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1、第七章第七章 种子扩大培养种子扩大培养 7.1 种子制备工艺种子制备工艺 7.2 种子质量的控制措施种子质量的控制措施 种子扩大培养种子扩大培养是指将保存的处于休眠是指将保存的处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一经过摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为物称为种子种子。 目的目的：使发酵周期缩短，设备利用率提高：使发酵周期缩短，设备利用率提高 作为种子的准则是作为种子的准则是: :1)菌种细胞的生长活力强，移种至发菌种细胞的生长活力强，移种至发
2、酵罐后能迅速生长，延滞期短酵罐后能迅速生长，延滞期短2)生理性状稳定生理性状稳定3)菌体总量及浓度能满足大容量发酵菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求罐的要求4)无杂菌污染无杂菌污染5)保持稳定的生产能力。保持稳定的生产能力。 7.1 种子制备工艺种子制备工艺 种子制备的工艺流程如图所示，其过程大致种子制备的工艺流程如图所示，其过程大致可分为：可分为： 7.1.1 实验室种子制备实验室种子制备 对于不产孢子的细菌，生产上一般采用斜面对于不产孢子的细菌，生产上一般采用斜面营养细胞保藏法。然后再用茄子瓶固体斜面或营养细胞保藏法。然后再用茄子瓶固体斜面或摇瓶液体扩大培养。摇瓶液体扩大培养。对于产孢
3、子能力不强或孢子发芽慢的菌种，对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用摇瓶液体培养法。可以用摇瓶液体培养法。对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢快的菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子。子可直接作为种子罐的种子。（一）孢子的制备1，细菌的制备细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。培养温度一般为37C。细菌菌体培养时间一般为12天，产芽孢的细菌培养则需要510天。2，霉菌孢子的制备霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。培养的温度一般为2528C。培养时
4、间一般为414天。3，放线菌孢子的制备放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。培养温度一般为28C。培养时间为514天。（二）液体种子制备1，好氧培养： 对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产链霉素的灰色链霉菌（S. griseus）、产卡那霉素的卡那链霉菌（S. Kanamuceticus）可以用摇瓶液体培养法。将孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇瓶机上恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子。 试管三角瓶摇床种子罐 2，厌氧培养：对于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等） 试管三角瓶卡式罐种子罐 7.1.2 7.1.2 生
5、产车间种子制备生产车间种子制备实验室制备的孢子或液体种子移种至种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽因不同菌种而异，但其原则为采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等，如果是需氧菌，同时还需供给足够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝）体在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。 （1）种子罐级数的确定）种子罐级数的确定 种子罐的种子罐的作用作用在于使孢子瓶中有限数量的孢在于使孢子瓶中有限数量的孢子发芽、生长并繁殖成大量菌丝体，接入发酵罐子发芽、生长并繁殖成大量菌丝体，接入发酵罐培养基后能迅速生长，达到一定菌体量，以利于培养基后能迅速生长，达到一定菌体量，以利于产物的合成。产物的合成。 种子罐级数种
