酶的化学修饰ppt课件.ppt

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1、退出 传统的生物催化剂都是设计或优化传统的生物催化剂都是设计或优化催化过程去适应已有的生物催化剂。催化过程去适应已有的生物催化剂。 开始修饰或改造生物催化剂以适应开始修饰或改造生物催化剂以适应特定的生物催化过程。希望能够实现先特定的生物催化过程。希望能够实现先设计理想的催化过程，然后在寻找并改设计理想的催化过程，然后在寻找并改造得到理想的生物催化剂。造得到理想的生物催化剂。 理想生物催化剂：有良好的实际应用理想生物催化剂：有良好的实际应用灵活性、稳定性和可生产性。灵活性、稳定性和可生产性。退出一、酶分子修饰的原因一、酶分子修饰的原因1 稳定性不够，不能适应大量生产的需要。稳定性不够，不能适应大

2、量生产的需要。2 作用的最适条件不符（温度、作用的最适条件不符（温度、pH等）。等）。3 酶的主要动力学性质的不适应。酶的主要动力学性质的不适应。4 临床应用的特殊要求。临床应用的特殊要求。 消除抗原性、延长酶的半衰期、稳定消除抗原性、延长酶的半衰期、稳定性等性等第六章第六章 酶分子化学修饰酶分子化学修饰退出二、二、 酶修饰的方向酶修饰的方向v1 核酸水平（生物酶工程的内容）核酸水平（生物酶工程的内容） 通过基因工程方法改变编码酶分子的基通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的。因而达到改造酶的目的。v2 蛋白质水平（化学修饰、定点突变蛋白质水平（化学修饰、定点突变等）等） 通过

3、分子修饰的方法来改变已分离出来通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的活性。的天然酶的活性。退出酶化学修饰的目的酶化学修饰的目的1. 1. 研究酶的结构与功能的关系。（研究酶的结构与功能的关系。（5050年代末）年代末）2. 2. 人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用 范围。（范围。（7070年代末之后）年代末之后）1 1）提高酶的生物活性（酶活力）。）提高酶的生物活性（酶活力）。2 2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。3 3）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能）消除抗原性（针对特异性反应降低生

4、物识别能力）。力）。4 4）产生新的催化能力。）产生新的催化能力。退出v1、酶的结构基础、酶的结构基础 辅因子辅因子 催化基团催化基团全酶全酶 接触残基接触残基 活性部位活性部位 底物结合基团底物结合基团 必需残基必需残基 辅助残基辅助残基 酶蛋白酶蛋白 结构残基结构残基 非贡献残基非贡献残基三、酶结构基础三、酶结构基础退出 辅因子辅因子FAD、FMN：脱氢酶、氧化酶的辅酶：脱氢酶、氧化酶的辅酶NADH、NADPH：脱氢酶的辅酶：脱氢酶的辅酶磷酸吡哆醛：转氨酶的辅基磷酸吡哆醛：转氨酶的辅基Ca2+ ： 淀粉酶金属离子辅因子：淀粉酶金属离子辅因子： 非贡献残基非贡献残基木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶 2/

5、3，烯醇化酶，烯醇化酶 1/5 退出退出 结构残基结构残基结构残基在酶分子活性构象形成和稳定中结构残基在酶分子活性构象形成和稳定中起关键作用。起关键作用。 溶菌酶分子中有溶菌酶分子中有4对对SC键，分别键，分别在在6-127,30-115,46-48,76-94位连接。位连接。实验证明这实验证明这4对二硫键中，对二硫键中，6-127位之间位之间的键断裂，酶不失活。这表明酶分子中的键断裂，酶不失活。这表明酶分子中的的SS键并非全部为维持活性构象所必键并非全部为维持活性构象所必需。需。退出退出 催化基团（部位）催化基团（部位）是在催化反应中直是在催化反应中直接参与电子接受关系的部位。接参与电子接受

