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1、第六章第六章 植物基因工程植物基因工程n转基因植物转基因植物 将将外源基因外源基因导入导入植物细胞植物细胞，经，经组织培养组织培养，获得能够获得能够表达外源基因表达外源基因的植物称为转基因的植物称为转基因植物。植物。抗虫抗虫 抗病抗病 抗逆抗逆 生产药物生产药物n外源基因外源基因：选择？克隆？：选择？克隆？n植物细胞植物细胞：受体细胞的种类？：受体细胞的种类？n导入导入：方法？：方法？n组织培养组织培养：（略）：（略）n表达外源基因表达外源基因：如何检测、筛选？：如何检测、筛选？植物遗传转化的植物遗传转化的受体系统受体系统、载体系统载体系统和和遗传转遗传转化方法化方法是转基因植物生产的关键是转
2、基因植物生产的关键 一、高等植物的遗传特性一、高等植物的遗传特性 植物的基本特征植物的基本特征:n遗传操作的简易性遗传操作的简易性 能产生大量的后代能产生大量的后代n整株植物的再生性整株植物的再生性 不能有效地吸收外源不能有效地吸收外源DNA；细胞全能性细胞全能性n染色体的多倍体性染色体的多倍体性 多倍体植物的遗传不稳定性，导致体细胞变异多倍体植物的遗传不稳定性，导致体细胞变异二、高等植物的基因转移系统nTi 质粒介导的整合转化程序n植物病毒介导的转染程序(略)n植物细胞的直接转化程序n植物原生质体的再生程序（一）Ti 质粒介导的整合转化程序nTi 质粒的结构与功能 双子叶植物尤其豆科植物的根
3、部常常会由于植物根部双子叶植物尤其豆科植物的根部常常会由于植物根部被土壤杆菌农杆根瘤菌（被土壤杆菌农杆根瘤菌（A.tumefaciens）形成根瘤，）形成根瘤，其致瘤特性是由该菌细胞内的野生型质粒其致瘤特性是由该菌细胞内的野生型质粒 Ti质粒质粒（Tumor-inducing plasmid）介导的，）介导的，又称肿瘤诱又称肿瘤诱导质粒。导质粒。（1 1）Ti Ti 质粒的图谱区质粒的图谱区整个质粒整个质粒160-240 kb160-240 kb nT-DNAT-DNA区、区、nVirVir区、区、nConCon区、区、nOriOri区区转移DNA T-DNA（transfer-DNA）左边界
4、左边界右边界右边界生长素生长素 基因基因细胞分裂细胞分裂 素基因素基因冠瘿碱冠瘿碱 合成合成tmstmstmttmttmrtmrnT-DNA 12-24 kbT-DNA 12-24 kbntmstms的编码：合成吲哚乙酸的编码：合成吲哚乙酸ntmrtmr的编码：合成植物分裂素的编码：合成植物分裂素ntmttmt的编码：合成氨基酸衍生物冠瘿碱的编码：合成氨基酸衍生物冠瘿碱n在在T-DNA 的两端还含有左右的两端还含有左右2 个边界，长为个边界，长为25bp的末端重复顺序，在切除及整合过程具的末端重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。有重要意义。毒性基因（vir）决定土壤农杆菌对植物的感染和决定
5、土壤农杆菌对植物的感染和T-DNA的转的转移，移，进入和整合。使根癌农杆菌表现出毒性。进入和整合。使根癌农杆菌表现出毒性。Con 区区(regions encoding conjugations，接合转移编码区，接合转移编码区)：该区：该区段上存在与细菌间接合转移的有关基因，调段上存在与细菌间接合转移的有关基因，调控控Ti 质粒在农杆菌之间的转移。质粒在农杆菌之间的转移。Ori区区(origin of replication，复制起，复制起始区始区)：Ori区上的基因调控区上的基因调控Ti 质粒的自我质粒的自我复制。复制。第一步第一步:植物受伤植物受伤 乙酰丁香酮、乙酰丁香酮、羟基乙酰丁香酮诱
