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1、mg118遗传疾病的诊断doc第18章遗传疾病的诊断遗传病诊断是一项复杂的工作，需要多学科的密切配合。遗传病 的诊断包含常规诊断与特殊诊断。常规诊断指与通常疾病相同的诊断 方法，特殊诊断是指使用遗传学方法，包含染色体检查，家系分析等, 是遗传病确诊的关键。目前，临床上遗传病诊断包含：临症诊断、症 状前诊断(presymptomatic diagnosis)、出生前诊断与植入前诊断。第一节临症诊断临症诊断(symptomatic diagnosis )是根据患者的各类临床表现进 行分析，确诊并推断遗传方式，是遗传病诊断的要紧内容。一、病史、症状与体征(一)病史遗传病大多有家族聚集倾向，因此病史的
2、采集非常重要。在采集 病史时要准确、详尽。另外还要收集病人的家族史、婚姻史与生育史 等有关信息。遗传病史的采集比其他疾病更重要，由于遗传病的家族 聚集性与其传递的规律性决定了病史采集可能会获得更有用的信息， 对后续的分析工作可能会有很大的帮助。病史采集的关键是材料的真 实性与完整性。病史采集，要紧是通过采集对象的描述与有关个体的 病案查询工作来完成。实践中还应注意不一致个体描述是否能够相互 印证，以确定资料的可信度。关于发病原因、过程、时间、地点、治 疗情况等也应全面记录。(二)症状与体症遗传病除了具有其他疾病相同的体征外，还有特异性征候群，这 些都为初步诊断提供线索。大多遗传病在婴儿与儿童期
3、有相应的体征 与症状，如Down综合征患儿的特殊面容与智力低下等，当然还需要 polymorphism, SSCP）,是一种检测核酸序列中点突变的技术。当双 链DNA变性为两条单链后，会在中性条件下形成各自特定的空间构 象，因而在电泳时将在不一致的位置上出现不一致的电泳条带。假如 DNA序列发生改变，甚至仅有一个碱基变化时，空间构象有可能发 生改变，电泳时表现出不一致的迁移率，被检DNA电泳条带与已知 序列的参照DNA电泳条带不一致，出现新生条带时，说明有突变存 在（图18-4）。该方法与PCR联合应用，因止匕称PCR-SSCP,要紧用 于突变分子的初步筛查。图18-4 SSCP原理示意图3.
4、 RT-PCR 逆转录PCR以mRNA为模板合成cDNA,再进行 PCR,用于基因表达水平的检测与分析。4. Western印迹技术 Western印迹技术是检测特定蛋白质的 方法，可用于某种与遗传病有关的蛋白质定性定量分析。如假肥大型 肌营养不良（DMD）患者基因缺陷使肌细胞的增强蛋白（dystrophin） 合成特殊，使用Western印迹法检测患者增强蛋白，进行诊断。二、基因诊断技术的应用（-）基因诊断在遗传病中的应用1.镰状细胞贫血的基因诊断镰状细胞贫血症的基因突变发生 在B珠蛋白基因内部，能够用限制性内切酶进行检测。基于编码 B珠蛋白链的第6位密码子由GAG变为GTG,改变了限制性内
5、切酶 MstII的酶切位点。当酶切正常人DNA与患者DNA后再用标记的p 珠蛋白基由于探针作Southern杂交时，就会出现不一致的DNA条带。 限制性内切酶MstII切割的序列是CCTNAGG （其中N是任何一种核 甘酸），切割正常DNA产生1.15kbDNA片段；若切割患者DNA时, 形成1.35kbp珠蛋白的DNA片段，杂合体则形成1.15, 1.35两个片 段（图 11-7）。2 .血友病A的基因诊断 血友病A是X连锁隐性遗传病，由于 遗传性凝血障碍所致的出血性疾病。该病是凝血因子vm （FactorVffl, F VIII）基因的缺陷，其中大范围的基因重排（如缺失、插入与重复）只 占
6、5%,要紧突变类型为碱基取代或者少数碱基的缺失与插入，这些 突变产物可能是不完整的、无活性的或者不稳固的因子VIII肽链，导致 临床症状轻重不一。使用基因诊断方法能够检出有部分基因缺失的患 者与女性携带者，可进行产前检查。对该基因的产前诊断能够通过 RFLP连锁分析进行，在基因的内侧及旁侧有多组RFLP位点可供基 因诊断。目前多使用PCR技术与RFLP相结合的方法，先用PCR技 术将包含突变DNA的片段扩增出来，然后用识别该位点的限制酶来 酶切，电泳后直接检测多态性位点的状态。3 . a地中海贫血的基因诊断a地中海贫血是由于a基因的缺失造 成的。a链是由两对基因操纵的，假如在一条16号染色体上