6、关系的部位。牛胰凝乳蛋白酶牛胰凝乳蛋白酶Ser195，His57，ASP120枯草杆菌蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶，Ser221, His64, ASP32退出 底物结合部位：底物结合部位：酶活性部位直接与其酶活性部位直接与其底物结合的残基构成的空间部位。底物结合的残基构成的空间部位。溶菌酶在水解细胞壁多糖的溶菌酶在水解细胞壁多糖的 1,4糖苷键糖苷键时，酶活性部位凹穴，能容纳时，酶活性部位凹穴，能容纳6个六碳个六碳糖单位，即有六个结合亚位点，来识别糖单位，即有六个结合亚位点，来识别这些糖单位。这些糖单位。 辅助残基辅助残基黑曲霉产生淀粉酶黑曲霉产生淀粉酶 糖肽链有助于酶附着糖肽链有助于酶附着生淀粉

7、生淀粉退出活性中心的重要化学基团活性中心的重要化学基团 7 7种氨基酸出现的频率最高种氨基酸出现的频率最高 Lys Asp Glu Cys His Tyr SerLys Asp Glu Cys His Tyr Ser 兰（赖）天果拌猪肉兰（赖）天果拌猪肉（酪）（酪）丝丝 某些功能基团某些功能基团, ,如（氨基、羧基、巯基、羟基如（氨基、羧基、巯基、羟基 和咪唑基）是酶的必需基团。和咪唑基）是酶的必需基团。 赖氨酸的氨基赖氨酸的氨基 天冬氨酸和谷氨酸的羧基天冬氨酸和谷氨酸的羧基 半胱氨酸的巯基半胱氨酸的巯基 组氨酸的咪唑基组氨酸的咪唑基 酪氨酸和丝氨酸的羟基酪氨酸和丝氨酸的羟基退出四、四、 酶化

8、学修饰的基本原理酶化学修饰的基本原理1 如何增强酶天然构象的稳定性与耐如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性热性 修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。使酶的天然构象产生成多点交联。使酶的天然构象产生“刚性刚性”结构。结构。2、如何保护酶活性部位与抗抑制剂、如何保护酶活性部位与抗抑制剂 大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖遮盖”了酶的了酶的活性部位。活性部位。退出3、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶解酶 酶化学修饰后通

9、过两种途径抗蛋白水解酶：酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶： 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。接近酶分子。“遮盖遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。酶分子上敏感键免遭破坏。 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。少了受蛋白水解酶破坏的可能性。退出4、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。价键。 破坏了抗原决定簇破坏了抗原决定簇抗原性降低乃至消除抗原

10、性降低乃至消除 “遮盖遮盖”了抗原决定簇了抗原决定簇阻碍抗原、抗体结合阻碍抗原、抗体结合大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表面形大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表面形成成“缓冲外壳缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化，维持酶，抵御外界环境的极性变化，维持酶活性部位微环境相对稳定。活性部位微环境相对稳定。退出第一节第一节 酶分子化学修饰酶分子化学修饰一、定义：一、定义： 修饰酶：修饰酶：通过各种方法使酶分子结构发通过各种方法使酶分子结构发生某些变化，从而改变酶的某些特性和功能生某些变化，从而改变酶的某些特性和功能的过程。的过程。 方法包括：方法包括：物理的、化学的、生物学物理的、化学

11、的、生物学 物理法：吸附固定化、包埋固定化物理法：吸附固定化、包埋固定化 高压修饰法、高压修饰法、 变温诱导改性酶变温诱导改性酶退出二、主要作用：二、主要作用： 用于酶的结构和功能研究，探测酶的必用于酶的结构和功能研究，探测酶的必需氨基酸残基的性质和数目，酶的构象变化需氨基酸残基的性质和数目，酶的构象变化和运动性，酶作用的化学机理。和运动性，酶作用的化学机理。 用于酶分子的固定化，提高酶的稳定性，用于酶分子的固定化，提高酶的稳定性，酶活力酶活力 提高酶的稳定性，酶活力，降低或消除提高酶的稳定性，酶活力，降低或消除酶的抗原性。酶的抗原性。 定向改造酶分子性质，得到新特性和新定向改造酶分子性质，得

