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1、编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第13页 共13页第十八章遗传病的诊断遗传病诊断是一项复杂的工作，需要多学科的密切配合。遗传病的诊断包括常规诊断和特殊诊断。常规诊断指与一般疾病相同的诊断方法，特殊诊断是指采用遗传学方法，包括染色体检查，家系分析等，是遗传病确诊的关键。目前，临床上遗传病诊断包括：临症诊断、症状前诊断（presymptomatic diagnosis）、出生前诊断和植入前诊断。第一节 临症诊断临症诊断（symptomatic diagnosis）是根据患者的各种临床表现进行分析，确诊并判断遗传方式，是遗传病诊断的主要内容。一、病史、症状和体征（一
2、）病史遗传病大多有家族聚集倾向，因此病史的采集非常重要。在采集病史时要准确、详尽。另外还要收集病人的家族史、婚姻史和生育史等相关信息。遗传病史的采集比其他疾病更重要，因为遗传病的家族聚集性和其传递的规律性决定了病史采集可能会获得更有用的信息，对后续的分析工作可能会有很大的帮助。病史采集的关键是材料的真实性和完整性。病史采集，主要是通过采集对象的描述和有关个体的病案查询工作来完成。实践中还应注意不同个体描述是否可以相互印证，以确定资料的可信度。对于发病原因、过程、时间、地点、治疗情况等也应详细记录。（二）症状与体症遗传病除了具有其他疾病相同的体征外，还有特异性征候群，这些都为初步诊断提供线索。大
3、多遗传病在婴儿和儿童期有相应的体征和症状，如Down综合征患儿的特殊面容和智力低下等，当然还需要通过染色体检查进一步确诊。二、家系分析根据对患者及家族成员发病情况的调查结果绘制系谱，确定单基因病或多基因病，遗传方式等。系谱分析时应注意：系谱的完整性和准确性；单基因遗传病的分析非常有用，常染色体显性遗传病、常染色体隐性遗传病，X连锁显性遗传病，X连锁隐性遗传病，Y连锁遗传病。单基因遗传分析中要注意外显不全，延迟显性，显、隐性的相对性，新的突变产生，遗传印记，动态突变，以及遗传异质性等问题，避免判断上的错误和发病风险的错误估计。线粒体遗传病通过母系遗传，主要特点是晚发，进行性。多基因病是一大类常见
4、的疾病，有家族聚集倾向，但不遵循孟德尔分离规律。以往被认为是多基因病的一些疾病，一部分被证明是遗传异质性所致，即受单个主基因决定，如癫痫，先天性心脏病和先天性巨结肠等。三、细胞遗传学检查细胞遗传学检查染色体检查或核型分析，是辅助诊断和对染色体病确诊的主要方法。随着显带技术的应用，特别是高分辨染色体显带技术的发展，能够更准确地发现和确定更多的染色体数目和结构异常，并发现新的微小畸变综合征。利用染色体显带技术，可以对许多疾病在染色体水平找到原发性改变，如肿瘤，发育缺陷、心血管疾病等，把疾病相关基因确定在一个较小的范围内。染色体原位杂交是应用标记的DNA片段（探针）与玻片标本上的细胞、染色体，以及间
5、期的DNA或RNA杂交，研究核酸片段的位置、相互关系的技术。一般用生物素、地高辛等标记探针，原位杂交后，用荧光染料标记的生物素亲和蛋白、抗亲和蛋白的抗体进行免疫检测和杂交信号放大，使探针杂交的区域发出荧光，这种原位杂交称荧光原位杂交（FISH），灵敏度高，特异性强，可以检测染色体微小结构异常，也可应用在基因定位和基因制图等领域。另外还有双色FISH、多色FISH和染色体涂染等方法，大大提高了染色体畸变的检出率和准确性。染色体检查标本主要有外周血，羊水中胎儿脱落细胞和胎儿的脐带血，病人的骨髓、胸腹水、手术切除的病理组织，培养细胞等。染色体检查适应症包括：明显智力发育不全者；生长迟缓或伴有其他先天
6、畸形者；夫妻之一有染色体异常，如平衡异位，嵌合体等；家族中已有染色体异常或先天畸形的个体；多发性流产妇女及其丈夫；原发性闭经和女性不育症；无精子症和不育的男性；两性畸形者；疑为先天愚型的患儿及其父母；原因不明的智力低下并伴有大耳、大睾丸和多动症者；35岁以上的高龄孕妇。四、生化检查生化检查是遗传病诊断的重要辅助手段，主要是对由于基因突变所引起的酶和蛋白质的定量和定性分析，对单基因病和先天性代谢病进行诊断，包括一般的临床生化检验和针对遗传病的特异检查。目前已知的多种遗传性代谢病中，大多数为酶缺陷。可由于基因突变、基因缺失、基因表达异常或翻译后加工修饰缺陷所致。目前临床主要对酶活性和代谢产物进行检