7、的2个a 基因都缺失，称之a地贫；假如一条16号染色体上的2个基因缺失 一个，称之a+地贫，这两种a地贫基因能够组合引起不一致的综合征。 在基因的两端设计引物，扩增后的片段电泳，能够检测缺失突变，确 定被检测者的基因型，对可疑的胎儿进行产前诊断。（二）基因诊断在肿瘤中的应用肿瘤发生与进展是一个多因素、多步骤过程，涉及多个癌基因的 结构改变与表达特殊，如抑癌基因的缺失与突变等。基因诊断除了用 于肿瘤的早期诊断外，还能够对肿瘤进行肿瘤的临床分类、预后，对 肿瘤高危人群的筛选，指导个体化治疗与预防。1 .肺癌近年来对肺癌的细胞遗传学研究说明，肺癌发生经常涉 及1, 2, 3, 5, 6, 9, 11
8、, 13, 17号染色体的缺失，易位，ras、 mycy erb与sn;癌基因的扩增、突变，与抑癌基因Rb、p53的突变 或者缺失，应用PCR-ASO, PCR-SSCP,测序，与FISH,能够检测 其基因突变或者缺失。肺癌患者常存在ras、myc. erb与sw癌基 因的过表达，因此可使用Northern印迹方法进行RNA检测与分析， 在基因水平诊断肺癌。2 .乳腺癌乳腺癌是女性最常见肿瘤之一，癌基因nue与乳腺癌 的发生与预后密切有关，表达产物为表皮生长因子(EGF)样受体， 属于受体型酪氨酸蛋白激酶(TPK)家族成员。有M/e基因扩增的患 者复发与转移率高,可作为乳腺癌预后的一项重要指标
9、。使用Southern 印迹法，能够检测Nue基因的拷贝数；Northern印迹方法检测Nue基 因表达水平，进行定量分析。3 .大肠癌 在肠癌癌变的过程中存在抑癌基因FAP (family adenomatous polyposis)OCC、p53 基因的丢失，p53 基因的突变；癌 基因K-ras的点突变、C-myc的过量表达等现象。ras基因突变的检测可使用PCR-ASO方法进行，已知ras基因突 变的热点在12、13及61密码子，可人工合成位于待测点两侧的引物, 分别扩增含12、13及61位点的基因片段，将扩增产物结合在NC膜 上分别与相应的碱基突变特异性寡核甘酸探针杂交，检测突变类型
10、。 还能够使用PCR-SSCP方法，对ms基因突变进行初筛，再通过DNA 测序检测点突变，简便、准确。p53基因的缺失、突变、失活是许多肿瘤发生的原因，这些肿瘤 包含成骨肉瘤、肺癌、结(直)肠癌、神经纤维肉瘤。脑瘤、乳腺癌 等。该基因的突变可引起蛋白质功能的突变，导致细胞转化或者癌变。 PCR法进行检测p53突变热点外显子5-8,先扩增外显子5-8,再进行 突变位点的详尽分析，甚至测序；或者使用PCR-SSCP方法，然后测 序。检测53基因的突变。(邹向阳)通过染色体检查进一步确诊。二、家系分析根据对患者及家族成员发病情况的调查结果绘制系谱，确定单基 因病或者多基因病，遗传方式等。系谱分析时应
11、注意：系谱的完整性 与准确性；单基因遗传病的分析非常有用，常染色体显性遗传病、常 染色体隐性遗传病，X连锁显性遗传病，X连锁隐性遗传病，Y连锁 遗传病。单基因遗传分析中要注意外显不全，延迟显性，显、隐性的 相对性，新的突变产生，遗传印记，动态突变，与遗传异质性等问题, 避免推断上的错误与发病风险的错误估计。线粒体遗传病通过母系遗传，要紧特点是晚发，进行性。多基因 病是一大类常见的疾病，有家族聚集倾向，但不遵循孟德尔分离规律。 以往被认为是多基因病的一些疾病，一部分被证明是遗传异质性所 致，即受单个主基因决定，如癫痫，先天性心脏病与先天性巨结肠等。三、细胞遗传学检查细胞遗传学检查染色体检查或者核