12、到新特性和新功能的酶。功能的酶。退出三、酶分子化学修饰的形式三、酶分子化学修饰的形式（一）酶的表面修饰（一）酶的表面修饰：化学固定化；酶的小分子化学：化学固定化；酶的小分子化学修饰作用；酶的大分子化学修饰；分子内交联；分修饰作用；酶的大分子化学修饰；分子内交联；分子间交联；脂质体包裹；反相胶团微囊化子间交联；脂质体包裹；反相胶团微囊化(二二)酶分子的内部修饰酶分子的内部修饰：非催化活性基团的修饰；酶：非催化活性基团的修饰；酶蛋白主链修饰；催化活性基团的修饰；肽链伸展后蛋白主链修饰；催化活性基团的修饰；肽链伸展后的修饰的修饰（三）与辅因子相关的修饰（三）与辅因子相关的修饰：辅因子的共价结合；引：

13、辅因子的共价结合；引入新的具有强反应的辅因子；金属酶的金属取代。入新的具有强反应的辅因子；金属酶的金属取代。退出1.1 化学固定化：化学固定化： 通过酶表面的酸性或碱性氨基酸残通过酶表面的酸性或碱性氨基酸残基将酶共价连接到惰性载体上。基将酶共价连接到惰性载体上。（一）酶的表面修饰（一）酶的表面修饰退出1.2 酶的小分子化学修饰作用酶的小分子化学修饰作用小分子化合物对酶活性部位或以外的侧链基团小分子化合物对酶活性部位或以外的侧链基团进行化学修饰，常用修饰剂有氨基葡萄糖、进行化学修饰，常用修饰剂有氨基葡萄糖、醋酸酐等。醋酸酐等。 例：马肝醇脱氢酶的例：马肝醇脱氢酶的Lys乙基化、糖基化和甲乙基化、

14、糖基化和甲基化都能增加其活力；其中甲基化使酶活力基化都能增加其活力；其中甲基化使酶活力增加最大，同时酶的稳定性提高。增加最大，同时酶的稳定性提高。退出1.3 酶的大分子化学修饰酶的大分子化学修饰v大分子的非共价修饰：稳定酶大分子的非共价修饰：稳定酶多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等（如聚乙多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等（如聚乙二醇、右旋糖苷）二醇、右旋糖苷） -淀粉酶与其抗体的复合物在淀粉酶与其抗体的复合物在70半衰期为半衰期为16小时，而天然酶为小时，而天然酶为5分钟。分钟。v大分子的共价修饰：如聚乙二醇、右旋糖苷、大分子的共价修饰：如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素。肝素。用聚乙二醇修饰用聚乙二醇

15、修饰SOD,可以降低或消除酶的抗原可以降低或消除酶的抗原性，提高抗蛋白酶的能力，延长酶的半衰期。性，提高抗蛋白酶的能力，延长酶的半衰期。退出1.4分子内交联分子内交联v 含双功能团的化合物，如二氨基丁烷，含双功能团的化合物，如二氨基丁烷，戊二醛，己二胺等与酶分子内两个侧链基团戊二醛，己二胺等与酶分子内两个侧链基团反应，在分子内共价交联反应，在分子内共价交联。退出1.5 分子间交联分子间交联v杂合酶杂合酶 用戊二醛将胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶交联，用戊二醛将胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶交联，可降低胰凝乳蛋白酶的自溶作用，也使反应可降低胰凝乳蛋白酶的自溶作用，也使反应器体积减小。器体积减小。退出1.6 脂质

