种子的扩大培养 (2)课件.ppt

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1、关于种子的扩大培养(2)现在学习的是第1页，共25页2学习目标学习目标v了解基本概念、种子培养的一般过程及培养各阶段的目的要求；v理解种子培养的各种影响因素；v掌握接种方法、种子质量控制方法、种子培养中的问题分析及处理手段。现在学习的是第2页，共25页3种种子子及及发发酵酵级级数数 孢孢子子(或或菌菌丝丝)接接入入到到体体积积较较小小的的种种子子罐罐中中，经经培培养养后后形形成成大大量量的的菌菌丝丝一一级级种种子子；把把一一级级种种子子转转入入发发酵酵罐罐内内发发酵酵，称称为二级发酵。为二级发酵。如如果果将将一一级级种种子子接接入入体体积积较较大大的的种种子子罐罐内内，经经过过培培养养形形成成

2、更更多多的菌丝的菌丝二级种子；将二级种子转入发酵罐内发酵，称为三级发酵。二级种子；将二级种子转入发酵罐内发酵，称为三级发酵。使用三级种子的发酵，称为四级发酵。使用三级种子的发酵，称为四级发酵。第一节第一节基本概念基本概念种子培养种子培养 指提供给种子适宜的生长繁殖条件，使种子能够迅速指提供给种子适宜的生长繁殖条件，使种子能够迅速生长成合格的菌体的过程。生长成合格的菌体的过程。种子的扩大培养种子的扩大培养 休眠状态休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过过扁瓶或摇瓶扁瓶或摇瓶及及种子罐逐级扩大培养种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量纯种的过而获得一定数量和

3、质量纯种的过程。程。现在学习的是第3页，共25页4接种接种 将孢子或菌落，或试管、三角瓶或种子罐中菌体接将孢子或菌落，或试管、三角瓶或种子罐中菌体接入培养容器的操作过程。入培养容器的操作过程。接种量接种量移种的移种的种子液体种子液体积积和和培养液体培养液体积积之比。之比。接接种种龄龄 种种子子罐罐中中培培养养的的菌菌体体开开始始移移种种到到下下一一级级种种 子罐或发酵罐的培养时间。子罐或发酵罐的培养时间。双种法双种法 2个种子罐的种子接人个种子罐的种子接人1个发酵罐的接种方法。个发酵罐的接种方法。倒倒种种法法 以以适适宜宜的的发发酵酵液液倒倒出出部部分分对对另另一一发发酵酵罐罐作作为为种种子的

4、接种方法。子的接种方法。混种法混种法 以种子液和发酵液混合作为发酵罐的种子的接种以种子液和发酵液混合作为发酵罐的种子的接种方法。方法。现在学习的是第4页，共25页5种种醪醪 接接入入至至种种子子罐罐中中的的种种子子经经培培养养后后所所得得的的含含有有一一定菌体浓度的种子液。定菌体浓度的种子液。专专性性好好气气菌菌 只只有有在在空空气气或或氧氧O2 2存存在在的的条条件件下下才才能能生生长长的的菌体，氧为呼吸过程中的最终受氢体。菌体，氧为呼吸过程中的最终受氢体。专专性性厌厌气气菌菌 只只有有在在没没有有空空气气或或无无氧氧条条件件下下才才能能生生长长的的菌菌体，分子态氧对它们有毒害作用，如丙酮丁

5、醇梭状芽孢杆菌。体，分子态氧对它们有毒害作用，如丙酮丁醇梭状芽孢杆菌。兼兼性性好好气气菌菌或或兼兼性性厌厌气气菌菌 既既能能在在空空气气或或有有氧氧条条件件下下生生长长，又又能能在在没没有有空空气气或或缺缺氧氧条条件件下下生生长长的的菌菌体体。包包括括酵酵母母菌菌及部分细菌。及部分细菌。现在学习的是第5页，共25页6第二节第二节 种子培养过程种子培养过程 包括：孢子制备过程，种子制备过程包括：孢子制备过程，种子制备过程 一、种子制备工艺一、种子制备工艺 实验室阶段和种子罐生产培养阶段实验室阶段和种子罐生产培养阶段1 1实验室种子制备实验室种子制备（1 1）斜面种子培养）斜面种子培养 活化菌种，