6、子罐级数是指制备种子需逐级扩大培养的次是指制备种子需逐级扩大培养的次数，这一般根据菌种生长特性、孢子发芽及菌数，这一般根据菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度，以及所采用发酵罐的容积而定。体繁殖速度，以及所采用发酵罐的容积而定。细菌：生长快，种子用量比例少，级数细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。也较少，二级发酵。 茄子瓶茄子瓶种子罐种子罐发酵罐发酵罐 霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵 孢子悬浮液孢子悬浮液一级种子罐（一级种子罐（27C,40小小时孢子发芽，产生菌丝时孢子发芽，产生菌丝 ）二级种子罐二级种子罐（ 27C,1024小时，菌体迅速
7、繁殖，粗小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）壮菌丝体）发酵罐发酵罐 放线菌：生长更慢，采用四级发酵放线菌：生长更慢，采用四级发酵酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子通常用一级种子 确定种子罐级数需注意的问题确定种子罐级数需注意的问题l种子级数越少越好，可简化工艺和控制，种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会减少染菌机会l种子级数太少，接种量小，发酵时间延种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会会l虽然种子罐级数随产物的品种及生产规虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定。但也与所
8、选用工艺条件有关。模而定。但也与所选用工艺条件有关。如改变种子罐的培养条件，加速了孢子如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。子罐的级数。 （2）接种龄与接种量）接种龄与接种量 接种量接种量是指移入的种子液体积和接种后培养液体是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。积的比例。 接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度。生长繁殖的速度。 通常，接种龄以菌丝处于生命力极为旺盛的通常，接种龄以菌丝处于生命力极为旺盛的对数生长期对数生长期，且培养液中菌体量还未达到最高，且培养液
9、中菌体量还未达到最高峰时较为合适。峰时较为合适。接种龄接种龄是指种子罐中培养的菌丝体开始移是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。7.2 种子质量的控制一、影响孢子质量的因素及控制培养基培养条件培养时间和冷藏时间1，培养基生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材料质量波动。其主要原因是原材料质量波动。l例如在四环素、土霉素生产中，配制产孢子斜面培例如在四环素、土霉素生产中，配制产孢子斜面培养基用的麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用养基用的麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量
10、的不同对孢子质量的影响也不同。量的不同对孢子质量的影响也不同。l蛋白胨加工原料不同如鱼胨或骨胨对孢子影响也不蛋白胨加工原料不同如鱼胨或骨胨对孢子影响也不同。同。原材料质量的波动，起它要作用的是其中无机原材料质量的波动，起它要作用的是其中无机离子含量不同，如微量元素离子含量不同，如微量元素Mg2+ 、Cu2+ 、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也会影响孢子的质量。会影响孢子的质量。水质的影响：地区不同、季节变化水质的影响：地区不同、季节变化和水源污染，均可造成水质波动，和水源污染，均可造成水质波动，影响种子质量。影响种子质量。菌种在固体培养基上可呈现
11、多种不菌种在固体培养基上可呈现多种不同代谢类型的菌落，氮源品种越多，同代谢类型的菌落，氮源品种越多，出现的菌落类型也越多，不利于生出现的菌落类型也越多，不利于生产的稳定。产的稳定。措施措施l培养基所用原料要经过发酵试验合格才培养基所用原料要经过发酵试验合格才可使用可使用l严格控制灭菌后培养基的质量严格控制灭菌后培养基的质量l斜面培养基使用前，需在适当温度下放斜面培养基使用前，需在适当温度下放置一定时间置一定时间l供生产用的孢子培养基要用比较单一的供生产用的孢子培养基要用比较单一的氮源，作为选种或分离用的培养基则采氮源，作为选种或分离用的培养基则采用较复杂的有机氮源用较复杂的有机氮源2，培养条件