16、体包裹脂质体包裹v 脂质体是天然脂类和脂质体是天然脂类和/或类固醇组成的微或类固醇组成的微球体，酶分子包埋其内。它可以通过细胞的球体，酶分子包埋其内。它可以通过细胞的膜融合或内吞作用而进入细胞内。膜融合或内吞作用而进入细胞内。退出1.7 反相胶团微囊化反相胶团微囊化退出2.1 酶蛋白主链修饰酶蛋白主链修饰酶分子主链和糖链的切断和连接酶分子主链和糖链的切断和连接 提高酶活力提高酶活力胰蛋白酶原胰蛋白酶原 胰蛋白酶（蛋白酶除去胰蛋白酶（蛋白酶除去1个个6肽）肽）凝乳酶原凝乳酶原(365aa)凝乳酶凝乳酶(323aa)天冬氨酸酶经胰蛋白酶在羧基未端水解，切除天冬氨酸酶经胰蛋白酶在羧基未端水解，切除1

17、0 多个多个aa肽，活力提高肽，活力提高4-5倍倍用蛋白酶对用蛋白酶对ATP酶有限水解，切除其十几个残酶有限水解，切除其十几个残基后，酶活力提高了基后，酶活力提高了5.5倍。倍。(二二)酶分子的内部修饰酶分子的内部修饰退出 降低或消除酶的抗原性降低或消除酶的抗原性酶的抗原性与分子大小和分子结构有关酶的抗原性与分子大小和分子结构有关酵母的烯醇化酶除去酵母的烯醇化酶除去150个个aa肽肽木瓜蛋白酶经亮氨酸肽酶除去木瓜蛋白酶经亮氨酸肽酶除去2/3长度肽链长度肽链 枯草杆菌中性蛋白酶先用枯草杆菌中性蛋白酶先用EDTA处理，透析并使处理，透析并使该酶部分水解。该酶部分水解。 了解酶活性中心在主链上的位置

18、，从而了解了解酶活性中心在主链上的位置，从而了解主链的不同位置对酶催化功能的贡献主链的不同位置对酶催化功能的贡献。退出 酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况中的一种：情况中的一种：1 引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。2 仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。3 有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部位，有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部位，酶活力提高。酶活力提高。 后两种情况，肽链的水解在限定的肽键上进行后两种情况，肽链的水解在限定的肽键上进行，称称肽链有限

19、水解。肽链有限水解。退出应用实例：应用实例：1 1）提高酶活力：）提高酶活力：2 2）消除抗原性：）消除抗原性：退出2.2 催化活性基团的修饰催化活性基团的修饰 将枯草杆菌蛋白酶活性部位的将枯草杆菌蛋白酶活性部位的Ser残基转残基转化为化为Cys残基，新产生的巯基蛋白酶对肽或残基，新产生的巯基蛋白酶对肽或脂没有水解能力，但能水解高度活化的底物，脂没有水解能力，但能水解高度活化的底物，如硝基苯脂。如硝基苯脂。退出v置换修饰置换修饰 将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸，引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酸，引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的某些特性和功能

20、的方法。酶的某些特性和功能的方法。 通过两个途径实现通过两个途径实现 化学修饰法：由于可用试剂的限制，获得的化学修饰法：由于可用试剂的限制，获得的种类少。种类少。 蛋白质工程：利用基因操纵技术。蛋白质工程：利用基因操纵技术。退出2.3 肽链伸展后的修饰肽链伸展后的修饰v脲、盐酸胍处理使酶肽链充分伸展，修饰酶，脲、盐酸胍处理使酶肽链充分伸展，修饰酶，然后复性（具有某种催化活性的构象）。然后复性（具有某种催化活性的构象）。 Saraswothi等，先让酶变性，然后加入等，先让酶变性，然后加入相应于所希望酶活力的竞争性抑制剂，待获相应于所希望酶活力的竞争性抑制剂，待获得所希望酶的构象时，用戊二醛交联