6、同时也培养一定数量的斜面种子。活化菌种，同时也培养一定数量的斜面种子。（2 2）液体培养）液体培养 包括液体试管和三角瓶摇床震荡或回旋式培养。包括液体试管和三角瓶摇床震荡或回旋式培养。液液体体试试管管培培养养 无无菌菌条条件件下下，用用接接种种针针自自斜斜面面试试管管挑挑取取一一环环斜斜面面种种子子菌菌体体，接接入入装装有有液液体体培培养养液液的的试试管管，摇摇匀匀后后，置置培培养养箱箱培培养养，待待培培养养成成熟熟后，再接入三角瓶培养。后，再接入三角瓶培养。三角瓶液体培养（摇瓶种子）三角瓶液体培养（摇瓶种子）现在学习的是第6页，共25页7现在学习的是第7页，共25页82.2.生产车间种子制备

7、生产车间种子制备（1）种种子子罐罐级级数数的的确确定定 指指制制备备种种子子需需逐逐级级扩扩大大培培养养的的次次数。数。种种子子罐罐级级数数主主要要决决定定于于菌菌种种的的生生长长特特性性，孢孢子子发发芽芽及菌体生长繁殖速度，以及所采用的发酵罐容积。及菌体生长繁殖速度，以及所采用的发酵罐容积。种种子子制制备备目目的的 形形成成一一定定数数量量和和质质量量的的菌菌体体。孢孢子子发发芽芽和和菌体开始繁殖时，菌体量很少，在菌体开始繁殖时，菌体量很少，在小型罐小型罐内即可进行。内即可进行。发发酵酵目目的的 获获得得大大量量的的发发酵酵产产物物。产产物物是是在在菌菌体体大大量量形形成成并并达达到到一一定

8、定生生长长阶阶段段后后形形成成的的，需需要要在在大大型型发发酵酵罐罐内内才才能能进进行行。同同时时许许多多发发酵酵产产物物的的产产生生菌菌，其其不不同同的的生生长长阶阶段对营养和培养条件的要求有差异。段对营养和培养条件的要求有差异。现在学习的是第8页，共25页9生生长长缓缓慢慢的的菌菌种种，如如果果没没有有经经过过多多级级种种子子扩扩大大培培养养就就接接种种到到发发酵酵罐罐，将将延延长长发发酵酵周周期期，使使生生产产能能力力下下降降。进进行行多多级级种种子子扩扩大大培培养养后后再再移移种种至至发发酵酵罐罐是是工工业化生产所必须的。业化生产所必须的。种种子子罐罐级级数数越越少少，越越有有利利于于

9、简简化化工工艺艺和和控控制制，并并减减少由于多次转种而带来的染菌机会。少由于多次转种而带来的染菌机会。现在学习的是第9页，共25页10种子罐工艺控制：种子罐工艺控制：孢子量；孢子量；罐温；罐温；罐压；罐压；通气量；通气量；搅拌搅拌 pHpH、离心等参数控制；、离心等参数控制；种龄；种龄；培养基；培养基；灭菌及降温时间灭菌及降温时间 现在学习的是第10页，共25页11（2 2）接种量的确定）接种量的确定 与与该该菌菌在在发发酵酵罐罐中中生生长长繁繁殖殖的的速速度度、种种子子质质量量和和发发酵酵条条件件等等有有关。关。a.a.接接种种量量过过多多，菌菌丝丝生生长长过过快快、过过稠稠，培培养养液液粘

