原原子子被被取取代代后后，能能够够稳稳定定其其它它的的碳碳氯氯键键（第第一一个个氯氯原原子子在在4就就能能反反应应，第第二二个个氯氯原原子子在在25反反应应，第第三三个个氯氯原原子子则则要要到到80才才能能反反应应）。三三氯氯均均嗪嗪活活化化PEG形形成成修修饰饰酶酶的的反反应应如如下下。第第一一步步反反应应后后，通通过过石石油油醚醚抽抽提提或或减减压压蒸蒸馏馏得得到活化的到活化的PEG。
20、现在学习的是第22页，共53页聚乙二醇修饰方法（2）琥珀酸酐法）琥珀酸酐法 常常用用,-二二溴溴代代琥琥珀珀酸酸酐酐作作为为PEG的的活活化化剂剂。活活化化反反应应在在温温和和的的碱碱性性条条件件下下进进行行，产产物物与与酶酶分分子子上上的的氨氨基基产产生生交交联联反反应应。也也可可用用,-二二碘碘代代琥琥珀珀酸酸酐酐作作为为活化剂。活化剂。现在学习的是第23页，共53页聚乙二醇修饰方法（3 3）重氮法）重氮法 重重氮氮化化反反应应是是将将修修饰饰剂剂上上的的有有关关基基团团转转变变为为重重氮氮基基团团，然然后后在在弱弱碱碱性性条条件件下下与与酶酶分分子子上上的的酚酚基基、咪咪唑唑基基等等反反
21、应应，生生成成修修饰饰酶酶。有有多多种种试试剂剂可可用用于于这这个个方方法法，它它们们都都是是和和PEG末末端端的的羟羟基基结结合合后后，在在酸酸性性条条件件下下用用亚亚硝硝酸酸与与其其游离氨基反应，生成重氮基团。游离氨基反应，生成重氮基团。现在学习的是第24页，共53页N-羧氨基苯甲酐为修饰剂现在学习的是第25页，共53页酶修饰程度与抗原性 在在多多数数情情况况下下，酶酶的的抗抗原原性性随随着着分分子子表表面面的的自自由由氨氨基基被被PEG修修饰饰而而降降低低，当当酶酶分分子子上上50以以上上的的自自由由氨氨基基参参与与修修饰饰反反应应后后，酶酶就就几几乎乎失失去去了了抗抗原原性性。但但是是
22、酶酶活活性性也也常常常常随随着着被被修修饰饰的的自自由由氨氨基基数数的的增增加加而下降。而下降。现在学习的是第26页，共53页PEG修饰酶的酶活回收率酶酶被修饰氨基数（）被修饰氨基数（）酶活回收率（）酶活回收率（）腺苷脱氨酶腺苷脱氨酶5928精氨酸酶精氨酸酶5365过氧化氢酶过氧化氢酶4095谷氨酰胺酶谷氨酰胺酶7112胰蛋白酶胰蛋白酶2495苯丙氨酸解氨酶苯丙氨酸解氨酶5215尿酸酶尿酸酶5829L-天冬酰胺酶天冬酰胺酶797现在学习的是第27页，共53页3 3合成大分子多聚物 目前用于酶化学修饰的合成大分子主要是聚乙烯吡目前用于酶化学修饰的合成大分子主要是聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酸
23、等，这里仅介绍聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酸等，这里仅介绍聚乙烯吡咯烷酮（咯烷酮（polyN-vinylpyrrolidone，PVP）作为修饰剂）作为修饰剂的反应。的反应。常用分子量为常用分子量为10000的的PVP作为修饰剂，在修饰作为修饰剂，在修饰反应时，首先水解打开整个反应时，首先水解打开整个PVP分子的约分子的约5的的-内内酰胺环，生成活化的酰胺环，生成活化的PVP后与酶反应，得到修饰酶。后与酶反应，得到修饰酶。现在学习的是第28页，共53页PVP修饰法现在学习的是第29页，共53页4 4肝素 肝肝素素是是蛋蛋白白聚聚糖糖中中的的一一种种成成分分，由由氨氨基基葡葡萄萄糖糖和和两两