21、，以固得所希望酶的构象时，用戊二醛交联，以固定这个构象，然后透析除掉这种抑制剂。以定这个构象，然后透析除掉这种抑制剂。以丙酸作竞争性抑制剂，把核糖核酸酶制成一丙酸作竞争性抑制剂，把核糖核酸酶制成一种种“酸性酯酶酸性酯酶”。退出3.1 辅因子的共价结合辅因子的共价结合vNAD+衍生物共价结合到醇脱氢酶上之衍生物共价结合到醇脱氢酶上之后，酶仍具催化活性构象，活力仍有使后，酶仍具催化活性构象，活力仍有使用过量游离用过量游离NAD+时活力的时活力的40，而且，而且能抵抗能抵抗AMP的抑制。的抑制。 解决辅因子再循环的有效方法！解决辅因子再循环的有效方法！ 辅因子固定化后与固定化酶蛋白组合一辅因子固定化

22、后与固定化酶蛋白组合一起使用，起使用，（三）与辅因子相关的修饰（三）与辅因子相关的修饰退出3.2引入新辅因子或修饰过的辅因子引入新辅因子或修饰过的辅因子v次黄嘌呤次黄嘌呤黄嘌呤黄嘌呤 黄嘌呤脱氢酶黄嘌呤脱氢酶 黄嘌呤氧化酶黄嘌呤氧化酶 二硫化四乙基秋兰姆（巯基专一试剂）二硫化四乙基秋兰姆（巯基专一试剂）v将黄素溴衍生物与木瓜蛋白酶将黄素溴衍生物与木瓜蛋白酶Cys25共价结合共价结合为黄素木瓜蛋白酶，其动力学可与黄素酶相为黄素木瓜蛋白酶，其动力学可与黄素酶相比拟。比拟。退出3.3 金属酶的金属取代金属酶的金属取代v通过改变酶分子中所含的金属离子，可以改通过改变酶分子中所含的金属离子，可以改变酶的

23、专一性和稳定性等特性。变酶的专一性和稳定性等特性。v氨基酸酰化酶：氨基酸酰化酶：vZn 酶对乙酰酶对乙酰Ala的最适的最适pH 8.5，而，而Co酶为酶为7.0； Co酶对酶对N-氯乙酰氯乙酰Ala的水解活力增强，的水解活力增强，对对N-氯乙酰氯乙酰Met的水解活力降低。的水解活力降低。v超氧化物氧化酶：超氧化物氧化酶：vFe-SOD中的中的Fe被被Mn取代后，取代后，Mn-SOD对对H2O2稳定性增强，对稳定性增强，对NaN3的抑制作用显著的抑制作用显著降低。降低。退出举例举例 ：离子置换修饰方法：离子置换修饰方法 EDTA螯合金属离子螯合金属离子透析、超滤或分子筛层析，除去透析、超滤或分子

24、筛层析，除去EDTA金属金属螯合物螯合物加入不同金属离子加入不同金属离子锌型蛋白酶锌型蛋白酶钙型蛋白酶：钙型蛋白酶： 酶活力提高酶活力提高20-30% 淀粉酶的发酵生产、保存和应用过程淀粉酶的发酵生产、保存和应用过程中温中温 淀粉酶淀粉酶 0.01M Ca2+耐高温耐高温 淀粉酶淀粉酶 1.25mM 1.75mMCa2+退出举例举例v将锌型蛋白酶的将锌型蛋白酶的Zn2+除去，然后用除去，然后用Ca2+置换置换成钙型蛋白酶，则酶活力可提高成钙型蛋白酶，则酶活力可提高20-30%。若。若将钙型蛋白酶制成结晶，则其酶活力比锌型将钙型蛋白酶制成结晶，则其酶活力比锌型蛋白酶结晶的酶活力提高蛋白酶结晶的酶

