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1、植物基因工程实验技术王欢欢二零一二.九植物基因工程概述20112011全球商业转基因作物分布图全球商业转基因作物分布图植物基因工程植物基因工程是在分子水平上定向重组遗传物质，改良植物性状、培育是在分子水平上定向重组遗传物质，改良植物性状、培育优质高产作物新品种的分子育种技术。优质高产作物新品种的分子育种技术。植物基因工程实验课程安排 植物基因表达植物基因表达载体体设计与构建与构建碱裂解法小量制碱裂解法小量制备质粒粒农杆菌感受杆菌感受态细胞制胞制备及及转化化农杆菌侵染法杆菌侵染法转化烟草及化烟草及拟南芥南芥GUSGUS染色染色检测基因瞬基因瞬时表达表达植物植物组织D DNANA的提取的提取植物植
2、物组织R RNANA的提取的提取DNADNA的的PCRPCR检测，反，反转产物物RT-PCRRT-PCR一一二二三三四四五五六六七七八八克隆载体与表达载体用于携带用于携带DNA片段进入宿主细胞进行复制或保存的载体称为片段进入宿主细胞进行复制或保存的载体称为克隆载体克隆载体。克隆克隆载体体复制复制基因基因选择性性标记多克隆多克隆位点位点 TA克隆载体克隆载体表达载体表达载体表达载体是可携带外源是可携带外源DNA片段进入宿主细胞进行复制并转录、翻片段进入宿主细胞进行复制并转录、翻译的载体。一般在克隆载体的基础上增加了基因表达的调控元件。译的载体。一般在克隆载体的基础上增加了基因表达的调控元件。原核
3、启原核启动子子终止子止子核糖体核糖体结合位点合位点RBS原核表达原核表达载体体真核启真核启动子子转录终止序列止序列不同的复制子不同的复制子真核表达真核表达载体体u很多真核基因在原核中表达时难以获得有活性的蛋白质很多真核基因在原核中表达时难以获得有活性的蛋白质-真核表真核表达载体达载体酵母表达酵母表达载体体噬菌体噬菌体载体体柯斯柯斯质粒粒载体体穿梭载体穿梭载体pET载体系列体系列实验一实验一 植物基因表达载体设计与构建植物基因表达载体设计与构建植物表达载体基础元件植物表达载体基础元件启启动子子终止止子子目的目的基因基因标记基因基因植物表达载体：植物表达载体：pGreen 系列：系列：pGreen
4、0029，pSouppCAMBIA系列：系列：1300,1301,1302,1303,1304,1305,2300,2301,pCAMBIA super1300,pCAMBIA super1300-GFP,pPZP212,pPZP2121,pPZP212-GFPpBI121，pBI121-GFP,pBI101，221pRTL2,pRTL2-GFP,pRTL2-RFP,pRTL2-YFP等等等等干扰载体：干扰载体：pART27农杆菌菌株：农杆菌菌株：LBA4404,EHA103,105,GV3101常用植物表达载体植物基因工程设计引物引物PCRPCR扩增目增目的基因的基因DNADNA测序序验证酶
5、切切连接表达接表达载体体转化植物化植物抗生素抗生素筛选转基因植物基因植物引物设计根据根据表达载体的多克隆位点来设计表达载体的多克隆位点来设计引物，酶切位点外加保护碱基引物，酶切位点外加保护碱基a)引物引物长度长度大于大于16bp,一般为一般为20-24个核苷酸个核苷酸 b)引物引物与靶序列间的与靶序列间的Tm值值不应过低不应过低 c)引物引物不应有不应有发夹结构发夹结构。即不能有。即不能有4bp以上的回文序列以上的回文序列 d)两两引物间不应有大于引物间不应有大于4pb以上的互补序列或同源序列，在以上的互补序列或同源序列，在3端不应有任端不应有任何互补碱基何互补碱基 e)引物引物中碱基的分布尽