24、种种糖糖醛醛酸酸（葡葡萄萄糖糖醛醛酸酸、艾艾杜杜糖糖醛醛酸酸）组组成成，还还含含有有硫硫酸酸酯酯，平平均均分分子子量量20000左左右右。肝肝素素不不仅仅与与其其它它大大分分子子修修饰饰剂剂一一样样，与与酶酶共共价价交交联联后后能能增增加加酶酶的的稳稳定定性性，同同时时由由于于肝肝素素在在生生物物体体内内还还具具有有抗抗凝凝血血、抗抗血血栓栓、降降血血脂脂等等活活性性，因因此此，更更适适于于用用来来修修饰饰溶溶解解血血栓栓酶酶类类以以增增加加疗疗效效。修修饰饰反反应的方法有碳二亚胺法、三氯均嗪法、溴化氰法等。应的方法有碳二亚胺法、三氯均嗪法、溴化氰法等。现在学习的是第30页，共53页肝素的碳二
25、亚胺法修饰现在学习的是第31页，共53页5 5血浆蛋白质 血血浆浆蛋蛋白白质质是是血血浆浆中中的的天天然然组组分分，它它们们与与外外源源蛋蛋白白质质（包包括括酶酶）的的复复合合物物在在血血液液中中有有可可能能被被视视为为“自自体体蛋蛋白白”而而被被接接受受，同同时时由由于于血血浆浆蛋蛋白白质质具具有有较较大大的的分分子子量量，在在改改进进酶酶的的性性质质方方面面效效果果更更明明显显。因因此此，已已被被认认为为是是具具有有较较大大优优越越性性和和发发展展前前途途的的修修饰饰剂剂。其其中中人人血血清清白白蛋蛋白白是是研研究究较较多多的一种酶修饰剂。的一种酶修饰剂。现在学习的是第32页，共53页血浆
26、蛋白质修饰法（1）戊二醛法）戊二醛法现在学习的是第33页，共53页血浆蛋白质修饰法（2）活性酯法）活性酯法 白白蛋蛋白白的的活活性性酯酯修修饰饰法法反反应应条条件件温温和和，避避免免了了活活泼泼的的双双功功能能交交联联剂剂直直接接与与酶酶接接触触所所产产生生的的酶酶失失活活，减减少少了了副副反反应应的的发发生生。用用活活性性酯酯法法以以白白蛋蛋白白修修饰饰尿尿激激酶酶，在在不不用用底底物物保保护护酶酶活活性性部部位位的的条条件件下下，酶酶活活回回收收率率仍仍高高达达90以以上上，结结合合率率高高达达80以以上上。白白蛋蛋白白的的琥琥珀珀酰酰化化应应在在碱碱性性条条件件下下进进行行，与与对对硝硝
27、基基苯苯酚酚的的反反应应要要在在偏偏酸酸性性pH下下进行。进行。现在学习的是第34页，共53页白蛋白活性酯法修饰现在学习的是第35页，共53页6 6琥珀酸酐 从从大大肠肠杆杆菌菌得得到到的的L-天天冬冬酰酰胺胺酶酶由由四四个个亚亚基基组组成成，当当用用琥琥珀珀酸酸酐酐在在碱碱性性条条件件下下修修饰饰酶酶的的赖赖氨氨酸酸残残基基时时，不不同同的的反反应应条条件件得得到到了了不不同同的的结结果果。当当酶酶分分子子中中1525的的赖赖氨氨酸酸被被修修饰饰后后，酶酶活活性性有有所所提提高高，当当40的的赖赖氨氨酸酸被被修修饰饰后后，酶酶仍仍保保留留了了全全部部活活性性，因因此此可可以以认认为为这这部部