25、活力提高2-3倍。倍。 退出第二节第二节 酶化学修饰的方法及修饰酶化学修饰的方法及修饰剂剂 v一、一、 修饰剂的要求修饰剂的要求v二、酶性质的了解二、酶性质的了解v三、三、 反应条件的选择反应条件的选择退出一、一、 修饰剂的要求修饰剂的要求v1 修饰剂的分子量、修饰剂链的长度修饰剂的分子量、修饰剂链的长度对蛋白质的吸附性。对蛋白质的吸附性。（要求有较大的分子（要求有较大的分子量）量）v2 修饰剂上反应基团的数目及位置。修饰剂上反应基团的数目及位置。（要求有较多的反应活性基团）（要求有较多的反应活性基团）v3 修饰剂上反应基团的活化方法与条修饰剂上反应基团的活化方法与条件。件。退出二、二、 酶性

26、质的了解酶性质的了解v1 酶活性部位情况酶活性部位情况v2 酶的稳定条件、酶反应最适条件酶的稳定条件、酶反应最适条件v3 酶分子侧链基团的化学性质及反应酶分子侧链基团的化学性质及反应活泼性等。活泼性等。退出三、三、 反应条件的选择反应条件的选择v1 反应体系中酶与修饰剂的分子比例。反应体系中酶与修饰剂的分子比例。v2 反应体系的溶剂性质，盐浓度和反应体系的溶剂性质，盐浓度和pH条件。条件。v3 反应温度及时间。反应温度及时间。退出第三节第三节 酶分子的化学修饰方法酶分子的化学修饰方法一、酶分子侧链基团的化学修饰一、酶分子侧链基团的化学修饰 （一）几种重要的修饰反应（一）几种重要的修饰反应 酰化

27、及其相关反应、烷化反应、氧化和还原反应、酰化及其相关反应、烷化反应、氧化和还原反应、芳香环取代反应芳香环取代反应（二）特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰（二）特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰 如巯基的化学修饰、氨基的化学修饰、羧基、二硫如巯基的化学修饰、氨基的化学修饰、羧基、二硫键等键等（三）（三） 研究新热点研究新热点 亲和修饰（亲和标记、专一性的不可逆抑制：）亲和修饰（亲和标记、专一性的不可逆抑制：）退出小分子修饰小分子修饰 （酶蛋白侧链基团修饰）（酶蛋白侧链基团修饰）定义：通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分定义：通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子侧链上特定的功能基团发生化学反应。子侧

28、链上特定的功能基团发生化学反应。侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。主要有：氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑主要有：氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。基。侧链基团修饰剂：采用的各种小分子化合物。侧链基团修饰剂：采用的各种小分子化合物。 2020种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的侧链易被修饰，它们一般具有亲核性。酸的侧链易被修饰，它们一般具有亲核性。退出几种重要的修饰反应：几种重要的修饰反应：烷基化反应烷基化反应酰化反应酰化反应氧化还原反应氧化还原反应芳香环取代反应芳香环取代反应退出氨基酸氨基酸侧链基

29、团侧链基团修饰剂修饰剂LysLys氨基氨基三硝基苯磺酸，三硝基苯磺酸，2 2，4 4二硝基氟苯、碘乙二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸AspAsp、GluGlu羧基羧基水溶性碳化二亚胺水溶性碳化二亚胺ArgArg胍基胍基苯乙二醛，苯乙二醛，1,21,2环己二酮、丁二酮环己二酮、丁二酮CysCys巯基巯基碘乙酸、碘乙酰胺、碘乙酸、碘乙酰胺、N-N-乙基马来酰亚胺乙基马来酰亚胺二硫键二硫键巯基乙醇、巯基乙醇、DTTDTTHisHis咪唑基咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸焦碳酸二乙酯、碘乙酸TyrTyr酚酚羟基羟基碘、四硝基甲烷碘、四硝基甲烷TrpTrp吲哚基吲哚