7、测，以血液和尿液为主要检材，有的可以制成滤纸片和通过显色反应进行检测，随着对遗传病发病机理认识的深入和检测方法的改进，检测将更加简便、快捷。第二节 出生前诊断出生前诊断或称产前诊断（prenatal diagnosis）是采用羊膜穿刺术或绒毛取样等技术，对羊水、羊水细胞和绒毛进行遗传学检验，对胎儿的染色体、基因进行分析诊断，是预防遗传病患儿出生的有效手段，越来越广泛的被应用。一、出生前诊断对象根据遗传病的危害程度和发病率，可将出生前诊断的对象排列如下：夫妇之一有染色体畸变，特别是平衡易位携带者，或者夫妇染色体正常，但生育过染色体病患儿的孕妇；35岁以上的孕妇；夫妇之一有开放性神经管畸形，或生育
8、过这种畸形患儿的孕妇；夫妇之一有先天性代谢缺陷，或生育过这种患儿的孕妇；X连锁遗传病致病基因携带者孕妇；有习惯性流产史的孕妇；羊水过多的孕妇；夫妇之一有致畸因素接触史的孕妇；有遗传病家族史，又系近亲结婚的孕妇。但应当注意，已出现先兆流产、妊娠时间过长、有出血倾向者的孕妇不宜做产前诊断。二、出生前诊断的方法（一）B超 B超是一种安全无创的检测方法，能够详细检查胎儿的外部形态和内部结构，使许多遗传性疾病得到早期诊断。可以诊断的疾病有，神经管缺陷、脑积水、无脑畸形；唇裂、腭裂，颈部淋巴管肿瘤；先天性心脏病，支气管、肺发育异常、胸腔积液；其他的异常，如先天性单侧肾缺如，先天性幽门狭窄、先天性巨结肠等。
9、（二）羊膜穿刺羊膜穿刺是在B超的监视下，用消毒的注射器抽取胎儿羊水（图18-1）。可以对抽取的羊水及其中的胎儿脱落细胞进行细胞培养，分析染色体，以及生化和基因的检测。如羊水中甲胎蛋白浓度过高时，提示胎儿可能有无脑、开放性脊柱裂、脊髓脊膜膨出和脑积水等异常。羊膜穿刺一般在妊娠1620周进行，流产的风险相对较小。图18-1 羊膜穿刺示意图（三）绒毛取样法绒毛取样一般在妊娠79周进行，是妊娠早期诊断方法。也是在B超监视下，用特制的取样器，从阴道经宫颈进入子宫，沿子宫壁到达取样部位，用内管吸取绒毛（图18-2）。绒毛取样的优点是检查时间早，需要作出选择性流产时，给孕妇带来的损伤和痛苦较小。缺点是经子宫
10、颈取样标本容易被污染，胎儿和母体感染和操作不便，引起流产的风险是羊膜穿刺的两倍。羊膜穿刺法和绒毛取样可用来诊断染色体病，遗传代谢病，胎儿性别鉴定，所有可用胚胎或胎儿DNA检测的疾病，另外，开放性神经管缺陷只能采用羊膜穿刺术诊断。图18-2 绒毛取样法示意图（四）脐带穿刺术脐带穿刺术是在B超的监视下，用细针经腹壁、子宫进入胎儿脐带抽取胎儿血液。本方法取样最好在妊娠18周，常用于因错过绒毛取样或羊膜穿刺最佳时机或羊水检查失败的补救措施，还可以检测胎儿的血液系统疾病，先天性免疫缺陷，某些单基因病。（五）胎儿镜检查又称羊膜腔镜或宫腔镜检查，它可在进入羊膜腔后，直接观察胎儿的外形、性别和发育状况，是否有
11、畸形，还可以同时抽取羊水或胎血进行检查，或进行宫内治疗。因此，理论上这是一种最理想的方法。但由于操作困难，容易引起多种并发症，目前还不能被广泛采用。胎儿镜检查的最佳时间是妊娠1820周，可以诊断大疱性表皮松懈症及某些皮肤病。（六）分离孕妇外周血中的胎儿细胞目前用于出生前诊断材料的获得对于胎儿和母体都是创伤性的，存在流产和感染等风险。从20世纪90年代末，开始探索一种无创伤性的出生前诊断方法。利用妊娠期少量胎儿细胞可以通过胎盘进入母体血液中，采用流式细胞仪分离技术，磁激活细胞分选技术，免疫磁珠法，显微操作分选法，分离胎儿细胞。用这些方法富集的胎儿细胞很少，需要用高灵敏的技术方法进行下一步分析检测
12、，目前常用的方法是PCR。（七）植入前诊断随着人工受精，试管婴儿和胚胎移植技术的开展，以及单个细胞基因诊断技术的应用，目前正探索在胚胎植入前诊断（pre-implantation diagnosisi）。在受精后6天胚胎着床前，通过显微操作技术取出一个细胞，应用PCR，FISH等技术进行特定基因和染色体畸变的检测，将人类的遗传缺陷掌控在最早阶段，这是遗传病产前诊断的重大突破。Indications for Prenatal Diagnosis1.Advanced maternal age (often at least 35 years at the expected date of conf
13、inement): If there is no previous history of a chromosome abnormality, it is only in the advanced maternal age range that the risk of a chromosomally abnormal fetus exceeds the risk of miscarriage due to the procedure itself. The age cutoff used varies somewhat among different prenatal genetics cent
