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1、1第三章 种子扩大培养2n n1 1、种子扩大培养：、种子扩大培养：将保存在砂土管，冷冻干燥管中处将保存在砂土管，冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经扁于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种的过程。量的纯种的过程。n n这些纯种培养物称为种子。n n2 2种子培养任务：种子培养任务：保持生产菌种的优良生产性能，得保持生产菌种的优良生产性能，得到比较纯净的种子，菌健壮，还要有足够的量，以供到比较纯净的种子，菌健壮，还要有足够的量，以供大规模生产用。大规模生产用。n n
2、种子培养质量的好坏，关系到发酵产物的产量、质量。种子培养质量的好坏，关系到发酵产物的产量、质量。n n3 3生产菌种的基本要求生产菌种的基本要求n n一个发酵产物可有多种产生菌，但产生菌不等于生产一个发酵产物可有多种产生菌，但产生菌不等于生产菌，作为生产菌要有菌，作为生产菌要有一定条件和要求：一定条件和要求：3n n（1 1）高产稳产性能）高产稳产性能：合成能力高，遗传性相对稳定（遗传特性合成能力高，遗传性相对稳定（遗传特性包括生产性能，生理特性，形态特性）菌种不衰退、难变异。包括生产性能，生理特性，形态特性）菌种不衰退、难变异。n n（2 2）要求较粗放：）要求较粗放：较易培养，生长繁殖较快
3、，可利用比较多种较易培养，生长繁殖较快，可利用比较多种的原料，此原料要求经济易得。培养快表现在发酵周期短，生的原料，此原料要求经济易得。培养快表现在发酵周期短，生产工艺简便产工艺简便用一般的生产方法可生产，易提炼，要有一定用一般的生产方法可生产，易提炼，要有一定抗污染的能力，包括抗杂菌，抗噬菌体。抗污染的能力，包括抗杂菌，抗噬菌体。n n（3 3）非病原菌）非病原菌：对发酵操作如此，且发酵产品用于食品，医药：对发酵操作如此，且发酵产品用于食品，医药有很大部分，用于此类的菌还要求不产生毒素。有很大部分，用于此类的菌还要求不产生毒素。n n（4 4）最好能耐自身代谢产物，最好可耐高、低温，可耐高温
4、则）最好能耐自身代谢产物，最好可耐高、低温，可耐高温则热天可生产，省下冷却水，最好可耐酸碱。最好产生泡沫少，热天可生产，省下冷却水，最好可耐酸碱。最好产生泡沫少，泡沫多，则需消耗消泡剂多，产品提炼困难。泡沫多，则需消耗消泡剂多，产品提炼困难。n n现生产菌种大多为人工长期选育的变异株（或突变体），要完现生产菌种大多为人工长期选育的变异株（或突变体），要完全符合以上四条的很少，且其会衰退变异，因而要不断选育新全符合以上四条的很少，且其会衰退变异，因而要不断选育新的菌种。的菌种。4n n4 4生产上的防止菌种的变异和衰退，采取以下措施生产上的防止菌种的变异和衰退，采取以下措施n n（1 1）适宜的
5、保存方法：主要原理是利用低温、干燥、）适宜的保存方法：主要原理是利用低温、干燥、真空；如斜面、砂土、矿物油。真空；如斜面、砂土、矿物油。n n（2 2）限制使用期：斜面）限制使用期：斜面1-21-2月移植；砂土月移植；砂土1-21-2年。年。n n（3 3）减少传代次数，限制菌种的开启次数，为防染菌）减少传代次数，限制菌种的开启次数，为防染菌n n（4 4）定期分纯：必用单细胞或单孢子的分离，分离后）定期分纯：必用单细胞或单孢子的分离，分离后的单细胞（单孢子）要进行生产能力的测定，要求不的单细胞（单孢子）要进行生产能力的测定，要求不低于原有的菌种。低于原有的菌种。5第一节 种子的制备过程n n
6、种子制备的过程大致可分为：n n实验室种子制备阶段实验室种子制备阶段 n n生产车间种子制备阶段生产车间种子制备阶段 6n n制备过程：制备过程：实验室：实验室：保存菌种保存菌种斜面上活化斜面上活化悬浮液（如为孢子叫孢悬液）悬浮液（如为孢子叫孢悬液）生产车间：一级种子罐生产车间：一级种子罐二级种子罐二级种子罐发酵罐发酵罐 一、实验室种子制备一、实验室种子制备n n（1 1）产孢子多的可用米粒）产孢子多的可用米粒 用大（小）米或玉米、麦片为原料（原料简单易得，成本用大（小）米或玉米、麦片为原料（原料简单易得，成本低）繁殖孢子的数量较多。要严格控制灭菌的含水量。低）繁殖孢子的数量较多。要严格控制灭