30、基N-N-溴代琥珀酰亚胺溴代琥珀酰亚胺 各种氨基酸侧链的修饰剂各种氨基酸侧链的修饰剂退出 但解释修饰效果须十分小心，因为：但解释修饰效果须十分小心，因为：任何一种修饰剂不是绝对专一的。任何一种修饰剂不是绝对专一的。有些修饰剂引起蛋白质构象变化有些修饰剂引起蛋白质构象变化失活，失活， 不一定是活性中心基团被共价修饰。不一定是活性中心基团被共价修饰。不同部分的相同基团，修饰效果不同，分子不同部分的相同基团，修饰效果不同，分子内部的必需基团，不易被修饰。内部的必需基团，不易被修饰。退出1)1)专一性化学修饰（基团专一性修饰）专一性化学修饰（基团专一性修饰） 用专一性化学修饰剂修饰酶活性中心的某一用专

31、一性化学修饰剂修饰酶活性中心的某一氨基酸残基的侧链基团。氨基酸残基的侧链基团。2)2)亲和标记（位点专一性修饰）亲和标记（位点专一性修饰） 采用的修饰试剂是根据底物的化学结构设计采用的修饰试剂是根据底物的化学结构设计合成的含有活泼反应基团的底物类似物。合成的含有活泼反应基团的底物类似物。作用机制作用机制利用酶对底物的特殊亲和力将酶加以修利用酶对底物的特殊亲和力将酶加以修饰标记。饰标记。亲和修饰亲和修饰退出化学修饰的专一性化学修饰的专一性退出亲和修饰剂：亲和修饰剂： 与与S S结构相似结构相似，与活性中心的氨基酸残基，与活性中心的氨基酸残基 亲和力大，而与活性中心以外的氨基酸亲和力大，而与活性中

32、心以外的氨基酸 残基亲和力小。残基亲和力小。具有活泼的化学基团具有活泼的化学基团（如卤素）可与活性（如卤素）可与活性 中心的基团形成稳定的共价键。中心的基团形成稳定的共价键。退出二、二、 有机大分子对酶的修饰有机大分子对酶的修饰（一）、概念（一）、概念利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法称为大分子结合修饰法，特性与功能的方法称为大分子结合修饰法，简称为大分子结合法。简称为大分子结合法。 是目前应用最广的酶分子修饰方法。是目前应用最广的酶分子修饰方法。退出（二）常使用的水溶

33、性大分子修饰剂（二）常使用的水溶性大分子修饰剂 糖及糖的衍生物糖及糖的衍生物 聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、糖肽、环）、右旋糖酐、糖肽、环糊精、葡聚糖、羧甲基纤维素糊精、葡聚糖、羧甲基纤维素大分子多聚物大分子多聚物 聚乙烯吡咯烷酮、乙烯醇、乙烯乙酸、聚聚乙烯吡咯烷酮、乙烯醇、乙烯乙酸、聚丙烯酸丙烯酸具有生物活性的大分子物质具有生物活性的大分子物质 肝素、蛋白质（血浆蛋白质，人血清白蛋肝素、蛋白质（血浆蛋白质，人血清白蛋白）白）修饰方法：修饰前活化，然后在一定条件下修饰方法：修饰前活化，然后在一定条件下与酶分子共价结合。与酶分子共价结合。退出糖及糖的衍生物：糖及糖的衍生物： PEG 线

34、性分子HOCH2 CH2OCH2)n CH2 OH 单甲氧基聚乙二醇（单甲氧基聚乙二醇（MPEG） 聚乙二醇聚乙二醇 通过了通过了美国美国FDA认证认证，符合美国药典，符合美国药典（USP），国家处方集），国家处方集(NF)，食品化学法典（，食品化学法典（FCC）标准，被广泛应用于食品、制药、饲料、个人护理标准，被广泛应用于食品、制药、饲料、个人护理品、化学等行业的生产，品、化学等行业的生产， 脂肪酶和蛋白酶经脂肪酶和蛋白酶经MPEG修饰后，可溶于有机修饰后，可溶于有机溶剂中。溶剂中。 退出应用：应用：如：如：PEGPEG超氧化物歧化酶（超氧化物歧化酶（SODSOD） PEGPEG溶血类蛋白质