6、导羟基乙酰丁香酮诱导TiTi质粒的毒性基因表达。质粒的毒性基因表达。第二步第二步 感染植物感染植物 脓杆菌吸附于植物的表面伤口部位脓杆菌吸附于植物的表面伤口部位第三步第三步 毒性基因（毒性基因（virvir）表达）表达第四步第四步 T-DNA T-DNA转移转移 单链单链T-DNAT-DNA被切下来，整合到植物基因组被切下来，整合到植物基因组中。中。第五步第五步 诱导冠瘿瘤诱导冠瘿瘤(2).农杆菌的感染和生存T-DNA上的产物催化产生过量的生长上的产物催化产生过量的生长素和细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。素和细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。裸子植物、双子叶被子植物、禾谷类单子叶裸子植物、双子叶被子植物
7、、禾谷类单子叶植物（玉米）植物（玉米）能够自发地整合到植物的染色体上。能够自发地整合到植物的染色体上。能转化多种植物。能转化多种植物。强强启动子启动子(3).Ti质粒转化的对象(4).Ti质粒作为载体的可能性质粒作为载体的可能性T-DNA的的opine合成酶基因上有一个强合成酶基因上有一个强启动子，能启动外源基因的表达。启动子，能启动外源基因的表达。野生型野生型Ti 分子大分子大（200kb）操作起来十分麻烦；操作起来十分麻烦；各种限制型酶切位点多，切割产生很大片段。且单一的酶各种限制型酶切位点多，切割产生很大片段。且单一的酶切位点很少；切位点很少；tms和和tmr 基因产物干扰植物内源激素的
8、平衡，产生冠瘿瘤，基因产物干扰植物内源激素的平衡，产生冠瘿瘤，阻碍转基因植物细胞的分化和再生；阻碍转基因植物细胞的分化和再生；冠瘿碱的合成过程消耗大量的精氨酸和谷氨冠瘿碱的合成过程消耗大量的精氨酸和谷氨 酸，直接影响酸，直接影响转基因植物细胞的生长代谢；转基因植物细胞的生长代谢；无大肠杆菌的复制起点和作为转化载体的选择标记基因。无大肠杆菌的复制起点和作为转化载体的选择标记基因。(5)天然天然Ti质粒作载体的缺点质粒作载体的缺点（6）、Ti 质粒的改造n除除去去T-DNA上上的的tmt，tms和和tmr生生物物合合成成基因；基因；n除去除去 Ti 质粒的其它非必需序列，质粒的其它非必需序列，n安
9、装大肠杆菌复制子，安装大肠杆菌复制子，n安装植物细胞的筛选标记，如安装植物细胞的筛选标记，如 neor 基因，基因，使用植物基因的启动子和使用植物基因的启动子和polyA化信号序列；化信号序列；n插插入入人人工工多多克克隆隆位位点点，以以利利于于外外源源基基因因的的克隆。克隆。改造后的Ti质粒载体模式leftrightM C SAMProriVirselect(7)(7)Ti Ti载体的类型载体的类型n共整合载体（cointegrate vectors）由比利时科学家由比利时科学家P.Zambrisky等等1983年改造年改造的的pGV3850 受体载体，需要同源重组才能插入外源基因。受体载体