7、菌的含水量。接种时砂土管或冷冻管接种时砂土管或冷冻管悬浮液悬浮液大（小）米粒培养基大（小）米粒培养基成熟（亲米）成熟（亲米）大（小）米培养基大（小）米培养基培养成熟（生产米）培养成熟（生产米）(进种进种子罐子罐)n n（2 2）产孢子能力不强或发芽慢者）产孢子能力不强或发芽慢者摇瓶摇瓶得菌丝体得菌丝体n n（3 3）斜面）斜面活化几次活化几次摇瓶摇瓶7（一）孢子的制备1，细菌孢子的制备细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。培养温度一般为37C。细菌菌体培养时间一般为12天，产芽孢的细菌培养则需要510天。82，霉菌孢子的制备 霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产
8、品为培养基。培养的温度一般为2528C。培养时间一般为414天。93，放线菌孢子的制备 放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。培养温度一般为28C。培养时间为514天。10（二）液体种子制备1，好氧培养：对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产链霉素的灰色链霉菌（S.griseus）、产卡那霉素的卡那链霉菌（S.Kanamuceticus）可以用摇瓶液体培养法。将孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇瓶机上恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子。试管三角瓶摇床种子罐 112，厌氧培养：对于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等）试
9、管三角瓶卡式罐种子罐 12二、生产车间种子制备n n实验室制备的孢子或液体种子移种至种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽因不同菌种而异，但其原则为采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等，如果是需氧菌，同时还需供给足够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝）体在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。13n n1，种子罐的作用：n n主要是使孢子发芽，生长繁殖成菌（丝）体，接入发酵罐能迅速生长，达到一定的菌体量，以利于产物的合成。14n n2 2，种子罐级数的确定，种子罐级数的确定 n n种子罐级数：是指制备种子需逐级扩大培养的次数，种子罐级数：是指制备种子需逐级扩大培养的次数，生产上只有一级发酵不
10、合算，故生产上至少要用二级生产上只有一级发酵不合算，故生产上至少要用二级发酵，但种子罐级数多，则设备多，污染的机会也多，发酵，但种子罐级数多，则设备多，污染的机会也多，工艺就复杂了，故也不可太多级种子罐（实验室用一工艺就复杂了，故也不可太多级种子罐（实验室用一级发酵）级发酵）n n1 1种子罐级数的决定种子罐级数的决定n n（1 1）根据生产菌的特性：生产繁殖快慢，产孢子能力）根据生产菌的特性：生产繁殖快慢，产孢子能力大小。孢子发芽率，发芽时间。大小。孢子发芽率，发芽时间。n n 如生长繁殖快，孢子多，发芽率高，发时时间短，如生长繁殖快，孢子多，发芽率高，发时时间短，则级数少则级数少n n（2
11、 2）根据发酵罐的接种量：）根据发酵罐的接种量：n n（3 3）发酵罐与种子罐的体积比）发酵罐与种子罐的体积比 V V发酵罐发酵罐/V/V种子罐种子罐n n 比数越大，种子级数越大。比数越大，种子级数越大。15 发酵罐接种量少，则级数少，接种量决定于发酵罐接种量少，则级数少，接种量决定于 根据菌的生长特性（生长快接种量少），看接种菌，如细菌接根据菌的生长特性（生长快接种量少），看接种菌，如细菌接种量种量0.1-5%0.1-5%，酵母菌，酵母菌10%10%，霉菌放线菌，霉菌放线菌7-15%7-15%（但霉菌也有少（但霉菌也有少的，如制霉菌素，的，如制霉菌素，NystatirNystatir只用只