14、ers but is usually at least 31 to 32 years of age.2.Previous child with a de novo chromosome abnormality: If the parents of a child with a chromosome abnormality have normal chromosomes themselves, there may nevertheless be a risk of the same abnormality in a subsequent child. For example, if a woma
15、n under 30 years of age has a child with Down syndrome, the recurrence risk is about 1/100, in comparison with a general population risk of about 1/800. Prenatal mosaicism is possible explanation of the increased risk.3.Presence of structural chromosome abnormality in one of the parents: Here the ri
16、sk of an abnormal child is usually 20% or less, but it may be higher. 4.Family history of some genetic defect that may be diagnosed or ruled out by biochemical or DNA analysis: Most of these disorders are caused by single-gene defects and have risks of 25% or 50% in sibs of affected children. Cases
17、in which the parents have been diagnosed as carriers after a population screening test rather than after the birth of an affected child are also in this category. Even before DNA analysis entered the picture, numerous biochemical disorders could be identified prenatally, and DNA analysis has greatly
18、 increased the number.5.Family history of an X-linked disorder for which there is no specific prenatal diagnostic test: When there is no alternative method, the parents may use fetal sex determination to help them decide whether to continue or terminate the pregnancy. With the development of DNA ana
19、lysis for prenatal diagnosis of X-linked disorders such as Duchenne muscular dystrophy and hemophilia A and B, first the fetal sex is determined, and then DNA analysis is performed if the fetus is male.6.Risk of a neural tube defect (NTD): Only first-and second-degree relatives of NTD patients are e
20、ligible for amniocentesis because of a significantly increased risk of having a child with an NTD, but many fetuses with open NTDs can now be detected by other tests.第三节 基因诊断利用分子生物学的技术，检测体内DNA或RNA结构或表达水平变化，从而对疾病做出诊断的方法，称为基因诊断（gene diagnosis），通常又称为分子诊断（molecular diagnosis）。基因诊断始于1978年，应用限制性酶切长度多态性（RF