35、（链激酶、尿激酶等）溶血类蛋白质（链激酶、尿激酶等） PEGPEG天门冬酰胺酶（天门冬酰胺酶（ASNaseASNase） 消除了抗原性消除了抗原性 延长了酶在体内的半衰期延长了酶在体内的半衰期又如：用又如：用DextranDextran修饰修饰 - -淀粉酶，淀粉酶， 淀粉酶，胰淀粉酶，胰蛋白酶、过氧化氢酶，蛋白酶、过氧化氢酶，提高了酶的热稳定性。提高了酶的热稳定性。退出（三）、蛋白质类修饰（三）、蛋白质类修饰v血浆蛋白质，其中人血清白蛋白应用较血浆蛋白质，其中人血清白蛋白应用较多多退出常用方法常用方法1戊二醛法：戊二醛双功能基团戊二醛法：戊二醛双功能基团 2碳二亚胺法：碳二亚胺作为交联碳二亚

36、胺法：碳二亚胺作为交联剂剂 3活性酯法：活性酯法：退出活性酯法- a 白蛋白琥珀酰化 退出活性酯法- b 活性酯形成反应 退出活性酯法- c 修饰反应 退出第四节第四节 修饰酶的性质及特点修饰酶的性质及特点v一热稳定性一热稳定性v二抗原性二抗原性v三体内半衰期三体内半衰期v四最适四最适pHv五酶学性质的改变五酶学性质的改变v六对组织的分布能力变化六对组织的分布能力变化退出一、热稳定性v热稳定性增加热稳定性增加1修饰剂与酶多点交联，固定了酶的分子修饰剂与酶多点交联，固定了酶的分子构象，增强了酶的热稳定性。构象，增强了酶的热稳定性。2增强酶天然构象的稳定性减少了酶热失增强酶天然构象的稳定性减少了酶

37、热失活。活。 退出退出二、抗原性部分可消除。部分可消除。PEG、人血清白蛋白在消除、人血清白蛋白在消除酶抗原性上效果明显。酶抗原性上效果明显。 退出退出退出三、三、 体内半衰期延长体内半衰期延长 退出四、最适pH有些酶经过化学修饰后，最适有些酶经过化学修饰后，最适pH发生变化发生变化接近生理环境接近生理环境,临床上更有意义临床上更有意义 退出五、酶学性质的改变 绝大多数酶经过修饰后，最大反应速绝大多数酶经过修饰后，最大反应速度没有改变，但有些酶在修饰后，米氏度没有改变，但有些酶在修饰后，米氏常数会增大。常数会增大。退出六、对组织的分布能力变化 对组织的分布能力有所改变，能在血液中被对组织的分布

38、能力有所改变，能在血液中被靶器官选择性地吸收。靶器官选择性地吸收。a-葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶(白蛋白修饰白蛋白修饰) 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(聚赖氨酸修饰聚赖氨酸修饰) 穿透细胞的穿透细胞的能力增加能力增加溶菌酶溶菌酶(糖肽交联糖肽交联,再去处糖肽末端唾液酸再去处糖肽末端唾液酸,暴暴露出半乳糖残基露出半乳糖残基)退出第五节第五节 酶化学修饰的应用酶化学修饰的应用 一、化学修饰在酶的结构与功能研究一、化学修饰在酶的结构与功能研究中的应用中的应用 生物技术领域：生物技术领域：改变酶的最适改变酶的最适pH、改变、改变酶底物专一性、有机溶剂可溶解酶、提酶底物专一性、有机溶剂可溶解酶、提高酶耐热、酸、碱的能力高酶耐热、酸、碱的能力