12、用1%1%）根据种子质量：活力高则接种量少根据种子质量：活力高则接种量少n n现相当多的产品采用大接种量，如庆大霉素发酵的接种量达现相当多的产品采用大接种量，如庆大霉素发酵的接种量达20-20-25%25%，n n大接种量优点和缺点大接种量优点和缺点:16n n优点：优点：n na.a.可缩短发酵罐中菌的生长期，则产物合成的时间可提前，则可缩短发酵罐中菌的生长期，则产物合成的时间可提前，则整个合成时期就增加了，不少种子液中会有水解酶类，有利于整个合成时期就增加了，不少种子液中会有水解酶类，有利于发酵利用。发酵利用。n nb.b.可有效地防止发酵罐的前期染菌，有相当部分的特别是抗生可有效地防止发
13、酵罐的前期染菌，有相当部分的特别是抗生素的生产，种子液中就有抗生素，可利用之抑菌。素的生产，种子液中就有抗生素，可利用之抑菌。n n缺点：缺点：n na.a.要求种子罐多要求种子罐多n nb.b.种子液中含代谢废物，副产物，在发酵罐中可能抑制菌的生种子液中含代谢废物，副产物，在发酵罐中可能抑制菌的生长和产物的合成。长和产物的合成。n n具体接种多少要经过实验和生产检验。具体接种多少要经过实验和生产检验。17n n细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。n n 茄子瓶种子罐发酵罐 n n霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵 n n 孢子悬浮液一级种子罐（27C,40小时孢子发芽，产生菌
14、丝）二级种子罐（27C,1024小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）发酵罐 n n放线菌：生长更慢，采用四级发酵n n酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子。18n n确定种子罐级数需注意的问题n n种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会机会n n种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会酵罐的生产率，增加染菌机会n n虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定。但虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定。但也与所选用工艺条件有关。如改变种子罐的培养条也与所选用工艺
15、条件有关。如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。少种子罐的级数。19第二节 种子质量的控制一、影响孢子质量的因素及控制n n培养基n n培养条件n n培养时间和冷藏时间201，培养基n n生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材料质量波动。要原因是原材料质量波动。n n例如在四环素、土霉素生产中，配制产孢子斜面培养基例如在四环素、土霉素生产中，配制产孢子斜面培养基用的麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同用的麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用
16、量的不同对孢子质量的影响也不同。对孢子质量的影响也不同。n n蛋白胨加工原料不同如鱼胨或骨胨对孢子影响也不同。蛋白胨加工原料不同如鱼胨或骨胨对孢子影响也不同。n n原材料质量的波动，起它要作用的是其中无机离子原材料质量的波动，起它要作用的是其中无机离子含量不同，如微量元素含量不同，如微量元素MgMg2+2+、CuCu2+2+、BaBa2+2+能刺激能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也会影响孢子的质孢子的形成。磷含量太多或太少也会影响孢子的质量。量。21n n水质的影响：地区不同、季节变化和水源污染，均可造成水质波动，影响种子质量。n n菌种在固体培养基上可呈现多种不同代谢类型的菌落，氮源品种越