12、型分析，是辅助诊断与对染色 体病确诊的要紧方法。随着显带技术的应用，特别是高分辨染色体显 带技术的进展，能够更准确地发现与确定更多的染色体数目与结构特 殊，并发现新的微小畸变综合征。利用染色体显带技术，能够对许多 疾病在染色体水平找到原发性改变，如肿瘤，发育缺陷、心血管疾病 等，把疾病有关基因确定在一个较小的范围内。染色体原位杂交是应用标记的DNA片段(探针)与玻片标本上 的细胞、染色体，与间期的DNA或者RNA杂交，研究核酸片段的位 置、相互关系的技术。通常用生物素、地高辛等标记探针，原位杂交 后，用荧光染料标记的生物素亲与蛋白、抗亲与蛋白的抗体进行免疫 检测与杂交信号放大，使探针杂交的区域
13、发出荧光，这种原位杂交称 荧光原位杂交(FISH),灵敏度高，特异性强，能够检测染色体微小 结构特殊，也可应用在基因定位与基因制图等领域。另外还有双色 FISH、多色FISH与染色体涂染等方法，大大提高了染色体畸变的检 出率与准确性。染色体检查标本要紧有外周血，羊水中胎儿脱落细胞与胎儿的脐 带血，病人的骨髓、胸腹水、手术切除的病理组织，培养细胞等。染色体检查习惯症包含：明显智力发育不全者；生长迟缓或者伴 有其他先天畸形者；夫妻之一有染色体特殊，如平衡异位，嵌合体等; 家族中已有染色体特殊或者先天畸形的个体；多发性流产妇女及其丈 夫；原发性闭经与女性不育症；无精子症与不育的男性；两性畸形者; 疑
14、为先天愚型的患儿及其父母；原因不明的智力低下并伴有大耳、大 睾丸与多动症者；35岁以上的高龄孕妇。四、生化检查生化检查是遗传病诊断的重要辅助手段，要紧是对由于基因突变 所引起的酶与蛋白质的定量与定性分析，对单基因病与先天性代谢病 进行诊断，包含通常的临床生化检验与针对遗传病的特异检查。目前已知的多种遗传性代谢病中，大多数为酶缺陷。可由于基因 突变、基因缺失、基因表达特殊或者翻译后加工修饰缺陷所致。目前 临床要紧对酶活性与代谢产物进行检测，以血液与尿液为要紧检材， 有的能够制成滤纸片与通过显色反应进行检测，随着对遗传病发病机 理认识的深入与检测方法的改进，检测将更加简便、快捷。第二节出生前诊断出
15、生前诊断或者称产前诊断(prenatal diagnosis)是使用羊膜穿刺 术或者绒毛取样等技术，对羊水、羊水细胞与绒毛进行遗传学检验， 对胎儿的染色体、基因进行分析诊断，是预防遗传病患儿出生的有效 手段，越来越广泛的被应用。一、出生前诊断对象根据遗传病的危害程度与发病率，可将出生前诊断的对象排列如 下：夫妇之一有染色体畸变，特别是平衡易位携带者，或者者夫妇 染色体正常，但生育过染色体病患儿的孕妇；35岁以上的孕妇； 夫妇之一有开放性神经管畸形，或者生育过这种畸形患儿的孕妇； 夫妇之一有先天性代谢缺陷，或者生育过这种患儿的孕妇；X连锁 遗传病致病基因携带者孕妇；有习惯性流产史的孕妇；羊水过多
16、 的孕妇；夫妇之一有致畸因素接触史的孕妇；有遗传病家族史， 又系近亲结婚的孕妇。但应当注意，已出现先兆流产、妊娠时间过长、 有出血倾向者的孕妇不宜做产前诊断。二、出生前诊断的方法（一）B 超B超是一种安全无创的检测方法，能够全面检查胎儿的外部形态 与内部结构，使许多遗传性疾病得到早期诊断。能够诊断的疾病有， 神经管缺陷、脑积水、无脑畸形；唇裂、腭裂，颈部淋巴管肿瘤；先 天性心脏病，支气管、肺发育特殊、胸腔积液；其他的特殊，如先天 性单侧肾缺如，先天性幽门狭窄、先天性巨结肠等。（二）羊膜穿刺羊膜穿刺是在B超的监视下，用消毒的注射器抽取胎儿羊水（图 18-l）o能够对抽取的羊水及其中的胎儿脱落细胞
17、进行细胞培养，分析 染色体，与生化与基因的检测。如羊水中甲胎蛋白浓度过高时，提示 胎儿可能有无脑、开放性脊柱裂、脊髓脊膜膨出与脑积水等特殊。羊 膜穿刺通常在妊娠1620周进行，流产的风险相对较小。图18-1羊膜穿刺示意图（三）绒毛取样法绒毛取样通常在妊娠79周进行，是妊娠早期诊断方法。也是 在B超监视下，用特制的取样器，从阴道经宫颈进入子宫，沿子宫壁 到达取样部位，用内管吸取绒毛（图18-2）。绒毛取样的优点是检查 时间早，需要作出选择性流产时，给孕妇带来的损伤与痛苦较小。缺 点是经子宫颈取样标本容易被污染，胎儿与母体感染与操作不便，引 起流产的风险是羊膜穿刺的两倍。羊膜穿刺法与绒毛取样可用来