12、（1）温度）温度 温度对多数品种斜面孢子质量有显温度对多数品种斜面孢子质量有显著的影响。如土霉素生产菌种在高著的影响。如土霉素生产菌种在高于于37C培养时，孢子接入发酵罐后培养时，孢子接入发酵罐后出现糖代谢变慢，氨基氮回升提前，出现糖代谢变慢，氨基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。菌丝过早自溶，效价降低等现象。一般各生产单位都严格控制孢子子一般各生产单位都严格控制孢子子斜面的培养温度。斜面的培养温度。（2）湿度）湿度 制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量和质量有较大的制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量和质量有较大的影响。例如土霉素生产菌种龟裂链霉菌，孢子制备时发现：影响。例如土霉素生
13、产菌种龟裂链霉菌，孢子制备时发现：在北方气候干燥地区孢子斜面长得较快，在含有少量水分在北方气候干燥地区孢子斜面长得较快，在含有少量水分的试管斜面培养基下部孢子长得较好，而斜面上部由于水的试管斜面培养基下部孢子长得较好，而斜面上部由于水分迅速蒸发呈干疤状，孢子稀少。在气温高含湿度大的地分迅速蒸发呈干疤状，孢子稀少。在气温高含湿度大的地区，斜面孢子长得慢，主要由于试管下部冷凝水多而不利区，斜面孢子长得慢，主要由于试管下部冷凝水多而不利于孢子的形成。从表中看出相对湿度在于孢子的形成。从表中看出相对湿度在40%45%时孢子数时孢子数量最多，且孢子颜色均匀，质量较好。量最多，且孢子颜色均匀，质量较好。相
14、对湿度（%）斜面外观活孢子计数(亿/支)16.5-1925-3640-45上部稀薄,下部略黄上部薄,中部均匀发白一片白,孢子丰富1.22.35.7不同相对湿度对龟裂链霉菌斜面生长的影响3，培养时间和冷藏时间（1）培养时间）培养时间一般来说，衰老的孢子不如年轻的一般来说，衰老的孢子不如年轻的孢子，因为衰老的孢子已在逐步进孢子，因为衰老的孢子已在逐步进入发芽阶段，核物质趋于分化状态。入发芽阶段，核物质趋于分化状态。过于衰老的孢子会导致生产能力的过于衰老的孢子会导致生产能力的下降。下降。措施：孢子培养的时间应该控制在措施：孢子培养的时间应该控制在孢子量多、孢子成熟、发酵产量正孢子量多、孢子成熟、发酵
15、产量正常的阶段终止培养。常的阶段终止培养。（2）冷藏时间）冷藏时间斜面冷藏对孢子质量的影响与孢子成熟程斜面冷藏对孢子质量的影响与孢子成熟程度有关。如土霉素生产菌种孢子斜面培养度有关。如土霉素生产菌种孢子斜面培养4天左右即于天左右即于4C冰箱保存，发现冷藏冰箱保存，发现冷藏78天菌体细胞开始自溶。而培养天菌体细胞开始自溶。而培养5天以后冷天以后冷藏，藏，20天未发现自溶。天未发现自溶。冷藏时间对孢子的生产能力也有影响。例冷藏时间对孢子的生产能力也有影响。例如在链霉素生产中，斜面孢子在如在链霉素生产中，斜面孢子在6 C冷藏冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月降低两个月后的发酵单位比冷藏一个月降低18
16、%，冷藏，冷藏3个月后降低个月后降低35%。4，接种量，接种量接种量大小影响到培养基中孢子的接种量大小影响到培养基中孢子的数量，进而影响菌体的生理状况。数量，进而影响菌体的生理状况。二、影响种子质量的因素及控制孢子的质量培养基培养条件种龄接种量1，培养基，培养基营养成分适合种子培养的需要营养成分适合种子培养的需要l选择有利于孢子发芽和菌体生长的培养选择有利于孢子发芽和菌体生长的培养基；基；l营养上要易于被菌体直接吸收和利用；营养上要易于被菌体直接吸收和利用；l营养成分要适当丰富和完全，氮源和维营养成分要适当丰富和完全，氮源和维生素含量要高生素含量要高营养成分要尽可能与发酵培养基相近。营养成分要
17、尽可能与发酵培养基相近。2，培养条件，培养条件（1）温度）温度（2）通气量）通气量 在种子罐中培养的种子除保证供给易被利在种子罐中培养的种子除保证供给易被利用的培养基外，有足够的通气量可以提高用的培养基外，有足够的通气量可以提高种子质量。例如，青霉素的生产菌种在制种子质量。例如，青霉素的生产菌种在制备过程中将通气充足和不足两种情况下得备过程中将通气充足和不足两种情况下得到的种子分别接入发酵罐内，它们的发酵到的种子分别接入发酵罐内，它们的发酵单位可相差单位可相差1倍。但也有例外，例如土霉倍。但也有例外，例如土霉素生产菌，一级种子罐的通气量小对发酵素生产菌，一级种子罐的通气量小对发酵有利。有利。3