17、多，出现的菌落类型也越多，不利于生产的稳定。22n n措施n n培养基所用原料要经过发酵试验合格才可使培养基所用原料要经过发酵试验合格才可使用用n n严格控制灭菌后培养基的质量严格控制灭菌后培养基的质量n n斜面培养基使用前，需在适当温度下放置一斜面培养基使用前，需在适当温度下放置一定时间定时间n n供生产用的孢子培养基要用比较单一的氮源，供生产用的孢子培养基要用比较单一的氮源，作为选种或分离用的培养基则采用较复杂的作为选种或分离用的培养基则采用较复杂的有机氮源有机氮源232，培养条件（1）温度 温度对多数品种斜面孢子质量有显著的影响。如土霉素生产菌种在高于37C培养时，孢子接入发酵罐后出现糖
18、代谢变慢，氨基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。一般各生产单位都严格控制孢子子斜面的培养温度。24（2 2）湿度）湿度 制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量和质量有较大的制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量和质量有较大的影响。例如土霉素生产菌种龟裂链霉菌，孢子制备时发现：影响。例如土霉素生产菌种龟裂链霉菌，孢子制备时发现：在北方气候干燥地区孢子斜面长得较快，在含有少量水分在北方气候干燥地区孢子斜面长得较快，在含有少量水分的试管斜面培养基下部孢子长得较好，而斜面上部由于水的试管斜面培养基下部孢子长得较好，而斜面上部由于水分迅速蒸发呈干疤状，孢子稀少。在气温高含湿度大的地分迅速蒸发呈干疤状
19、，孢子稀少。在气温高含湿度大的地区，斜面孢子长得慢，主要由于试管下部冷凝水多而不利区，斜面孢子长得慢，主要由于试管下部冷凝水多而不利于孢子的形成。从表中看出相对湿度在于孢子的形成。从表中看出相对湿度在40%45%40%45%时孢子数时孢子数量最多，且孢子颜色均匀，质量较好。量最多，且孢子颜色均匀，质量较好。253，培养时间和冷藏时间（1）培养时间n n一般来说，衰老的孢子不如年轻的孢子，因为衰老的孢子已在逐步进入发芽阶段，核物质趋于分化状态。过于衰老的孢子会导致生产能力的下降。n n措施：孢子培养的时间应该控制在孢子量多、孢子成熟、发酵产量正常的阶段终止培养。26（2 2）冷藏时间）冷藏时间n
20、 n斜面冷藏对孢子质量的影响与孢子成熟程度有关。斜面冷藏对孢子质量的影响与孢子成熟程度有关。如土霉素生产菌种孢子斜面培养如土霉素生产菌种孢子斜面培养4 4天左右即于天左右即于4 4 C C冰箱保存，发现冷藏冰箱保存，发现冷藏7878天菌体细胞开始自天菌体细胞开始自溶。而培养溶。而培养5 5天以后冷藏，天以后冷藏，2020天未发现自溶。天未发现自溶。n n冷藏时间对孢子的生产能力也有影响。例如在链冷藏时间对孢子的生产能力也有影响。例如在链霉素生产中，斜面孢子在霉素生产中，斜面孢子在6 6 C C冷藏两个月后的发冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月降低酵单位比冷藏一个月降低18%18%，冷藏，冷藏3
21、 3个月后降个月后降低低35%35%。274，接种量n n接种量大小影响到培养基中孢子的数量，进而影响菌体的生理状况。28二、影响种子质量的因素及控制n n孢子的质量n n培养基n n培养条件n n种龄n n接种量291，培养基n n营养成分适合种子培养的需要n n选择有利于孢子发芽和菌体生长的培养基；选择有利于孢子发芽和菌体生长的培养基；n n营养上要易于被菌体直接吸收和利用；营养上要易于被菌体直接吸收和利用；n n营养成分要适当丰富和完全，氮源和维生营养成分要适当丰富和完全，氮源和维生素含量要高素含量要高n n营养成分要尽可能与发酵培养基相近。302 2，培养条件，培养条件（1 1）温度）