28、分分基基团团与与酶酶活活性性关关系系不不大大。随随着着修修饰饰程程度度的的增增加加，大大量量带带正正电电荷荷的的氨氨基基被被带带负负电电荷荷的的羧羧基基侧侧链链取取代代后后，所所产产生生的的静静电电斥斥力力就就可可能能导导致致酶酶亚亚基基的的解解离离和和分分子子内内部部的的氨氨基基被被修修饰饰，从从而而使使酶酶活活性性降降低。低。现在学习的是第36页，共53页L-天冬酰胺酶琥珀酰化修饰程度与酶活性的关系琥珀酸酐琥珀酸酐LYS0.250.501.02.03.04.06.08.0琥珀酰化琥珀酰化LYS总总LYS0.150.220.400.500.570.650.820.93酶活性酶活性对照酶活性对
29、照酶活性1.161.251.000.720.600.500.100现在学习的是第37页，共53页7 7金属离子置换 把把酶酶分分子子中中的的金金属属离离子子换换成成另另一一种种金金属属离离子子，使使酶酶的的功功能能和和特特性性发发生生改改变变的的修修饰饰方方法法称称为为金金属属离离子子置置换换修修饰饰。通通过过金金属属离离子子置置换换修修饰饰，可可以以了了解解各各种种金金属属离离子子在在酶酶催催化化过过程程中中的的作作用用，有有利利于于阐阐明明酶酶的的催催化化作作用用机机制制，并并有有可可能能提提高高酶酶活活性性，增增强强酶酶的的稳稳定定性性，甚甚至至改改变变酶酶的的某些动力学性质。某些动力学
30、性质。现在学习的是第38页，共53页金属离子置换 有有些些酶酶分分子子中中含含有有金金属属离离子子，而而且且往往往往是是酶酶活活性性中中心心的的组组成成部部分分，例例如如淀淀粉粉酶酶中中的的Ca2+、谷谷氨氨酸酸脱脱氢氢酶酶中中的的Zn2+、过过氧氧化化氢氢酶酶中中的的Fe2+、超超氧氧化化物物歧歧化化酶酶中中的的Cu2+、Zn2+等等。若若从从酶酶分分子子中中除除去去其其所所含含的的金金属属离离子子，酶酶往往往往会会丧丧失失其其催催化化活活性性。如如果果重重新新加加入入原原有有的的金金属属离离子子，酶酶的的催催化化活活性性可可以以恢恢复复或或部部分分恢恢复复。若若用用另另一一种种金金属属离离
31、子子进进行行置置换换，则则可可使使酶酶呈呈现现出出不不同同的的特特性性，有有的的可可以以使使酶酶活活性性降降低低甚甚至至丧丧失失，有的却可以使酶活性提高或增加酶的稳定性。有的却可以使酶活性提高或增加酶的稳定性。现在学习的是第39页，共53页金属离子置换的方法 金金属属离离子子的的置置换换修修饰饰只只适适用用于于那那些些在在分分子子结结构构中中本本来来含含有有金金属属离离子子的的酶酶。用用于于金金属属离离子子置置换换修修饰饰的的金金属属离离子子，一一般般都都是是二二价价金金属属离离子子。例例如如，Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Co2+、Cu2+、Fe2+等等。在在离离子子置置换换修修饰
32、饰时时，先先在在经经过过分分离离纯纯化化的的酶酶液液中中加加入入一一定定量量的的金金属属螯螯合合剂剂，如如EDTA，使使酶酶分分子子中中的的金金属属离离子子与与EDTA形形成成螯螯合合物物，通通过过透透析析、超超滤滤、凝凝胶胶层层析析等等方方法法，将将EDTA金金属属离离子子螯螯合合物物从从酶酶液液中中除除去去。然然后后将将另另一一种种金金属属离离子子加加到到酶酶液液中中，酶酶蛋蛋白白与与新新加加入入的的金金属属离离子子结结合合，就得到经过金属离子置换的酶。就得到经过金属离子置换的酶。现在学习的是第40页，共53页五、修饰酶的性质特征1提高酶活性提高酶活性 有有些些酶酶通通过过金金属属离离子子