18、，种龄，种龄种龄：是指种子罐中培养的种龄：是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。罐或发酵罐时的培养时间。通常种龄是以处于生命力极通常种龄是以处于生命力极旺盛的对数生长期，菌体量旺盛的对数生长期，菌体量还未达到最大值时的培养时还未达到最大值时的培养时间较为合适。时间太长，菌间较为合适。时间太长，菌种趋于老化，生产能力下降，种趋于老化，生产能力下降，菌体自溶；种龄太短，造成菌体自溶；种龄太短，造成发酵前期生长缓慢。发酵前期生长缓慢。不同菌种或同一菌种工艺条不同菌种或同一菌种工艺条件不同，种龄是不一样的，件不同，种龄是不一样的，一般需经过多种实验来
19、确定。一般需经过多种实验来确定。嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶，白酶，12小时最好。小时最好。4，接种量，接种量接种量：是指移入的种子液接种量：是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的体积和接种后培养液体积的比例。比例。接种量的大小决定于生产菌接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速种在发酵罐中生长繁殖的速度，采用较大的接种量可以度，采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可减少杂菌的提前到来，并可减少杂菌的生长机会。但接种量过大或生长机会。但接种量过大或者过小，均会影响发酵。
20、过者过小，均会影响发酵。过大会引起溶氧不足，影响产大会引起溶氧不足，影响产物合成；而且会过多移入代物合成；而且会过多移入代谢废物，也不经济；过小会谢废物，也不经济；过小会延长培养时间，降低发酵罐延长培养时间，降低发酵罐的生产率。的生产率。通常接种量，细菌通常接种量，细菌15%，酵，酵母菌母菌510%，霉菌，霉菌715%，有时有时2025%三、种子质量的控制措施种子质量的最终指标是考察其在发酵种子质量的最终指标是考察其在发酵罐中所表现出来的生产能力。因此首罐中所表现出来的生产能力。因此首先必须保证生产菌种的稳定性，其次先必须保证生产菌种的稳定性，其次是提供种子培养的适宜环境保证无杂是提供种子培养
21、的适宜环境保证无杂菌侵入，以获得优良种子。菌侵入，以获得优良种子。 l菌种稳定性的检查菌种稳定性的检查l无（杂菌）检查无（杂菌）检查四、种子质量标准1，细胞或菌体，细胞或菌体菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观（色素、颗粒等）（色素、颗粒等）l单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀整单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列或形态；齐，有的还要求有一定的排列或形态；l霉菌、放线菌：菌丝粗壮、对某些染料霉菌、放线菌：菌丝粗壮、对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况好。内含物情况好。2，生化指标种子液的糖、氮、磷
22、的含量和pH变化。3，产物生成量，产物生成量在抗生素发酵中，产物生成量是考在抗生素发酵中，产物生成量是考察种子质量的重要指标，因为种子察种子质量的重要指标，因为种子液中产物生成量的多少间接反映种液中产物生成量的多少间接反映种子的生产能力和成熟程度。子的生产能力和成熟程度。4，酶活力种子液中某种酶的活力，与目的产物的产量有一定的关联。五、种子异常分析 菌种生长速度，过快或过慢(培养基) 菌丝结团(溶氧)菌丝粘壁(搅拌) 第三节 实例一、谷氨酸发酵的菌种扩大培养一、谷氨酸发酵的菌种扩大培养斜面菌种斜面菌种一级种子培养一级种子培养二级种子培养二级种子培养发酵罐发酵罐1，斜面菌种的培养，斜面菌种的培养
23、菌种的斜面培养必须有利于菌种生长而不产酸，菌种的斜面培养必须有利于菌种生长而不产酸，并要求斜面菌种绝对纯，不得混有任何杂菌和并要求斜面菌种绝对纯，不得混有任何杂菌和噬菌体，培养条件应有利于菌种繁殖，培养基噬菌体，培养条件应有利于菌种繁殖，培养基以多含有机氮而不含或少含糖为原则。以多含有机氮而不含或少含糖为原则。(1) 斜面培养基组成斜面培养基组成 葡萄糖葡萄糖 0.1 蛋白陈蛋白陈 1.0 牛肉膏牛肉膏 1.0 氯化钠氯化钠 0.5 琼脂琼脂 2.02.5 PH 7.07.2 （传代和保藏斜面不加葡萄糖）（传代和保藏斜面不加葡萄糖）(2) 培养条件：培养条件：3334，培养，培养1824h2，