22、温度（2 2）通气量）通气量 在种子罐中培养的种子除保证供给易被利用在种子罐中培养的种子除保证供给易被利用的培养基外，有足够的通气量可以提高种子的培养基外，有足够的通气量可以提高种子质量。例如，青霉素的生产菌种在制备过程质量。例如，青霉素的生产菌种在制备过程中将通气充足和不足两种情况下得到的种子中将通气充足和不足两种情况下得到的种子分别接入发酵罐内，它们的发酵单位可相差分别接入发酵罐内，它们的发酵单位可相差1 1倍。但也有例外，例如土霉素生产菌，一级倍。但也有例外，例如土霉素生产菌，一级种子罐的通气量小对发酵有利。种子罐的通气量小对发酵有利。313 3，种龄，种龄n n种龄：是指种子罐中培养的
23、菌丝种龄：是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。酵罐时的培养时间。n n通常种龄是以处于生命力极旺盛通常种龄是以处于生命力极旺盛的对数生长期，菌体量还未达的对数生长期，菌体量还未达到最大值时的培养时间较为合到最大值时的培养时间较为合适。时间太长，菌种趋于老化，适。时间太长，菌种趋于老化，生产能力下降，菌体自溶；种生产能力下降，菌体自溶；种龄太短，造成发酵前期生长缓龄太短，造成发酵前期生长缓慢。慢。n n不同菌种或同一菌种工艺条件不不同菌种或同一菌种工艺条件不同，种龄是不一样的，一般需同，种龄是不一样的，一般需经过多种实验来确定。嗜碱性经过多
24、种实验来确定。嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶，芽孢杆菌生产碱性蛋白酶，1212小时最好。小时最好。324，接种量33三、种子质量的控制措施n n种子质量的最终指标是考察其在发酵罐中所表现出来的生产能力。因此首先必须保证生产菌种的稳定性，其次是提供种子培养的适宜环境保证无杂菌侵入，以获得优良种子。n n菌种稳定性的检查菌种稳定性的检查n n无（杂菌）检查无（杂菌）检查34四、种子质量标准1，细胞或菌体n n菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观（色素、颗粒等）n n单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列或形态；的还要求有一定的排列或形态；n n
25、霉菌、放线菌：菌丝粗壮、对某些染料着色力霉菌、放线菌：菌丝粗壮、对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况好。强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况好。352，生化指标n n种子液的糖、氮、磷的含量和pH变化。363，产物生成量n n在抗生素发酵中，产物生成量是考察种子质量的重要指标，因为种子液中产物生成量的多少间接反映种子的生产能力和成熟程度。374，酶活力n n种子液中某种酶的活力，与目的产物的产量有一定的关联。38五、种子异常分析 n n菌种生长速度，过快或过慢 n n菌丝结团n n菌丝粘壁 39第三节 实例一、谷氨酸发酵的菌种扩大培养斜面菌种斜面菌种一级种子培养一级种子培养
26、二级种子培养二级种子培养发酵罐发酵罐1 1，斜面菌种的培养，斜面菌种的培养n n菌种的斜面培养必须有利于菌种生长而不产酸，并菌种的斜面培养必须有利于菌种生长而不产酸，并要求斜面菌种绝对纯，不得混有任何杂菌和噬菌体，要求斜面菌种绝对纯，不得混有任何杂菌和噬菌体，培养条件应有利于菌种繁殖，培养基以多含有机氮培养条件应有利于菌种繁殖，培养基以多含有机氮而不含或少含糖为原则。而不含或少含糖为原则。(1)(1)斜面培养基组成斜面培养基组成 葡萄糖葡萄糖 0.10.1 蛋白陈蛋白陈 1.01.0 牛肉膏牛肉膏 1.01.0 氯化钠氯化钠 0.50.5 琼脂琼脂 2.02.52.02.5 PH 7.07.2
27、PH 7.07.2 （传代和保藏斜面不加葡萄糖）（传代和保藏斜面不加葡萄糖）(2)(2)培养条件：培养条件：33343334，培养，培养1824h1824h402 2，一级种子培养一级种子培养n n一级种子培养的目的在于大量繁殖活力强的菌一级种子培养的目的在于大量繁殖活力强的菌体，培养基组成应以少含糖分，多含有机氮为体，培养基组成应以少含糖分，多含有机氮为主，培养条件从有利于长菌考虑。主，培养条件从有利于长菌考虑。(1)(1)培养基组成培养基组成葡萄糖葡萄糖 2.52.5 尿素尿素 0.50.5硫酸镁硫酸镁 0.040.04 磷酸氢二钾磷酸氢二钾 0.10.1玉米浆玉米浆 2.53.52.53