10、粘度度增增加加，营营养养基质缺乏或溶解氧不足，影响产物的合成。基质缺乏或溶解氧不足，影响产物的合成。b b.接接种种量量过过小小，引引起起发发酵酵前前期期菌菌体体生生长长缓缓慢慢，使使发发酵酵周周期期延延长长，菌丝量少，还可能产生菌丝团，导致发酵异常。菌丝量少，还可能产生菌丝团，导致发酵异常。生产上多以大接种量和丰富培养基作为高产措施生产上多以大接种量和丰富培养基作为高产措施 多数抗生素发酵接种量为多数抗生素发酵接种量为7 71515，有时可加大到，有时可加大到20202525。（3 3）接接种种龄龄的的确确定定 接接种种龄龄以以处处于于生生命命力力旺旺盛盛的的对对数数生生长长期期的菌丝最为合

11、适，实验确定。的菌丝最为合适，实验确定。现在学习的是第11页，共25页12（4）种子质量的判断方法）种子质量的判断方法 测定的参数有测定的参数有pH；培养基灭菌后的糖、氨基氮、磷的含量；培养基灭菌后的糖、氨基氮、磷的含量；菌菌丝丝形形态态、菌菌丝丝浓浓度度和和培培养养液液外外观观(色色素素、颗颗粒粒等等)；其他参数。如转种前的抗生素含量、某种酶活力其他参数。如转种前的抗生素含量、某种酶活力等。等。现在学习的是第12页，共25页13v（5）种子质量的控制措施）种子质量的控制措施 v菌菌种种稳稳定定性性检检查查 定定期期考考察察和和挑挑选选菌菌种种；对对菌菌种种进进行行自自然然分分离离；摇摇瓶瓶发

12、发酵酵，测测定定其其生生产产能能力力，从从中中挑挑选具有较高生产能力的高产菌株。选具有较高生产能力的高产菌株。v适适宜宜的的生生长长环环境境 包包括括营营养养丰丰富富的的培培养养基基、适适宜宜的的培养温度和湿度、合理的通气量等。培养温度和湿度、合理的通气量等。v种种子子无无杂杂菌菌检检查查 每每移移种种一一步步均均需需要要进进行行无无菌菌检检查查，并对种子液进行生化分析。并对种子液进行生化分析。现在学习的是第13页，共25页14米孢子质量米孢子质量无菌状况必须保证（无菌室操作，无菌样监测，无无菌状况必须保证（无菌室操作，无菌样监测，无菌室的管理，菌室的管理，灭菌锅温度和压力的校验）灭菌锅温度和

13、压力的校验）菌落形态的挑选菌落形态的挑选 原材料的质量保证（玉米浆原材料的质量保证（玉米浆/小米等有机氮源质量易小米等有机氮源质量易波动，产地波动，产地/厂家厂家/摇摇 瓶）瓶）培养基（配方，灭菌，孢子数量需求）培养基（配方，灭菌，孢子数量需求）接种量适当接种量适当 培养过程温度和湿度（空调及恒温恒培养过程温度和湿度（空调及恒温恒湿机的保障）湿机的保障）培养时间培养时间现在学习的是第14页，共25页15种子罐生长的好坏种子罐生长的好坏v无菌状况必须保证（罐体本身、各系统设备及管无菌状况必须保证（罐体本身、各系统设备及管线的灭菌）线的灭菌）v培养基（配方，灭菌及降温过程）培养基（配方，灭菌及降温

14、过程）v原材料质量的稳定（玉米浆原材料质量的稳定（玉米浆/蔗糖及无机盐的质量蔗糖及无机盐的质量控制）控制）v接种孢子数量控制接种孢子数量控制 v工艺控制：罐温；罐压；空气；工艺控制：罐温；罐压；空气；pHpH；搅拌；离心；搅拌；离心量；移种周期控制量；移种周期控制现在学习的是第15页，共25页163 3接种方法接种方法（1）压差接种）压差接种 利用两端压力差，液体从高压流向低压的接种方法。利用两端压力差，液体从高压流向低压的接种方法。孢子悬液接种孢子悬液接种 种醪接种种醪接种（2）注注射射接接种种 用用于于种种子子罐罐接接种种，在在罐罐顶顶接接种种管管口口压压盖一层橡胶膜，将注射器针嘴插入橡胶

