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1、二、酶化学修饰的目的二、酶化学修饰的目的1.1.研究酶的结构与功能的关系。（研究酶的结构与功能的关系。（5050年代末）年代末）2.2.人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用 范围。（范围。（7070年代末之后）年代末之后）1 1）增强酶天然构象的稳定性与耐热性）增强酶天然构象的稳定性与耐热性2 2）保护酶活性部位与抗抑制剂）保护酶活性部位与抗抑制剂3 3）维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶）维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶4 4）消除酶的抗原性及稳定酶的微环境）消除酶的抗原性及稳定酶的微环境第1页/共46页1 1）、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热
2、性）、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性 修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。使酶的天然构象产生形成多点交联。使酶的天然构象产生“刚性刚性”结构。结构。2 2）、如何保护酶活性部位与抗抑制剂）、如何保护酶活性部位与抗抑制剂 大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖遮盖”了酶了酶的活性部位的活性部位。第2页/共46页3 3）、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白）、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶水解酶 酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：酶化学修饰后通过两
3、种途径抗蛋白水解酶：A.A.大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。酶接近酶分子。“遮盖遮盖”酶分子上敏感键酶分子上敏感键免遭破坏。免遭破坏。B.B.酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。第3页/共46页4 4）、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境）、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境A.A.酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。了共价键。破坏了抗原决定簇破坏了抗原决定簇抗原性降低乃至消除抗原性降
4、低乃至消除 “遮盖遮盖”了抗原决定簇了抗原决定簇阻碍抗原、抗体结合阻碍抗原、抗体结合B.B.大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表面形成面形成“缓冲外壳缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化，维，抵御外界环境的极性变化，维持酶活性部位微环境相对稳定。持酶活性部位微环境相对稳定。第4页/共46页三、原理 利用化学修饰剂所具有的各种基团的特性，直接或间接地经过一定的活化过程与酶分子的某种氨基酸残基发生化学反应，从而对酶分子的结构进行改造。第5页/共46页四、修饰的一般程序修饰反应 酸化 稀释 阳离子交换 洗涤 过滤 干燥第6页/共46页五、化学修饰方法1、
5、侧链基团的化学修饰 定义：通过选择性的试剂与酶分子侧链上特定的功能基团发生化学反应。作用：探测酶分子活性部位的结构，推测被修饰氨基酸残基在酶分子中的功能。侧链基团，组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。主要有：氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。侧链基团修饰剂：采用的各种小分子化合物。20种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的侧链易被修饰，它们一般具有亲核性。第7页/共46页极性氨基酸 1）无电荷的极性氨基酸（共7种）：丝氨酸(Serine,Ser,S),苏氨酸(Threonine,Thr,T),酪氨酸(Tyrosine,Tyr,Y),半胱氨酸(Cysteine,Cys,C),天冬酰胺(Aspa