18、诊断染色体病，遗传代谢病，胎儿 性别鉴定，所有可用胚胎或者胎儿DNA检测的疾病，另外，开放性 神经管缺陷只能使用羊膜穿刺术诊断。图18-2绒毛取样法示意图（四）脐带穿刺术脐带穿刺术是在B超的监视下，用细针经腹壁、子宫进入胎儿脐 带抽取胎儿血液。本方法取样最好在妊娠18周，常用于因错过绒毛 取样或者羊膜穿刺最佳时机或者羊水检查失败的补救措施，还能够检 测胎儿的血液系统疾病，先天性免疫缺陷，某些单基因病。（五）胎儿镜检查又称羊膜腔镜或者宫腔镜检查，它可在进入羊膜腔后，直接观察 胎儿的外形、性别与发育状况，是否有畸形，还能够同时抽取羊水或 者胎血进行检查，或者进行宫内治疗。因此，理论上这是一种最理想
19、 的方法。但由于操作困难，容易引起多种并发症，目前还不能被广泛 使用。胎儿镜检查的最佳时间是妊娠1820周，能够诊断大疱性表 皮松懈症及某些皮肤病。（六）分离孕妇外周血中的胎儿细胞目前用于出生前诊断材料的获得关于胎儿与母体都是创伤性的， 存在流产与感染等风险。从20世纪90年代末，开始探索一种无创伤 性的出生前诊断方法。利用妊娠期少量胎儿细胞能够通过胎盘进入母 体血液中，使用流式细胞仪分离技术，磁激活细胞分选技术，免疫磁 珠法，显微操作分选法，分离胎儿细胞。用这些方法富集的胎儿细胞 很少，需要用高灵敏的技术方法进行下一步分析检测，目前常用的方 法是PCRo(七)植入前诊断随着人工受精，试管婴儿
20、与胚胎移植技术的开展，与单个细胞基 因诊断技术的应用，目前正探索在胚胎植入前诊断(pre-implantation diagnosis!)o在受精后6天胚胎着床前，通过显微操作技术取出一个 细胞，应用PCR, FISH等技术进行特定基因与染色体畸变的检测， 将人类的遗传缺陷掌控在最早阶段，这是遗传病产前诊断的重大突 破。Indications for Prenatal Diagnosis.Advanced maternal age (often at least 35 years at the expected date of confinement): If there is no prev
21、ious history of a chromosome abnormality, it is only in the advanced maternal age range that the risk of a chromosomally abnormal fetus exceeds the risk of miscarriage due to the procedure itself. The age cutoff used varies somewhat among different prenatal genetics centers but is usually at least 3
22、1 to 32 years of age.1 .Previous child with a de novo chromosome abnormality: If the parents of a child with a chromosome abnormality have normal chromosomes themselves, there may nevertheless be a risk of the same abnormality in a subsequent child. For example, if a woman under 30 years of age has
23、a child with Down syndrome, the recurrence risk is about 1/100, in comparison with a general population risk of about 1/800. Prenatal mosaicism is possible explanation of the increased risk.2 .Presence of structural chromosome abnormality in one of the parents: Here the risk of an abnormal child is