21、LP）技术检测胎儿镰状细胞贫血症。 基因诊断技术已逐步从实验研究进入临床应用，不仅适用于遗传性疾病，而且已扩展到一些感染性疾病、肿瘤的诊断。基因诊断具有如下特点：以特定基因为目标，检测基因的变化，特异性性强；采用分子杂交技术和PCR技术具有信号放大作用，用微量样品即可进行诊断，灵敏度高；在疾病尚无出现临床表现前，胎儿出生前的产前诊断，以及特定人群的筛查等，应用广泛；检测样品获得便利，不受个体发育阶段性和基因表达组织特异性的限制。 需要说明的是，由于基因突变的类型多种多样，除了缺失、倒位、点突变、动态突变可以进行基因的检测外，大多数基因突变的分析复杂而繁琐，有一定的难度。一、基因诊断的主要技术方
22、法基因诊断主要采用核酸分子杂交、PCR和DNA序列测定等技术。（一）核酸分子杂交核酸杂交技术是在基因诊断中，用于检测样品中是否存在相应的基因以及相应基因表达状态等等。其中Southern印迹法主要用于基因组DNA的分析，Northern印迹法用于检测样品中RNA的种类和含量。1. 斑点印迹杂交 把待检测的核酸样品点在NC膜上，变性后与标记的探针进行结合反应，经过显色和显影后检测杂交信号的强度，与对照样品比较后确定所测核酸量的高低。根据NC膜上所点核酸样品的种类不同，分为DNA dot blotting和 RNA dot blotting。点样方式如采用狭缝点样器点样，得到的线状杂交信号，称狭线
23、印迹法。2. 原位杂交 把组织或细胞样品经过适当处理，用探针与核酸进行杂交。这种方法不需要提取核酸，可以确定被检核酸在组织或细胞，以及中期染色体中的定位，具有重要的生物学和病理学意义。3. PCR-ASO ASO为等位基因特异性寡核苷酸杂交法（allele-specific oligonucleotide，ASO）的简称，是基于核酸杂交的一种方法。根据已知基因突变位点的碱基序列，设计和制备与野生型或突变型基因序列互补的两种探针，分别与被检测者样品中的DNA分子进行杂交，根据样品与两种探针杂交信号的强弱，确定是否存在基因突变，判断被检者是突变基因的纯合体或杂合体（图18-3）。图18-3ASO探
24、针杂交原理示意图4基因芯片技术基因芯片技术是近年来发展十分迅速的大规模、高通量分子检测技术。基本过程是将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，如玻片、硅片或尼龙膜等，形成矩阵点。现在的技术可以做到在1cm2上排列成千上万个“点”。样品DNA/RNA通过PCR扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子，然后与待测样本进行杂交反应，再通过激光共聚焦荧光显微镜对芯片进行扫描，获取信息，电脑系统分析处理所得资料，对上千种甚至更多基因的表达水平、突变和多态性进行快速、准确的检测。基因芯片可以进行微量化、大规模、并行化、高度自动化地处理有价值的生物样品，精细地研究各种状态下分子结
25、构变异，了解组织细胞基因表达情况。既可检测基因的多态性，又能检测基因突变，特别适用于多个基因、多个位点的同时检测。这一技术目前处于发展和优化阶段，已经有多种针对遗传性疾病、肿瘤检测的基因芯片用于临床诊断。（二）其它常用的技术1. PCR-RFLP 将聚合酶链反应（PCR）与RFLP方法结合的一种检测技术。由于DNA序列的差异，造成了内切酶位点的变化，或是新酶切位点的产生；或是原酶切位点的消失等。通过酶切后电泳图谱的判断，确定检测结果。该方法包括PCR：利用一对或数对特异性引物，将目标DNA扩增；酶切：利用某些限制性内切酶消化PCR产物，如PCR产物中含有相应的酶切位点序列，DNA链则被切开；利
26、用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶分离酶切后的PCR产物，根据电泳图谱判断结果。如果某DNA序列已经全部确定，则可以通过计算机辅助设计特异性PCR引物；扩增DNA片段和进行酶切位点分析，该方法简便易行，精确度也很高。但是该方法也有一定的局限性，如果多态性位点的DNA序列没有相应的内切酶，则该方法不适用。2. PCR-SSCP 单链构象多态性（single-strand conformation polymorphism，SSCP），是一种检测核酸序列中点突变的技术。当双链DNA变性为两条单链后，会在中性条件下形成各自特定的空间构象，因而在电泳时将在不同的位置上出现不同的电泳条带。如果DNA序列发生改