28、.5(按质增减按质增减)硫酸亚铁、硫酸锰硫酸亚铁、硫酸锰 各各2ppm2ppmPH 7PH 70 041(2)(2)培养条件培养条件 用用1000mL1000mL三角瓶装入培养基三角瓶装入培养基200mI200mI，灭菌后置于冲程，灭菌后置于冲程7 76cm6cm、频率、频率9696次次minmin的往的往复式摇床上振荡培养复式摇床上振荡培养12h12h，培养温度，培养温度33343334(3)(3)一级种子质量要求一级种子质量要求种龄：种龄：12h pH12h pH值：值：6.4 0.16.4 0.1光密度：净增光密度：净增ODOD值值0.50.5以上以上残糖：残糖：0.50.5以下以下 无
29、菌检查：无菌检查：(-)(-)噬菌体检查：噬菌体检查：(-)(-)镜检：菌体生长均匀、粗壮，排列整齐镜检：菌体生长均匀、粗壮，排列整齐革兰氏阳性反应。革兰氏阳性反应。423 3，二级种子培养二级种子培养n n为了获得发酵所需要的足够数量的菌体，在一级种子培养为了获得发酵所需要的足够数量的菌体，在一级种子培养的基础上进而扩大到种子罐的二级种子培养。种子罐容积的基础上进而扩大到种子罐的二级种子培养。种子罐容积大小取决于发酵罐大小和种量比例。大小取决于发酵罐大小和种量比例。(1)(1)培养基组成培养基组成43(2)(2)培养条件培养条件 接种量：接种量：0.81.00.81.0 培养温度：培养温度：
30、32343234 培养时间：培养时间：78h78h 通风量通风量n n50L50L种子罐种子罐1:0.51:0.5n n搅拌转速搅拌转速340r340rminmin；n n250L250L种子罐种子罐1:0.31:0.3n n搅拌转速搅拌转速300r300r minminn n500L500L种子罐种子罐1:0.251:0.25n n搅拌转速搅拌转速230r230r minmin44(3)二级种子的质量要求种龄 78h pH 7.2左右OD值 净增0.5左右无菌检查 (-)噬菌体检查(-)45二、啤酒酵母的扩大培养n n一般可采用三级扩大培养，扩大倍数：第1级到第2级为8-10倍，第2级到第3
31、级为4-6倍。1，实验室扩大培养462，车间扩大培养47第三节 生产发酵罐的无菌接种n n生产规模发酵罐的接种，包括两个方面：n n从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器中移种入一个种子从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器中移种入一个种子罐，罐，n n从一个种子罐移入另一个生产发酵罐中。从一个种子罐移入另一个生产发酵罐中。48从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器接种49从种子罐接种50第四节 菌种的保藏与复壮一、菌种保藏的意义一、菌种保藏的意义 菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料，菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料，特别是利用微生物进行有关生产如抗生素、氨基酸、特别是利用微生物进行有关生产如抗生素、
32、氨基酸、酿造等工业，更离不开菌种。所以菌种保藏是进行酿造等工业，更离不开菌种。所以菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。其其任务任务任务任务首先是使菌种不致死亡，同时还要尽可能设首先是使菌种不致死亡，同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转化。化。51二、菌种保藏的原理二、菌种保藏的原理 菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点人工创菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点人工创造条件使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以造条件使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异