10、，需要同源重组才能插入外源基因。n双元载体（binary vectors）既有大肠杆菌复制起点也有农杆菌复制起点，既有大肠杆菌复制起点也有农杆菌复制起点，是个穿梭载体。是个穿梭载体。pGV3850n特点：外源基因不能直接插入，需要借助特点：外源基因不能直接插入，需要借助于于pBR322质粒作为中间载体质粒作为中间载体n选择标记选择标记脓杆菌选择标记脓杆菌选择标记 宿主土壤农杆菌的选择标记是位于中间载宿主土壤农杆菌的选择标记是位于中间载体体pBR322上的卡那霉素抗性（上的卡那霉素抗性（Kanr）基）基因。卡那霉素抗性（因。卡那霉素抗性（Kanr）基因（卡那）基因（卡那霉素对植物有剧毒！）霉素对
11、植物有剧毒！）最终受体植物的选择标记最终受体植物的选择标记 位于位于T-DNA右半部分的胭脂碱合成酶基因右半部分的胭脂碱合成酶基因（nos）。）。外源基因插入外源基因插入pGV3850的过程的过程外源基因外源基因Kanr pBR322土壤农杆菌土壤农杆菌 含含pGV3850植物组织植物组织卡那霉素筛选卡那霉素筛选胭脂碱筛选胭脂碱筛选抗卡那霉素抗卡那霉素 的土壤农杆菌的土壤农杆菌外源基因外源基因 表达鉴定表达鉴定转化转化插入插入感染感染pBR322与与pGV3850重组重组整合到整合到 染色体上染色体上pBR322不能在土壤农杆菌中复制，只能同不能在土壤农杆菌中复制，只能同pGV3850重组。只
12、有这样，土壤农杆菌才能得重组。只有这样，土壤农杆菌才能得到抗卡那霉素性状。到抗卡那霉素性状。转化后可诱导愈伤组织分化成转基因植物共共整整合合转转化化程程序序双元载体（双元载体（binary vectors）能在大肠杆菌和农杆菌中复制，是穿梭载体。能在大肠杆菌和农杆菌中复制，是穿梭载体。n双元载体的结构双元载体的结构 Ti质粒被剔除了质粒被剔除了T-DNA、冠瘿碱代谢基因、冠瘿碱代谢基因、vir基因。基因。大幅度减小质粒的体积。（大幅度减小质粒的体积。（10kb）Ti的精髓：的精髓：Vir基因（转移）和左右界（整合）基因（转移）和左右界（整合）双元载体的转化双元载体的转化n基因插入基因插入 转化
13、农杆菌之前，所有的克隆步骤都在大转化农杆菌之前，所有的克隆步骤都在大肠杆菌里操作。肠杆菌里操作。n帮助质粒（帮助质粒（helper plasmid）受体农杆菌内要求带有整套受体农杆菌内要求带有整套vir基因（但缺基因（但缺失失T-DNA及左右边界）的及左右边界）的“帮助质粒帮助质粒”提提供供vir产物。产物。左左右右外源基因外源基因双元载体双元载体Vir帮助质粒帮助质粒农杆菌农杆菌Vir农杆菌农杆菌左左右右外源基因外源基因感染植物感染植物转化转化左左右右外源基因外源基因进入植物细胞核，进入植物细胞核，整合，表达整合，表达E.colin双元系统是双元系统是穿梭质粒穿梭质粒和和TiTi质粒质粒两个
14、两个质粒质粒 ，在接合，在接合后可以自主性地共存于同一农杆菌细胞中。后可以自主性地共存于同一农杆菌细胞中。n穿梭质粒编码植物选择标记、穿梭质粒编码植物选择标记、表达信号、表达信号、多克隆多克隆位点、位点、两个两个T-DNAT-DNAn双元系统中的双元系统中的 Ti Ti 具有具有VirVir基因和农杆菌复制起始基因和农杆菌复制起始子子(OriA)(OriA)，但没有，但没有T-DNAT-DNA边界序列。边界序列。n接合后，两个质粒可以自主共存于同一农杆菌细接合后，两个质粒可以自主共存于同一农杆菌细胞中。胞中。穿梭质粒可在农杆菌内自主复制穿梭质粒可在农杆菌内自主复制n插入外源基因的重组穿梭质粒直
