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1、细胞培养中问题及解决1 .如何选用特殊细胞系培养基？培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM 或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬 浮细胞培养是一个好的开始。2 .何时须更换培养基？视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。3 .可否使用与原先培养条件不同之培养基？不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，假设骤然使用和原先提供 之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。4可否使用与原先培养条件不同之血清种类？不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来
2、源，所以血清的种类和品质对于细 胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容 物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。5 何谓 FBS, FCS, CS, HS ?FBS (fetal bovine serum)和FCS (fetal calf serum)是相同的意思,两者都是指胎牛 血清，FCS乃错误的使用字眼，请不要再使用。CS (calf serum)那么是指小牛血清。 HS (horseserum)那么是指马血清。6培养细胞时应使用5%或10% CO2?或根本没有影响？一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作为pH的缓冲系统，而培养基中
3、 NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。当培养基中NaHCO3含量 为每公升3.7 g时，细胞培养时应使用10 % CO2：当培养基中NaHCO3为每公升 1.5 g时，那么应使用5 % CO2培养细胞。7.Hanks平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？ Hanks平衡盐溶液(HBS)和EaHds平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差异？HBS和EBS的主要差异在于碳酸氢钠的水平，在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (O.35g/L)中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles 液在空气水平的CO2中，溶液
4、会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希52购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形？研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少，大都是因为离心过程操作上的失 误，造成细胞的物理性损伤，以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心，应 待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。53购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？研究人员在细胞培养时出现存活率不佳，常见原因可归纳为：培养基使用错误或培 养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后， 加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用借误。细胞置于-80 0 C太久。54收到之冷冻管瓶身破裂，瓶
5、盖有裂纹，或瓶盖脱落之原因？冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当，造成冷 冻管裂损，建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱，乃因热胀冷缩之 物理现象，冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时， 均应立刻将冷冻管再一次扭紧55如何选用特殊细胞系培养基？培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM 或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬 浮细胞培养是一个好的开始，各种目的无血清培养最好首选AIM V (12005)培养 基(SFM)。56 L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗
6、？它在溶液中不稳定吗？L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能 量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降 解，但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨 对于一些细胞具有毒性。57GlulaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GIutaMAX-I?这个二肽有多稳定？ GlutaMAX-I二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸 来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。GlulaMAX-I二肽非常 稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I二肽溶
7、液有最小的降解，如果在相 同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。58什么培养基中可以省去加酚红？ 酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性 时为紫色。研究说明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，(特别是雌激素)。为防止 固醇类反响，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干 扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。59培养基中丙酮酸钠的作用是什么？丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源， 但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。60二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA
8、的目的是什么？ 二价离子确实抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保 持抑制胰蛋白的的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来 自培养基中所有的二价离子。61目录上说，Hank s平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因 是什么？ Hank s平衡盐溶液(HBS)和Earle s平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能 差异？HBS和EBS的主要差异在于碳酸氢钠的水平，在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (O.35g/L)中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles 液在空气水平的CO2中，溶液会变