24、usually 20% or less, but it may be higher.3 .Family history of some genetic defect that may be diagnosed or ruled out by biochemical or DNA analysis: Most of these disorders are caused by single-gene defects and have risks of 25% or 50% in sibs of affected children. Cases in which the parents have b
25、een diagnosed as carriers after a population screening test rather than after the birth of an affected child are also in this category. Even before DNA analysis entered the picture, numerous biochemical disorders could be identified prenatally, and DNA analysis has greatly increased the number.4 .Fa
26、mily history of an X-linked disorder for which there is no specific prenatal diagnostic test: When there is no alternative method, the parents may use fetal sex determination to help them decide whether to continue or terminate the pregnancy. With the development of DNA analysis for prenatal diagnos
27、is of X-linked disorders such as Duchenne muscular dystrophy and hemophilia A and B, first the fetal sex is determined, and then DNA analysis is performed if the fetus is male.5 .Risk of a neural tube defect (NTD): Only first-and second-degree relatives of NTD patients are eligible for amniocentesis
28、 because of a significantly increased risk of having a child with an NTD, but many fetuses with open NTDs can now be detected by other tests.第三节基因诊断利用分子生物学的技术，检测体内DNA或者RNA结构或者表 达水平变化，从而对疾病做出诊断的方法，称之基因诊断(gene diagnosis) 通常又称之分子诊断(molecular diagnosis)。基因诊断始 于1978年，应用限制性酶切长度多态性(RFLP)技术检测胎儿镰状 细胞贫血症。基因诊断