15、膜进行接种。盖一层橡胶膜，将注射器针嘴插入橡胶膜进行接种。（3）摇摇瓶瓶直直接接进进罐罐法法 适适合合种种子子罐罐接接种种，一一般般需需三三人人配合操作。配合操作。现在学习的是第16页，共25页17二、注意事项二、注意事项（1 1）按照无菌操作）按照无菌操作（2 2）消毒灭菌一定要彻底、干净）消毒灭菌一定要彻底、干净（3 3）在在接接种种操操作作中中，一一定定要要严严格格按按照照无无菌菌操操作作进进行行，规规范范生生产产操操作作，严严禁禁误误操操作作带带来来的的杂杂菌菌污污染染，经经常常提提醒醒，建建立立严严格格的的无无菌菌概概念念，避避免免出现二次污染。出现二次污染。（4 4）生生产产中中使

16、使用用的的斜斜面面菌菌种种不不宜宜多多次次移移接接，一一般般只只移移接接三三次次(三三代代)，以以免免由由于于菌菌种种的的自自然然变变异异引引起起菌菌种种不不纯纯。因因此此，要要经经常常进进行行菌菌种种的分离纯化，不断提供新的斜面菌株供生产使用。的分离纯化，不断提供新的斜面菌株供生产使用。（5 5）按不同菌种的不同生理特征，选用不同的工艺来生产发酵所）按不同菌种的不同生理特征，选用不同的工艺来生产发酵所用的种子。即使是相同的发酵生产，也要根据本单位的具体条用的种子。即使是相同的发酵生产，也要根据本单位的具体条件对工艺操作方法加以调整。件对工艺操作方法加以调整。现在学习的是第17页，共25页18

17、（6 6）在在种种子子制制备备过过程程中中，要要特特别别加加强强对对影影响响种种子子质质量量的各种因素的调控。的各种因素的调控。（7 7）对对已已有有的的优优良良生生产产品品种种的的菌菌种种，要要采采取取相相应应的的方方法法，使使其其在在尽尽量量长长的的时时间间内内保保持持生生产产性性能能稳稳定定、死死亡率低、变异少。亡率低、变异少。（8 8）已已经经退退化化的的菌菌种种，要要及及时时进进行行分分离离纯纯化化，通通过过复复状，恢复菌种的优良性能。状，恢复菌种的优良性能。（9）种种子子通通过过接接种种管管道道进进行行移移种种时时，移移种种过过程程中中要要防防止接受罐表压降至零，否则会引起染菌。止

18、接受罐表压降至零，否则会引起染菌。现在学习的是第18页，共25页19第三节第三节问题分析及处理手段问题分析及处理手段一、种子培养过程中影响因素一、种子培养过程中影响因素1孢子培养过程中的影响因素孢子培养过程中的影响因素（1 1）原原材材料料质质量量 无无机机离离子子（如如微微量量元元素素MnMn2+2+、CuCu2+2+、BaBa2+2+）能能刺刺激激孢孢子子的形成，磷含量也会影响孢子的质量。的形成，磷含量也会影响孢子的质量。（2 2）培培养养温温度度 过过低低菌菌种种生生长长发发育育缓缓慢慢；过过高高菌菌体体代代谢谢活活动动加加快快，缩缩短培养时间，使孢子成熟早，易老化，引起菌丝过早自溶。短