15、接转化含有插入外源基因的重组穿梭质粒直接转化含有TiTi质质粒的根瘤农杆菌，经筛选后直接感染植物细胞。粒的根瘤农杆菌，经筛选后直接感染植物细胞。双元系统的特点双元系统的特点三、植物细胞的直接转化程序n枪击法 将待转化的DNA沉淀在细小金属珠的表面，用特制枪将金属珠直接打入植物细胞，枪的威力为430 m/s，植物细胞通常是胚胎细胞、玉米籽、叶子等，但进去的DNA片段整合效率极低。基因枪介导的DNA转移 基因枪法最早是由美国康奈尔大学的Sanford最先提出的。它通过高速飞行的金属颗粒将包被其外的目的基因直接导入到受体细胞内，从而实现基因转化的方法。1992年，世界首例转基因小鼠就是通过该法获得的
16、。Gene GunGene guns and electric shocks transfer DNA into plant cells基因枪电击法n将高浓度的质粒DNA加入到植物细胞的原生质体悬浮液中，混合物在 200-600 V/cm 的电场中处理若干秒钟，然后将原生质体在组织培养基中生长 1-2 周，再生出整株植物。融合法n将外源DNA与特殊的疏水性高分子化合物混合，在水中这些疏水性化合物分子形成球状的脂质体，后者与植物细胞原生质体融合，筛选融合子，再生植物细胞壁。n所有涉及到植物原生质体的基因转化方法均存在一个难题，即：原生质体很难再生出整株植物。植物原生质体的再生程序植物原生质体的再
17、生程序四四.转基因植物的基因鉴定转基因植物的基因鉴定转基因植物的基因鉴定方法转基因植物的基因鉴定方法1.1.表型表型2.2.选择压力选择压力-抗性基因抗性基因3.PCR3.PCR4.southern-blotting4.southern-blotting5.northern-blotting5.northern-blotting6.western-blotting6.western-blotting7.7.后代遗传分析后代遗传分析 （一）利用转基因技术研究基因的表达与调一）利用转基因技术研究基因的表达与调控控 报告基因（报告基因（reporter gene）：是一种编）：是一种编码可被检测的蛋
18、白质或酶的基因。码可被检测的蛋白质或酶的基因。（二）利用转基因植物生产功能蛋白和工业（二）利用转基因植物生产功能蛋白和工业原料原料（三）植物转基因技术在植物品种改良中的（三）植物转基因技术在植物品种改良中的应用应用五、植物基因工程的应用五、植物基因工程的应用目前植物中常用的报告基因：目前植物中常用的报告基因：（1）大肠杆菌的）大肠杆菌的-葡萄糖苷酸酶（葡萄糖苷酸酶（GUSGUS）该酶能催化许多该酶能催化许多葡萄糖苷酯类物质的水葡萄糖苷酯类物质的水解，将其与解，将其与 X葡萄糖苷酸（葡萄糖苷酸（X-gluc）保温，产生）保温，产生蓝色反应，借此可预测报告基因的表达程度。蓝色反应，借此可预测报告基
19、因的表达程度。（2）昆虫的荧光素酶基因）昆虫的荧光素酶基因 昆虫荧光素和昆虫荧光素和ATP以及表达荧光素酶的植物细以及表达荧光素酶的植物细胞混合，该酶催化昆虫荧光素的氧化反应，并生成胞混合，该酶催化昆虫荧光素的氧化反应，并生成AMP、CO2和光，表达该酶的植物细胞或组织便和光，表达该酶的植物细胞或组织便可用感光胶片检测。可用感光胶片检测。（三）植物转基因技术在植物品种改良（三）植物转基因技术在植物品种改良中的应用中的应用n控制果实成熟的转基因植物控制果实成熟的转基因植物n抗病虫害的转基因植物抗病虫害的转基因植物n抗除草剂的转基因植物抗除草剂的转基因植物n改变花卉形状和颜色的转基因植物改变花卉形