29、技术已逐步从实验研究进入临床应用，不仅适用于遗传性疾 病，而且已扩展到一些感染性疾病、肿瘤的诊断。基因诊断具有如下特点：以特定基由于目标，检测基因的变化， 特异性性强；使用分子杂交技术与PCR技术具有信号放大作用，用微 量样品即可进行诊断，灵敏度高；在疾病尚无出现临床表现前，胎儿 出生前的产前诊断，与特定人群的筛查等，应用广泛；检测样品获得 便利，不受个体发育阶段性与基因表达组织特异性的限制。需要说明的是，由于基因突变的类型多种多样，除了缺失、倒位、 点突变、动态突变能够进行基因的检测外，大多数基因突变的分析复 杂而繁琐，有一定的难度。一、基因诊断的要紧技术方法基因诊断要紧使用核酸分子杂交、P
30、CR与DNA序列测定等技术。（一）核酸分子杂交核酸杂交技术是在基因诊断中，用于检测样品中是否存在相应的 基因与相应基因表达状态等等。其中Southern印迹法要紧用于基因组 DNA的分析，Northern印迹法用于检测样品中RNA的种类与含量。1 .斑点印迹杂交 把待检测的核酸样品点在NC膜上，变性后 与标记的探针进行结合反应，通过显色与显影后检测杂交信号的强 度，与参照样品比较后确定所测核酸量的高低。根据NC膜上所点核 酸样品的种类不一致，分为DNA dot blotting与RNA dot blotting。点 样方式如使用狭缝点样器点样，得到的线状杂交信号，称狭线印迹法。2 .原位杂交把
31、组织或者细胞样品通过适当处理，用探针与核 酸进行杂交。这种方法不需要提取核酸，能够确定被检核酸在组织或 者细胞，与中期染色体中的定位，具有重要的生物学与病理学意义。3 . PCR-ASO ASO为等位基因特异性寡核甘酸杂交法 （allele-specific oligonucleotide, ASO）的简称，是基于核酸杂交的一 种方法。根据已知基因突变位点的碱基序列，设计与制备与野生型或 者突变型基因序列互补的两种探针，分别与被检测者样品中的DNA 分子进行杂交，根据样品与两种探针杂交信号的强弱，确定是否存在 基因突变，推断被检者是突变基因的纯合体或者杂合体（图18-3）。图18-3 ASO探
32、针杂交原理示意图4 .基因芯片技术基因芯片技术是近年来进展十分迅速的大规 模、高通量分子检测技术。基本过程是将许多特定的寡核甘酸片段或 者基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，如玻片、硅片 或者尼龙膜等，形成矩阵点。现在的技术能够做到在lcn?上排列成 千上万个“点二样品DNA/RNA通过PCR扩增、体外转录等技术掺 入荧光标记分子，然后与待测样本进行杂交反应，再通过激光共聚焦 荧光显微镜对芯片进行扫描，获取信息，电脑系统分析处理所得资料, 对上千种甚至更多基因的表达水平、突变与多态性进行快速、准确的 检测。基因芯片能够进行微量化、大规模、并行化、高度自动化地处理 有价值的生物样品，精
33、细地研究各类状态下分子结构变异，熟悉组织 细胞基因表达情况。既可检测基因的多态性，又能检测基因突变，特 别适用于多个基因、多个位点的同时检测。这一技术目前处于进展与 优化阶段，已经有多种针对遗传性疾病、肿瘤检测的基因芯片用于临 床诊断。（二）其它常用的技术1. PCR-RFLP 将聚合酶链反应（PCR）与RFLP方法结合的一 种检测技术。由于DNA序列的差异，造成了内切酶位点的变化，或 者是新酶切位点的产生；或者是原酶切位点的消失等。通过酶切后电 泳图谱的推断，确定检测结果。该方法包含PCR：利用一对或者数 对特异性引物，将目标DNA扩增；酶切：利用某些限制性内切酶 消化PCR产物，如PCR产物中含有相应的酶切位点序列，DNA链则 被切开；利用琼脂糖凝胶或者聚丙烯酰胺凝胶分离酶切后的PCR 产物，根据电泳图谱推断结果。假如某DNA序列已经全部确定，则能够通过计算机辅助设计特 异性PCR引物；扩增DNA片段与进行酶切位点分析，该方法简便易 行，精确度也很高。但是该方法也有一定的局限性，假如多态性位点 的DNA序列没有相应的内切酶，则该方法不适用。2. PCR-SSCP 单链构象多态性（single-strand conformation