24、 一级种子培养一级种子培养一级种子培养的目的在于大量繁殖活力强一级种子培养的目的在于大量繁殖活力强的菌体，培养基组成应以少含糖分，多含的菌体，培养基组成应以少含糖分，多含有机氮为主，培养条件从有利于长菌考虑。有机氮为主，培养条件从有利于长菌考虑。(1) 培养基组成培养基组成葡萄糖葡萄糖 2.5 尿素尿素 0.5硫酸镁硫酸镁 0.04 磷酸氢二钾磷酸氢二钾 0.1玉米浆玉米浆 2.53.5(按质增减按质增减)硫酸亚铁、硫酸锰硫酸亚铁、硫酸锰 各各2ppmpH 7.0(2) 培养条件培养条件 用用1000mL三角瓶装入培养基三角瓶装入培养基200mI，灭菌后置于冲程，灭菌后置于冲程76cm、频率、
25、频率96次次min的往复式摇床上振荡培养的往复式摇床上振荡培养12h，培养温，培养温度度3334(3) 一级种子质量要求一级种子质量要求种龄：种龄：12h pH值：值：6.4 0.1光密度：净增光密度：净增OD值值0.5以上以上残糖：残糖：0.5以下以下 无菌检查：无菌检查：(-)噬菌体检查：噬菌体检查： (-)镜检：菌体生长均匀、粗壮，排列整齐镜检：菌体生长均匀、粗壮，排列整齐革兰氏阳性反应。革兰氏阳性反应。3， 二级种子培养二级种子培养为了获得发酵所需要的足够数量的菌体，在一级种子为了获得发酵所需要的足够数量的菌体，在一级种子培养的基础上进而扩大到种子罐的二级种子培养。种培养的基础上进而扩
26、大到种子罐的二级种子培养。种子罐容积大小取决于发酵罐大小和种量比例。子罐容积大小取决于发酵罐大小和种量比例。(1) 培养基组成培养基组成(2)培养条件培养条件 接种量：接种量：0.81.0 培养温度：培养温度：3234 培养时间：培养时间：78h 通风量通风量l50L种子罐种子罐1:0.5l搅拌转速搅拌转速340rmin；l250L种子罐种子罐1:0.3l搅拌转速搅拌转速300r minl500L种子罐种子罐1:0.25l搅拌转速搅拌转速230r min(3)二级种子的质量要求二级种子的质量要求种龄种龄 78h pH 7.2左右左右OD值值 净增净增0.5左右左右无菌检查无菌检查 (-)噬菌体
27、检查噬菌体检查(-)二、啤酒酵母的扩大培养二、啤酒酵母的扩大培养一般可采用三级扩大培养，扩大倍数：第1级到第2级为8-10倍，第2级到第3级为4-6倍。 1，实验室扩大培养2，车间扩大培养第三节 生产发酵罐的无菌接种生产规模发酵罐的接种，包括两个方面：生产规模发酵罐的接种，包括两个方面：l从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器中移种入一从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器中移种入一个种子罐，个种子罐，l从一个种子罐移入另一个生产发酵罐中。从一个种子罐移入另一个生产发酵罐中。从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器接种从种子罐接种（2）无）无(杂杂)菌检查菌检查 在种子制备过程中每移种一步均需进在种子制备过程中每移种一步均需
28、进行杂菌检查。行杂菌检查。 通常采用的方法是种子液显微镜观察、通常采用的方法是种子液显微镜观察、肉汤或琼脂斜面接入种子液培养进行无肉汤或琼脂斜面接入种子液培养进行无菌试验和对种子液进行生化分析。其中菌试验和对种子液进行生化分析。其中无菌试验是判断杂菌的主要依据。无菌试验是判断杂菌的主要依据。 小 结种子扩大培养的目的是什么？何谓种子接种龄、接种量？为什么种子要逐级扩大培养？影响种子质量的因素有哪些？保证种子质量有哪些措施？作作 业业设计一试验方案，从土壤中分离一株能分解几设计一试验方案，从土壤中分离一株能分解几丁质的真菌；（学号尾数为丁质的真菌；（学号尾数为0、5）设计一方案，从土壤中分离一株
29、能分泌胞外蛋设计一方案，从土壤中分离一株能分泌胞外蛋白酶的细菌；（白酶的细菌；（1、6）设计一方案，诱变筛选一营养缺陷型的枯草杆设计一方案，诱变筛选一营养缺陷型的枯草杆菌菌株；（菌菌株；（2、7）设计一方案，通过原生质体融合育种手段，获设计一方案，通过原生质体融合育种手段，获得枯草杆菌菌株得枯草杆菌菌株1和枯草杆菌菌株和枯草杆菌菌株2的融合子。的融合子。（3、8）设计一方案，分离一株能产脂肪酶的菌株；设计一方案，分离一株能产脂肪酶的菌株；（4、9）作业作业要求：实验方案切实可行；细化方案实验方案切实可行；细化方案参考文献（作者，题目，刊物，年份，参考文献（作者，题目，刊物，年份，卷期，页码）及引用位置卷期，页码）及引用位置2，用角码表，用角码表示示;