20、状和颜色的转基因植物n抗环境压力的转基因植物抗环境压力的转基因植物n产高品质产物的转基因植物产高品质产物的转基因植物转基因育种的程序转基因育种的程序基因分离基因分离体外重组转化转化体安全性评价结合常规育种转基因品种遗传稳定性评价市场开发载体的构建农杆菌介导基因枪轰击筛选六六.转基因植物研究发展转基因植物研究发展n1983年，转基因年，转基因烟草、胡萝卜烟草、胡萝卜问世问世 n1987年，转基因年，转基因油菜、棉花油菜、棉花产生产生n1988年，转基因年，转基因水稻、玉米水稻、玉米诞生诞生n1992年，培育出转基因年，培育出转基因小麦小麦n1994年，培育出转基因年，培育出转基因大麦大麦n200
21、0年商业化种植面积比年商业化种植面积比1996年翻了几倍年翻了几倍n预测：预测：2020年世界上年世界上80 -90的农作物的农作物将是转基因植物将是转基因植物转基因植物的生产(图例)样品比较（左为普通棉花，右为兔毛转基因棉花）抗虫棉花抗虫棉花抗除草剂作物抗除草剂作物抗抗CMV病毒转基因番茄病毒转基因番茄抗抗CMV病毒转基因甜椒病毒转基因甜椒转查尔酮合酶矮牵牛花转查尔酮合酶矮牵牛花Resistant to the papaya ringspot virus 无籽茄子无籽茄子Improved nutritional content and delayed ripening are transge
22、nic traits of interest in tomatoes.Source:USDA 转基因油菜转基因油菜 Ve VeRice capable of synthesizing beta-carotene,the precursor of Vitamin A我国转基因技术的发展n正在进行中间实验的转基因作物48种，涉及作 物11种，其中水稻、小麦、玉米、西红柿、白 菜、甜瓜、花生和广藿香等为转基因 食品植物n正在进行环境释放试验的转基因作物49种，其中水稻、玉米、大豆、马铃薯、西红柿、甜椒和线辣椒为转基因食品植物 n2002年，种植面积突破210万公顷，成为继美国、加拿大、巴西、阿根廷之
23、后的转基因作物种植大国 转基因植物引发的安全事件转基因植物引发的安全事件n英国英国Pusztai事件事件n康奈尔大学斑蝶事件康奈尔大学斑蝶事件n 加拿大加拿大“超级杂草超级杂草”事件事件n 墨西哥玉米事件墨西哥玉米事件n 中国中国Bt抗虫棉事件抗虫棉事件七、转基因生物潜在危害、Pusztai事件PusztaiPusztai博士博士Killer“转雪花莲凝集素基因的马铃薯能转雪花莲凝集素基因的马铃薯能够对大鼠的免疫系统造成损害够对大鼠的免疫系统造成损害”19981998年年“导致大鼠体重及器官导致大鼠体重及器官重量严重减轻，免疫系重量严重减轻，免疫系统被损坏统被损坏”。英国皇家学会的评论英国皇家
24、学会的评论 1999.5n不能确定转基因和非转基因马铃薯的化学不能确定转基因和非转基因马铃薯的化学成份有差异成份有差异n饲喂转基因土豆的大鼠未补充蛋白质以防饲喂转基因土豆的大鼠未补充蛋白质以防止饥饿止饥饿n动物数量少，喂几种不同的食物，且都不动物数量少，喂几种不同的食物，且都不是大鼠的标准食物，很少统计意义是大鼠的标准食物，很少统计意义n统计方法不当统计方法不当n试验结果无一致性试验结果无一致性花花粉粉BtBt玉米玉米马利筋马利筋斑蝶幼虫死斑蝶幼虫死亡亡44%44%（室（室内）内）、斑蝶事件、斑蝶事件56 斑蝶事件n1999.5 康乃尔大学康乃尔大学研究组报道，研究组报道，撒在撒在马利筋马利筋