33、置置换换后后显显著著地地提提高高了了酶酶活活性性。如如淀淀粉粉酶酶分分子子中中大大多多数数含含有有钙钙离离子子，有有些些含含有有镁镁离离子子和和锌锌离离子子，所所以以一一般般的的淀淀粉粉酶酶是是杂杂离离子子型型的的。如如果果将将杂杂离离子子都都置置换换成成钙钙离离子子，则则可可以以提提高高酶酶活活性性3倍倍以以上上，并并显显著著增增强强酶酶的的稳稳定定性性。所所以以在在淀淀粉粉酶酶的的发发酵酵生生产产、保保存存及及应应用用过过程程中中，添添加加一一定定量量的的钙钙离离子子，有有利利于于提提高高和和稳稳定定淀淀粉粉酶酶的的活活性性。再再如如，将将锌锌型型蛋蛋白白酶酶中中的的锌锌离离子子除除去，置
34、换成钙离子，其酶活性可以提高去，置换成钙离子，其酶活性可以提高2030%。现在学习的是第41页，共53页修饰酶的性质特征2提高稳定性提高稳定性 许许多多修修饰饰剂剂分分子子上上有有多多个个活活性性反反应应基基团团，因因此此可可与与酶酶形形成成多多点点交交联联，固固定定酶酶的的构构象象，增增强强酶酶的的热热稳稳定定性性。PEG修修饰饰酶酶在在热热稳稳定定性性上上没没有有明明显显的的提提高高，可可能能是是因因为为PEG和和酶酶是是单单点点交交联联，难难以以产产生生固固定定酶酶分分子子构象的效应。构象的效应。有有些些酶酶分分子子中中的的金金属属离离子子被被置置换换以以后后，稳稳定定性性显显著著增增强
35、强。如如铁铁型型超超氧氧化化物物歧歧化化酶酶（Fe-SOD）分分子子中中的的铁铁离离子子被被置置换换成成锰锰离离子子后后，其其对对过过氧氧化化氢氢的的稳稳定定性性显显著著增强，对叠氮化钠的敏感性显著降低。增强，对叠氮化钠的敏感性显著降低。现在学习的是第42页，共53页天然酶和修饰酶热稳定性的比较 酶酶修饰剂修饰剂 天然酶天然酶 修饰酶修饰酶 温度时间温度时间 残留酶残留酶活活(%)温度时间温度时间 残留酶残留酶活活(%)L-天冬酰胺酶天冬酰胺酶聚丙氨酸聚丙氨酸50/7min5050/22min50L-天冬酰胺酶天冬酰胺酶 聚乳糖聚乳糖60/10min1960/10min63L-天冬酰胺酶天冬酰
36、胺酶人血清白蛋白人血清白蛋白37/4h5037/40h50尿酸酶尿酸酶人血清白蛋白人血清白蛋白37/48h5037/48h95-葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶 人血清白蛋白人血清白蛋白55/3min5055/60min50淀粉酶淀粉酶右旋糖酐右旋糖酐65/2.5min5065/63min50淀粉酶淀粉酶右旋糖酐右旋糖酐60/5min5060/175min50过氧化氢酶过氧化氢酶右旋糖酐右旋糖酐50/10min4050/10min90溶菌酶溶菌酶右旋糖酐右旋糖酐100/30min20100/30min99-糜蛋白酶糜蛋白酶右旋糖酐右旋糖酐37/6h037/6h70-葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶 右旋糖酐右旋糖酐6