6、ragine,Asn,N),甘氨酸(Glycine,Gly,G),谷氨酰胺(Glutamine,Gln,Q)2）.带正电荷的极性氨基酸（共3种）：赖氨酸(Lysine,Lys,K),精氨酸(Arginine,Arg,R),组氨酸(Histidine,His,H)3）带负电荷的极性氨基酸（共2种）：天冬氨酸(Aspartic acid,Asp,D),谷氨酸(Glutamic acid,Glu,E)第8页/共46页第9页/共46页1）、-NH2的化学修饰(主要用于赖氨酸的修饰）第10页/共46页2）、-COOH的化学修饰（主要用于谷氨酸和天冬氨酸）第11页/共46页3）、-SH的化学修饰（半光氨酸
7、）第12页/共46页4）、咪唑基的修饰（组氨酸）第13页/共46页5）、胍基的修饰（精氨酸）第14页/共46页6）、吲哚基的化学修饰（色氨酸）第15页/共46页7）、（酚）羟基残基的修饰（酪氨酸，丝氨酸,苏氨酸）第16页/共46页8）、甲硫基的修饰（甲硫氨酸）第18页/共46页9）、二硫键的修饰第19页/共46页2、酶分子表面的化学修饰 利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。水溶性大分子：及其衍生物：是线性分子，具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性。右旋糖酐及其衍生物：右旋糖苷是由葡萄糖通过1，6
8、糖苷键连接而成的高分子多糖，具有良好的生物相容性和水溶性。糖肽：糖肽是蛋白酶水解人纤维蛋白或Y一球蛋白所得到的产物。其分子上具有游离氨基，活化后与酶分子上氨基反应，从而可修饰酶。其他天然大分子（肝素、血清白蛋白）其它合成大分子多聚物：聚N乙烯吡咯烷酮，聚乙烯醇（PVA）聚丙烯酸(PAA)，聚顺丁烯二酸酐，聚氨基酸等。第20页/共46页）的修饰（常采用单甲氧基MPEG的衍生物）第21页/共46页第22页/共46页）、右旋糖酐（可作代血浆用）及右旋糖酐硫酸酯的修饰第23页/共46页第24页/共46页）、糖肽（水解纤维蛋白或-球蛋白而获得）第25页/共46页）、其他大分子（肝素、血清白蛋白）肝素，是
9、一种含硫酸酯的粘多糖，由氨基葡萄糖和糖醛酸构成。第26页/共46页第27页/共46页白蛋白白蛋白第28页/共46页3、亲和标记 前面介绍的修饰方法，其修饰剂对特定残基的专一性修饰较差，往往会跟多个同类残基发生反应。为了克服这一缺陷，人们开始使用亲和性标记。它利用酶和底物的亲和性，使用与酶底物或配体结构类似的修饰剂，对酶活性部位上的氨基酸残基进行共价标记。（依据抗原-抗体的亲和反应而设计的一种修饰方法，具有特异性修饰功能。）第29页/共46页4、肽链的有限水解 酶原的激活，就是一种肽链的有限水解，即肽链的水解在限定的肽键上进行，酶分子的活性中心没有受到损伤，只是激活了酶的活性或降低了酶分子的抗原
10、性。第30页/共46页5、氨基酸置换修饰氨基酸置换修饰 将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸，引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法。通过两个途径实现：化学修饰法：由于可用试剂的限制，获得的种类少；蛋白质工程：利用基因操纵技术。第31页/共46页6、金属离子置换修饰 改变酶分子中所含的金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法。第32页/共46页六、酶经修饰后的性质变化 提高了酶稳定性，改善反应条件及延长使用寿命，改变了最适pH、Km、抑制常数、减少或消除了抗原性，甚至使酶分子具备对某些组织和细胞的亲和力和穿透性。第33页/共46页1、酶稳定性第34页/共46页2、抗原性第
11、35页/共46页3、对各类失活因子的抵抗力第36页/共46页4、半衰期及酶活残留率第37页/共46页5、pH第38页/共46页6、Km第39页/共46页七、酶化学修饰的应用1、酶结构与功能的研究（小分子对酶侧链基团的化学修饰）1)、非专一性化学修饰用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团作用：A、若酶活性不变该基团可能不是酶的必需基团 B、若酶活性降低或丧失该基团可能是酶的必需基团，但不能确定化学试剂是同活性中心内的必需基团结合。第40页/共46页2）、专一性化学修饰第41页/共46页活性中心基团的鉴定标准失活程度与修饰剂浓度成一定比例关系。S或可逆抑制剂有保护作用（活性中心）：先加S或竞 加共价
12、修饰剂 透析除去S或竞 活性不丧失差别标记：底物或抑制剂存在 活性基团不与修饰剂作用去除底物或抑制剂 原来被保护的基团带同位素标记化学修饰含同位素标记的同样试剂第43页/共46页2、医药（大分子对酶分子表面的化学修饰）优点：PEG分子与酶蛋白连接后可以在蛋白质表面形成保护层，同时由于PEG分子特有的柔性和线性，能够很好地掩盖蛋白质的抗原决定族，从而延长修饰酶在体内的作用时间和药效，改变组织分布。此外白蛋白，肝素和右旋糖苷等均具有很好的生物相容性。可消除酶的抗原性和避免被机体内其他蛋白酶水解破坏。（前面已作介绍）如：PEG-腺苷脱氨酶、PEG-超氧化物歧化、PEG-溶血类蛋白、PEG-天门冬酰氨酶、第44页/共46页 缺点：扩散速度受限；生物活性降低；选择性不高，稳定性不够理想。第45页/共46页感谢您的观看！第46页/共46页