25、草草叶片上的叶片上的Bt玉米花粉玉米花粉，可使，可使44%的斑蝶幼虫死的斑蝶幼虫死亡亡nScience、Nature 拒拒绝发表斑蝶文章，绝发表斑蝶文章，审稿人指出这并不审稿人指出这并不代表田间的情况代表田间的情况转转Bt基因的玉米造成基因的玉米造成帝王蝶的死亡嗎帝王蝶的死亡嗎?对斑蝶的影响玉米花粉大而重，扩散不远。玉米花粉大而重，扩散不远。斑蝶通常不吃玉米花粉，在玉米散完粉斑蝶通常不吃玉米花粉，在玉米散完粉后才大量产卵后才大量产卵美国中西部美国中西部 Bt玉米占玉米占40，但斑蝶群体，但斑蝶群体数量很大数量很大斑蝶因杀虫剂而死亡的数量大大超过玉斑蝶因杀虫剂而死亡的数量大大超过玉米花粉米花粉结
26、论：转基因玉米对斑蝶不是一种威胁；结论：转基因玉米对斑蝶不是一种威胁；在过去的几年里在过去的几年里,尽尽管管Bt 玉米的种植面积玉米的种植面积增加了增加了40%,但与此同时大斑蝶的种群但与此同时大斑蝶的种群也增加了也增加了30%。、墨西哥、墨西哥玉米基因污染事件玉米基因污染事件2001 年11 月29 日,“轉基因DNA 滲入墨西哥Oaxaca 當地傳統玉米品種”一文在Nature上發表 20032003年，南京环境科学研究所年，南京环境科学研究所薛达元薛达元发表了发表了题为题为“转转BtBt基因抗虫棉环境影响研究综合报基因抗虫棉环境影响研究综合报告告”。“棉农棉农“将面对不受控制的将面对不受
27、控制的超级害虫超级害虫，转转基因抗虫棉不但没有解决问题，反而制造了基因抗虫棉不但没有解决问题，反而制造了更多的问题更多的问题”，“棉农将被迫使用棉农将被迫使用更多、更更多、更毒的化学农药毒的化学农药”。4 4、中国、中国BtBt抗虫棉事件抗虫棉事件5、加拿大、加拿大“超级杂草超级杂草”事件事件 由于基因漂流，在加拿大的油菜地里发现由于基因漂流，在加拿大的油菜地里发现了个别油菜植株可以抗了个别油菜植株可以抗1-3种除草剂，因而种除草剂，因而有人称此为有人称此为“超级杂草超级杂草”。这种油菜在喷施另一种除草剂这种油菜在喷施另一种除草剂2,4-D后即被后即被全部杀死。全部杀死。6、美国转基因长粒米污
28、染事件、美国转基因长粒米污染事件n2006年年8月，拜耳公司对外公布未经批准的月，拜耳公司对外公布未经批准的转基因水稻少量混入商品稻米转基因水稻少量混入商品稻米n日本、欧盟宣布停止进口美国长粒米。日本、欧盟宣布停止进口美国长粒米。n结果导致多国禁止美国长粒米进口，美国结果导致多国禁止美国长粒米进口，美国米可能再也无法以米可能再也无法以“非转基因稻米非转基因稻米”出售。出售。因此，因此，2006年底，美国经严格的安全评价年底，美国经严格的安全评价批准了该产品的种植。批准了该产品的种植。潜在危害潜在危害n转基因食品可能具有毒性转基因食品可能具有毒性;n转基因食品可能产生过敏反应转基因食品可能产生过敏反应;n抗生素标记基因可能使人和动物产生抗药性抗生素标记基因可能使人和动物产生抗药性;n病毒重组病毒重组,发生基因重组发生基因重组,产生新的病毒产生新的病毒,产产生变异生变异,或产生新病毒或产生新病毒n转基因作物的生态安全性问题转基因作物的生态安全性问题转转n基作物本身可能演变为农田杂草基作物本身可能演变为农田杂草n对生态环境的影响：植物的“转基因逃逸”种苗的散失/残缺组织的再生 花粉的传播 “转基因逃逸”造成的危害：诱发害虫和野草的抗性问题 诱发基因转移跨越物种屏障 诱发自然生物种群的改变 基因污染 食物链的破坏超级杂草超级杂草靶生靶生物物非靶非靶生物生物