37、0/40min4160/40min82糜蛋白酶糜蛋白酶 肝素肝素 37/6h037/24h80现在学习的是第43页，共53页修饰酶的性质特征3 3抗各类失活因子抗各类失活因子 酶酶 修饰剂修饰剂抗蛋白水解酶抗蛋白水解酶抗抑制剂抗抑制剂抗失活剂抗失活剂过氧化氢酶过氧化氢酶右旋糖酐右旋糖酐抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶核糖核酸酶核糖核酸酶右旋糖酐右旋糖酐抗蛋白酶抗蛋白酶溶菌酶溶菌酶右旋糖酐右旋糖酐抗糜蛋白酶抗糜蛋白酶抗抗SDS胰蛋白酶胰蛋白酶右旋糖酐右旋糖酐抗自身水解抗自身水解抗大豆抑制剂抗大豆抑制剂抗尿素抗尿素-葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶 右旋糖酐右旋糖酐抗抗SDS胰蛋白酶胰蛋白酶PEG抗大豆抑制剂抗大豆抑制剂
38、过氧化氢酶过氧化氢酶PEG抗胰酶、糜酶抗胰酶、糜酶L-天冬酰胺酶天冬酰胺酶聚丙氨酸聚丙氨酸抗胰酶、糜酶抗胰酶、糜酶L-天冬酰胺酶天冬酰胺酶聚乳糖聚乳糖抗枯草杆菌蛋白酶抗枯草杆菌蛋白酶胰蛋白酶胰蛋白酶PVP抗大豆蛋白酶抑制剂抗大豆蛋白酶抑制剂尿激酶尿激酶 白蛋白白蛋白 抗胃蛋白酶抗胃蛋白酶 抗胎盘抑制剂抗胎盘抑制剂 尿酸酶尿酸酶 白蛋白白蛋白 抗胰酶抗胰酶 -葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶白蛋白白蛋白抗胰酶抗胰酶现在学习的是第44页，共53页修饰酶的性质特征4减弱和消除抗原性减弱和消除抗原性 有有些些修修饰饰剂剂在在消消除除酶酶抗抗原原性性上上并并无无作作用用。如如PVP修修饰饰酶酶在在重重复复用用于于体
39、体内内后后，会会诱诱导导机机体体产产生生抗抗体体使使酶酶失失活活。糖糖类类物物质质也也不不容容易易消消除除酶酶的的抗抗原原性性，这这类类修修饰饰酶酶在在体体内内仍仍可可诱诱发发过过敏敏反反应应。PEG和和人人血血清清白白蛋蛋白白在在消消除除酶酶的的抗抗原性上效果明显。原性上效果明显。现在学习的是第45页，共53页乙酸酐和MPEG1修饰L-天冬酰胺酶的抗原性项项 目目天然酶天然酶乙酰修饰酶乙酰修饰酶MPEG1（5000）修饰酶（）修饰酶（）MPEG1（5000）修饰酶（）修饰酶（）-NH2修饰率修饰率029.10.7156.00.9071.70.65酶活性酶活性10015.10.4025.00.
40、3017.20.43抗原抗原-抗体结合能力抗体结合能力10080.22.3068.52.4126.61.51现在学习的是第46页，共53页修饰酶的性质特征5 5延长体内半寿期延长体内半寿期 许许多多酶酶经经过过化化学学修修饰饰后后，由由于于增增强强了了抗抗蛋蛋白白水水解解酶酶、抗抗抑抑制制剂剂和和抗抗失失活活因因子子的的能能力力以以及及热热稳稳定定性性提提高高，体体内内半半寿寿期期都都比比天天然然酶酶延延长长，这这对对提提高高药药用用酶酶的的疗疗效效具具有有很很重要的意义。重要的意义。现在学习的是第47页，共53页修饰酶的性质特征6 6对组织的分布能力对组织的分布能力（1）-葡萄糖苷酶葡萄糖苷