19、培养时间，使孢子成熟早，易老化，引起菌丝过早自溶。（3 3）湿度）湿度 湿度小，孢子生长快；湿度大，孢子生长慢。湿度小，孢子生长快；湿度大，孢子生长慢。（4）斜斜面面冷冷藏藏时时间间 孢孢子子成成熟熟，不不易易导导致致菌菌体体自自溶溶，冷冷藏藏时时间间可可长长；反之，应缩短冷藏时间。反之，应缩短冷藏时间。（5）接接种种量量 接接种种后后菌菌落落均均匀匀分分布布整整个个斜斜面面，隐隐约约可可分分菌菌落落者者为为正正常常。过小，菌落稀疏；过大，菌落密集一片。过小，菌落稀疏；过大，菌落密集一片。现在学习的是第19页，共25页202 2种子罐培养过程中的影响因素种子罐培养过程中的影响因素（1）原料）原

20、料 选选择择有有利利于于孢孢子子发发芽芽和和菌菌丝丝生生长长的的培培养养基基，营营养养易易于于被被菌菌体体直直接接吸吸收收和和利利用用，成成分分适适当当，氮氮源源、维维生素含量较高。生素含量较高。营营养养成成分分要要尽尽可可能能和和发发酵酵培培养养基基接接近近，且且略略稀稀薄为宜。薄为宜。（2 2）培养条件）培养条件 温温度度 温温度度高高，细细胞胞中中的的生生化化反反应应快快，生生长长速速率率快快；菌菌体体蛋蛋白白质质、核核酸酸等等对对温温度度较较敏敏感感，温温度度过过高高可可能能被被破破坏坏。微微生生物物生生长长温温度度在在-10-109595。发发酵酵菌菌株株生长最适温度为生长最适温度为

21、20204040。现在学习的是第20页，共25页21pHpH值值 影影响响微微生生物物对对营营养养物物质质的的吸吸收收、酶酶的的形形成成及及其活力等。其活力等。大多数大多数为为pH4pH49 9，少数在，少数在pH2pH1010。通气量通气量 保证菌种代谢对氧的需求，提高种子的质量。保证菌种代谢对氧的需求，提高种子的质量。搅搅拌拌 保保证证溶溶氧氧及及种种子子罐罐内内各各处处条条件件均均一一，利利于于种种子的培养。可避免菌丝结团、粘壁等现象发生。子的培养。可避免菌丝结团、粘壁等现象发生。现在学习的是第21页，共25页22二、常见问题及其处理手段二、常见问题及其处理手段1.1.种子生长缓慢：种子

22、生长缓慢：主要原因：主要原因：原材料质量的波动；原材料质量的波动；接种孢子量不足；接种孢子量不足；灭菌温度灭菌温度/时间过长或降温时间过长时间过长或降温时间过长 罐温、通气量、搅拌等不符合要求；罐温、通气量、搅拌等不符合要求；其它异常情况其它异常情况 处理方式：处理方式：适当升温控制适当升温控制 空气流量加大空气流量加大 适当延长种子周期适当延长种子周期 现在学习的是第22页，共25页232.2.种子罐染菌：种子罐染菌：主要原因主要原因 罐内有死角；罐内有死角；灭菌不彻底；灭菌不彻底；接种失误；接种失误；孢子本身孢子本身 带菌；带菌；种子罐空气系统、移种管线、相关种子罐空气系统、移种管线、相关

23、管线及阀门出现问题等管线及阀门出现问题等 处理方式：放弃种子，实施处理方式：放弃种子，实施倒种倒种现在学习的是第23页，共25页243.3.菌丝结团菌丝结团 （现象？）（现象？）主要原因：主要原因：搅拌；搅拌；通气；通气；孢子量小；孢子量小；泡泡沫大等沫大等 处理方式：分析原因，对症解决处理方式：分析原因，对症解决4.4.种子罐泡沫大种子罐泡沫大 主要原因：主要原因：玉米浆的质量有波动；玉米浆的质量有波动；消沫剂的质量有问题；消沫剂的质量有问题；处理方式：间歇搅拌，提高罐压，加大空气翻腾处理方式：间歇搅拌，提高罐压，加大空气翻腾液面压泡，待菌丝长起来后泡沫即可减小液面压泡，待菌丝长起来后泡沫即可减小现在学习的是第24页，共25页感感谢谢大大家家观观看看现在学习的是第25页，共25页