6、可能均匀，中碱基的分布尽可能均匀，G+C含量接近含量接近50%Primer L：ACGCCATGGCGCAATCTGTTCCTTAT Nco IPrimer R:CGGTCGACTTATTGTGCAGCTGCTTG Sal I目的基因的酶切核酸内切限制酶核酸内切限制酶，能够识别双链，能够识别双链DNADNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割切割DNADNA双链结构的核酸内切酶。不同酶的识别位点不同双链结构的核酸内切酶。不同酶的识别位点不同酶酶切切位点位点：DNADNA上一段碱基的特定序列，限制性内切酶能够识别出这个序列上一段碱基的特定序列，限制性内切酶能够
7、识别出这个序列并在此将并在此将DNADNA序列切成两段序列切成两段。限制性内切限制性内切酶分子手分子手术刀刀DNADNA连接接酶分子分子缝合合针基因的基因的载体体分子运分子运输车基因工程基因工程=DNA=DNA重组重组BamHIBamHI同尾同尾酶酶:产生相同的粘性末端产生相同的粘性末端常用常用限制性内切酶：限制性内切酶：TakaraTakara，NEBNEB等等HindIIIHindIIIBglIIBglII琼脂糖凝胶电泳u琼脂糖是一种线性多糖聚合物，琼脂糖凝胶约可区分相差琼脂糖是一种线性多糖聚合物，琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的的DNA片段，片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备
8、容易，分离范围广。其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。u对于较大片段的对于较大片段的DNA，则要用低浓度的琼脂糖凝胶。，则要用低浓度的琼脂糖凝胶。uDNA分子在高于等电点的分子在高于等电点的pH溶液中带溶液中带负电荷负电荷，在电场中向正极移动。，在电场中向正极移动。u在一定的电场强度下，在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分分子本身的大小和构型。具有不同相对分子质量的子本身的大小和构型。具有不同相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样：片段泳动速度不一样：分子越小，迁移越快；分子越大，迁移越慢，分子越小，迁移越快
9、；分子越大，迁移越慢，迁移速率与相对分子质量的迁移速率与相对分子质量的对数值成反比关系对数值成反比关系。Marker 2000酶切体系Enzyme1：1 LEnzyme2：1 LBuffer：2 LTemplate：X LddH2O:补齐至补齐至20 L37水浴水浴2 h活性单位活性单位U U：在在50 l50 l反应液中，反应液中，3030温度下反应温度下反应1 1小时，将小时，将1 g1 g的的DNADNA完全分解的酶量定义为完全分解的酶量定义为1 1个活性单位个活性单位(U)(U)单酶切单酶切双双酶切酶切影响内切限制酶活性因素1.DNA的的纯度纯度，蛋白质、酚、氯仿、酒精、，蛋白质、酚、
10、氯仿、酒精、EDTA、SDS、盐离子、盐离子等都会影响活性等都会影响活性2.DNA的甲基化程度，核酸内切限制酶不能够切割甲基化的核苷酸的甲基化程度，核酸内切限制酶不能够切割甲基化的核苷酸序列序列3.酶切反应温度，不同内切酶具有不同的最适反应温度，酶切反应温度，不同内切酶具有不同的最适反应温度，4.DNA的分子结构，超螺旋和线性的分子结构，超螺旋和线性5.缓冲液缓冲液的影响，的影响，Mg2+的浓度，甘油浓度的浓度，甘油浓度注意事项：注意事项：1.尽量使用同品牌的酶尽量使用同品牌的酶2.选取合适的选取合适的Buffer和限制性内切酶和限制性内切酶3.酶酶切时间不宜过长，避免星号活性切时间不宜过长，避免星号活性4.酶并非越多越好，否则甘油浓度过高酶并非越多越好，否则甘油浓度过高K Buffer:BamH IH Buffer:Bgl II,EcoR VM Buffer:Hind III,Xba I