41、酶 Pmepes病病主主要要是是由由于于糖糖原原贮贮积积于于肝肝细细胞胞的的二二级级溶溶酶酶体体（secondarylysosome）所所造造成成的的。因因此此在在用用-葡葡萄萄糖糖苷苷酶酶进进行行治治疗疗时时，希希望望酶酶在在体体内内尽尽量量避避免免受受到到吞吞噬噬细细胞胞的的破破坏坏，尽尽快快到到达达肝肝细细胞胞。现现在在人人们们已已知知，肝肝细细胞胞上上有有特特异异性性的的白白蛋蛋白白受受体体，用用白白蛋蛋白白修修饰饰酶酶后后，有有利利于于肝肝细细胞胞对对酶酶的的摄摄入入，使使更更多多的的酶酶到到达达靶靶部部位位发发挥挥作作用用。用用未未修修饰饰的的酶酶注注射射后后有有22的的酶酶被被肝
42、肝溶溶酶酶体体摄摄入入，而而用用白白蛋蛋白白修修饰饰酶酶注注射射后后有有35的酶被肝溶酶体摄入。的酶被肝溶酶体摄入。现在学习的是第48页，共53页对组织的分布能力（2）辣根过氧化物酶）辣根过氧化物酶 辣辣根根过过氧氧化化物物酶酶用用聚聚赖赖氨氨酸酸修修饰饰后后，细细胞胞的的摄摄入入量量增增加加了了80倍倍。这这种种穿穿透透细细胞胞膜膜的的能能力力增增强强可可能能是是因因为为聚聚赖赖氨氨酸酸增增加加了了酶酶分分子子上上的的正正电电荷荷。当当聚聚赖赖氨氨酸酸上上的的氨氨基基被被酰化后，修饰酶就不表现出穿透细胞膜能力增强的现象。酰化后，修饰酶就不表现出穿透细胞膜能力增强的现象。现在学习的是第49页，
43、共53页对组织的分布能力（3 3）溶菌酶）溶菌酶 天天然然溶溶菌菌酶酶几几乎乎不不被被肝肝细细胞胞吸吸收收，但但溶溶菌菌酶酶与与来来自自胎胎球球蛋蛋白白的的糖糖肽肽交交联联后后，再再用用唾唾液液酸酸苷苷酶酶除除去去糖糖肽肽末末端端的的唾唾液液酸酸，暴暴露露出出半半乳乳糖糖残残基基，就就能能很很快快被被肝肝细细胞胞吸吸收收，比比天天然然酶酶的的吸吸收收快快10倍倍。如如果果用用半半乳乳糖糖苷苷酶酶除除去去半半乳乳糖糖，则则肝肝细细胞胞的的吸吸收收又又马马上上下下降降，由由此此可可见见，肝肝细细胞胞表表面面有有特特异性的半乳糖受体来识别和结合半乳糖分子。异性的半乳糖受体来识别和结合半乳糖分子。现在
44、学习的是第50页，共53页对组织的分布能力（4）L-天冬酰胺酶天冬酰胺酶 用用聚聚乳乳糖糖修修饰饰L-天天冬冬酰酰胺胺酶酶后后，由由于于肝肝细细胞胞的的特特异异性性受受体体能能和和乳乳糖糖的的非非还还原原端端半半乳乳糖糖结结合合，使使得得聚聚乳乳糖糖修修饰饰的的L-天天冬冬酰酰胺胺酶酶在在进进入入体体内内10min后后即即被被肝肝细细胞胞吸吸收收，而而此此时时90的的天天然然酶酶还还存存在在于于血血液中。液中。现在学习的是第51页，共53页修饰酶的性质特征7改变酶的动力学特性改变酶的动力学特性 修修饰饰酶酶的的最最适适pH、Km等等也也有有所所改改变变。如如酰酰基基化化氨氨基基酸酸水水解解酶酶的的活活性性中中心心含含有有锌锌离离子子，用用钴钴离离子子置置换换后后，其其催催化化N氯氯乙乙酰酰丙丙氨氨酸酸水水解解的的最最适适pH从从8.5降降低低为为7.0。同同时时该该酶酶对对N氯氯乙乙酰酰蛋蛋氨氨酸酸的的米米氏氏常常数数Km增增大，亲和力降低。大，亲和力降低。现在学习的是第52页，共53页感感谢谢大大家家观观看看现在学习的是第53页，共53页