27、变，甚至仅有一个碱基变化时，空间构象有可能发生改变，电泳时表现出不同的迁移率，被检DNA电泳条带与已知序列的对照DNA电泳条带不一致，出现新生条带时，表明有突变存在（图18-4）。该方法与PCR联合应用，因此称PCR-SSCP，主要用于突变分子的初步筛查。图18-4 SSCP原理示意图 3. RT-PCR 逆转录PCR以mRNA为模板合成cDNA，再进行PCR，用于基因表达水平的检测和分析。 4. Western 印迹技术 Western 印迹技术是检测特定蛋白质的方法，可用于某种与遗传病相关的蛋白质定性定量分析。如假肥大型肌营养不良（DMD）患者基因缺陷使肌细胞的增强蛋白（dystrophi
28、n）合成异常，采用Western 印迹法检测患者增强蛋白，进行诊断。二、基因诊断技术的应用（一）基因诊断在遗传病中的应用1镰状细胞贫血的基因诊断镰状细胞贫血症的基因突变发生在b珠蛋白基因内部，可以用限制性内切酶Mst进行检测。基于编码b珠蛋白链的第6位密码子由GAG变为GTG，改变了限制性内切酶Mst的酶切位点。当酶切正常人DNA和患者DNA后再用标记的b珠蛋白基因为探针作Southern杂交时，就会出现不同的DNA条带。限制性内切酶Mst切割的序列是CCTNAGG（其中N是任何一种核苷酸），切割正常DNA产生1.15kb DNA片段；若切割患者DNA时，形成1.35kb b珠蛋白的DNA片段
29、，杂合体则形成1.15，1.35两个片段（图11-7）。2血友病A的基因诊断血友病A是X连锁隐性遗传病，由于遗传性凝血障碍所致的出血性疾病。该病是凝血因子（Factor，F）基因的缺陷，其中大范围的基因重排（如缺失、插入和重复）只占5，主要突变类型为碱基取代或少数碱基的缺失和插入，这些突变产物可能是不完整的、无活性的或不稳定的因子肽链，导致临床症状轻重不一。采用基因诊断方法可以检出有部分基因缺失的患者和女性携带者，可进行产前检查。对该基因的产前诊断可以通过RFLP连锁分析进行，在基因的内侧及旁侧有多组RFLP位点可供基因诊断。目前多采用PCR技术与RFLP相结合的方法，先用PCR技术将包含突变
30、DNA的片段扩增出来，然后用识别该位点的限制酶来酶切，电泳后直接检测多态性位点的状态。3. a地中海贫血的基因诊断 a地中海贫血是由于a基因的缺失造成的。a链是由两对基因控制的，如果在一条16号染色体上的2个a基因都缺失，称为a0地贫；如果一条16号染色体上的2个基因缺失一个，称为a+地贫，这两种a地贫基因可以组合引起不同的综合征。在基因的两端设计引物，扩增后的片段电泳，可以检测缺失突变，确定被检测者的基因型，对可疑的胎儿进行产前诊断。（二）基因诊断在肿瘤中的应用肿瘤发生和发展是一个多因素、多步骤过程，涉及多个癌基因的结构改变和表达异常，如抑癌基因的缺失和突变等。基因诊断除了用于肿瘤的早期诊断
31、外，还可以对肿瘤进行肿瘤的临床分类、预后，对肿瘤高危人群的筛选，指导个体化治疗和预防。1. 肺癌 近年来对肺癌的细胞遗传学研究表明，肺癌发生时常涉及1，2，3，5，6，9，11，13，17号染色体的缺失，易位，ras 、myc、 erb和 src癌基因的扩增、突变，以及抑癌基因Rb 、p53的突变或缺失，应用PCR-ASO，PCR-SSCP，测序，以及FISH，可以检测其基因突变或缺失。肺癌患者常存在ras 、myc、 erb和 src癌基因的过表达，因此可采用Northern印迹方法进行RNA检测与分析，在基因水平诊断肺癌。2. 乳腺癌 乳腺癌是女性最常见肿瘤之一，癌基因nue与乳腺癌的发生
32、和预后密切相关，表达产物为表皮生长因子（EGF）样受体，属于受体型酪氨酸蛋白激酶（TPK）家族成员。有Nue基因扩增的患者复发和转移率高，可作为乳腺癌预后的一项重要指标。采用Southern印迹法，可以检测Nue基因的拷贝数；Northern印迹方法检测Nue基因表达水平，进行定量分析。 3. 大肠癌 在肠癌癌变的过程中存在抑癌基因FAP（family adenomatous polyposis）、DCC、p53基因的丢失，p53基因的突变；癌基因K-ras的点突变、C-myc的过量表达等现象。ras基因突变的检测可采用PCR-ASO方法进行，已知ras基因突变的热点在12、13及61密码子，
33、可人工合成位于待测点两侧的引物，分别扩增含12、13及61位点的基因片段，将扩增产物结合在NC膜上分别与相应的碱基突变特异性寡核苷酸探针杂交，检测突变类型。还可以采用PCR-SSCP方法，对ras基因突变进行初筛，再通过DNA测序检测点突变，简便、准确。p53基因的缺失、突变、失活是许多肿瘤发生的原因，这些肿瘤包括成骨肉瘤、肺癌、结（直）肠癌、神经纤维肉瘤。脑瘤、乳腺癌等。该基因的突变可引起蛋白质功能的突变，导致细胞转化或癌变。PCR法进行检测p53突变热点外显子5-8，先扩增外显子5-8，再进行突变位点的详尽分析，甚至测序；或采用PCR-SSCP方法，然后测序。检测p53基因的突变。（邹向阳）第 13 页 共 13 页