33、。一般可通过保持培养基营养成分在最减少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低水平缺氧状态，干燥和低温，使菌种处于低水平缺氧状态，干燥和低温，使菌种处于“体眠体眠”状态，抑制其繁殖能力。状态，抑制其繁殖能力。一种好的保藏方法首先应能长期保持菌种原有的一种好的保藏方法首先应能长期保持菌种原有的优良性状不变，同时还需考虑到方法本身的简便和优良性状不变，同时还需考虑到方法本身的简便和经济，以便生产上能推广使用。经济，以便生产上能推广使用。52三、菌种保藏的方法n n斜面低温保藏法：酵母菌 n n石蜡油封保藏法：酵母菌 n n砂土管保藏法：细菌，霉菌，放线菌 n n硅胶保藏法：细菌 n n冷冻干燥法
34、：细菌，放线菌 n n液氮超低温冻结法：细菌，真菌 53四、菌种的衰退与复壮 1，菌种衰退：菌种经过长期人工培养或保藏，由于自发突变的作用而引起某些优良特性变弱或消失的现象。542 2，菌种退化的原因：，菌种退化的原因：n n基因突变；基因突变；n n变异菌株性状分离；变异菌株性状分离；n n诱变的单菌落是由诱变的单菌落是由个以上孢子或细胞形成个以上孢子或细胞形成n n菌落由菌落由个孢子或单个细胞形成，但它是多核细胞个孢子或单个细胞形成，但它是多核细胞n n单核孢子发生突变时，双链单核孢子发生突变时，双链DNADNA上仅上仅条链上某个位点条链上某个位点发生变化发生变化55n n连续传代n n其
35、它因素n n菌种保藏不当菌种保藏不当 n n生长条件不满足（培养基组成、培养条件）生长条件不满足（培养基组成、培养条件）56n n防止菌种退化的措施n n控制传代次数控制传代次数n n选择合适的培养条件选择合适的培养条件n n选择合适的保藏方法选择合适的保藏方法n n菌种稳定性检查菌种稳定性检查 n n分离复壮分离复壮57n n菌种复壮：使衰退的菌种重新恢复原来的优良特性。n n复壮措施：n n对已衰退菌种配合一定培养条件进行单细胞分对已衰退菌种配合一定培养条件进行单细胞分离纯化离纯化n n淘汰衰退的个体淘汰衰退的个体n n选择合适的培养基选择合适的培养基58n n2种龄（接种龄）：即培养时间
36、要多久的问题，如时间太短，则菌嫩，发酵速度慢，代谢活力低n n如时间太长，则菌老，发酵时间短，代谢活力低，微生物发酵都采用对数生长期的菌。59第二节种子质量标准和影响一、种子质量标准一、种子质量标准n n不同菌，有规定一套严格的检验标准。不同菌，有规定一套严格的检验标准。1 1菌的情况菌的情况n n（1 1）菌形态：要正常，包括有一定排列，菌形整齐，所以从此）菌形态：要正常，包括有一定排列，菌形整齐，所以从此反映菌的生理状态。反映菌的生理状态。n n(2)(2)n n（3 3）菌液或培养斜面的外观）菌液或培养斜面的外观正常孢子层厚薄，颜色正常孢子层厚薄，颜色n n（4 4）无杂菌：）无杂菌：镜
37、检染菌严重时方可看出；镜检染菌严重时方可看出；60 肉汤酚红；肉汤酚红；斜面：生产菌与杂菌菌落不同斜面：生产菌与杂菌菌落不同 发酵工业上尤其需快速检测有无杂菌。发酵工业上尤其需快速检测有无杂菌。n n2 2生化指标生化指标C C、N N、P P的利用，部分品种的利用，部分品种PHPH情况，培养液酶活性。情况，培养液酶活性。n n3 3种子液中产物量种子液中产物量 二、影响种子质量的因素二、影响种子质量的因素n n1 1原材料质量原材料质量 起主要作用的是其无机离子含量的变化起主要作用的是其无机离子含量的变化n n2 2培养条件培养条件n n（1 1）温度：过高则菌丝自溶早）温度：过高则菌丝自溶早n n（2 2）湿度：湿度太低不利于一些丝状菌生长）湿度：湿度太低不利于一些丝状菌生长n n（3 3）通气量：适宜）通气量：适宜n n（4 4）斜面冷藏时间：培养时间及冷藏保存时间）斜面冷藏时间：培养时间及冷藏保存时间n n三、注意种子质量的保护三、注意种子质量的保护n n1 1定期检查种子生产特性，纯化复壮定期检查种子生产特性，纯化复壮n n2 2无菌检查无菌检查