9、碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希 望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液,。如果仅仅是清洗将要在细胞培养 基中储存的组织，用Hanks液就可以了。当在无血清培养基中添加抗生素时，降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%o 血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血清培养条件下，抗生素不被灭活，可能 对于细胞到达毒性水平。一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时，您应该在两到三周内使用它。因为一 些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。大局部添加物和试剂最多可以冻融3次，如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一 定水平的降解和沉淀，将会影响它的性能。在溶解的一周内使用贮
10、存在4冰箱中的液体胰蛋白酶溶液。胰蛋白醐在4就可能开始降解，如果在室温下放置超过30分钟，就会变得不稳定。细胞别离试剂(1)大局部连续细胞系，强贴壁细胞系，许多早代细胞HBSS或无钙镁PBS0.25 %胰蛋白酶溶解在无钙镁平衡盐溶液中细胞外表蛋白完整性重要的连续细胞系HBSS或无钙镁PBS0.05 %胰蛋白酶溶解在0.53mM EDTA弱贴壁表皮细胞转化成纤维细胞(要求细胞外表完整性)，原代细胞HBSS或无钙镁PBSEDTA,甘油溶解在柠檬酸钠中强贴壁早代细胞系HBSS或无钙镁PBS0.25%胰蛋白的溶解在ImMEDTA, Dispase 单位/ml溶解在PBS上皮细胞0.5mM-lmM ED
11、TAEDTA, Dispase 0.6-2.4 单位/ml 溶解在 PBS强贴壁细胞，上皮细胞，一些肿瘤细胞0.5mM-lmM EDTA0.25%胰蛋白酶ImM EDTA, Dispase 单位/ml溶解在无钙镁PBS厚培养物，多层富含胶原的密集培养1 mM EDTA0.25%胰蛋白酶，200单位/ml胶原酶，ImM EDTA溶解在无钙镁平衡盐溶液中培养液pH值变化太快CO2张力不对。培养瓶盖拧得太紧。NaHCO3缓冲系统缓冲力缺乏。培养液中盐浓 度不正确。细菌、酵母或真菌污染。(1)按培养液中NaHCO3浓度增加或减少培养箱内CO2浓度，2.0g/L到3.7g/L浓 度NaHCO3对应CO2
12、浓度为5%到10%。(2)改用不依赖CO2培养液。松开瓶盖1/4圈。加HEPES缓冲液至10到25mM终浓度。在CO2培养环境中改用基于Earle s盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用 Hanks盐配制的培养液。丢弃培养物或用抗生素除菌。培养液出现沉淀，但pH值不变用洗涤剂清洗后残留磷酸盐将培养基成分沉淀下来。冰冻保存培养液。用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后除菌。将培养液加热到37C,摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢弃培养液。培养液出现沉淀，同时pH发生变化细菌或真菌污染丢弃培养物。或用抗生素除菌。培养细胞不贴壁胰蛋白酶消化过度。支原体污染。培养液中无贴壁因子。缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰
13、蛋白酶浓度。别离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物。悬浮细胞成簇培养液中含钙、镁离子。支原体污染。蛋白酶过度消化使得细胞裂解释放DNA。用无钙镁平衡盐溶液洗涤细胞，轻轻吹吸细胞获得单细胞悬液。别离培养物，检测支原体。如发现支原体污染，丢弃培养物。用DNase I处理细胞。原代细胞培养物污染原代培养组织在进入培养前已污染培养前用含高浓度抗生素的平衡盐溶液反复冲洗组织。培养细胞死亡培养箱内无CO2。培养箱内温度波动太大。细胞冻存或复苏过程中损伤。培养液渗透 压不正确。培养液种有毒代谢产物堆积。检测培养箱内C02检查培养箱内温度取新的保存细胞种检测培养液渗透压。注意：
14、大多数哺乳动物细胞能耐受渗透压为260-350 mOsm/kg。加入额外试剂如HEPES或药物都有可能影响培养液渗透压。换入新鲜培养液培养细胞生长减慢由于更换不同培养液或血清。培养液中一些细胞生长必需成分如谷氨酰胺或生长因子耗尽或缺乏或已被破坏。培养物中有少量细菌或真菌污染。试剂保存不当。比拟新培养液与原培养液成分，比拟新血清与旧血清支持细胞生长实验。增加起始培养细胞浓度。让细胞逐渐适应新培养液。换入新鲜配制培养液。补加谷氨酰胺或生长因子。用无抗生素培养液培养，如发现污染，丢弃培养物。或用抗生素除菌。血清需保存在-5C到-20C。培养液需在2 8避光保存。含血清完全培养液在2-8 保存，并在2
15、周内用完。接种细胞起始浓度太低细胞已老化支原体污染增加接种细胞起始浓度。换用新的保种细胞。别离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物。66保存血清最好的方法？建议血清应保存在-5C至-2OC。然而，假设存放于4时，请勿超过一个月。假设您一次 无法用完一瓶，建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。67如何解冻血清才不会使产品质量受损？建议您将血清从冷冻箱取出后，先置于28c冰箱使之融解,然后在室温下使之全融。 但必须注意的是，融解过程中必须规那么地摇晃均匀。68血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理？血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血
16、清中脂蛋白的变性所造 成，而血纤维蛋白（形成凝血的蛋白之一）在血清解冻后，也会存在于血清中，亦是 造成沉淀物的主要原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。假设欲 去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心,上清液 即可接着加入培养基内一起过滤。我们不建议您以过滤的方法去除这些絮状沉淀物, 因为它可能会阻塞您的过渡膜。69为什么要热火活血清？加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血 小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在免疫学研究，培养ES细胞，昆虫细 胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。70有必要做热灭活吗？实验显示，
17、经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理 过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温 处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清，沉淀 物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会 让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在37环境中，又会使此沉淀物更增 多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。71为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀？GIBICO的胎牛血清没有预老化，储存在2 8时，血清中的各种蛋白和脂蛋白（如 冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应
18、该不会影响血清的质量。推荐在一20储存胎牛血清，防止反复冻融。72如何防止沉淀物的产生？解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法（-20至4至室温），假设血清解冻时改变的 温度太大（如-20至37）,实验显示非常容易产生沉淀物。解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。请勿将血清置于37太久。假设在37放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多 较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，假设非必要，可以无须做此步躲。假设必须做血清的热灭活，请遵守56C, 30分钟的原那么，并且随时摇晃均匀。温度过 高，时间过久或摇晃不均匀，都会造
19、成沉淀物的增多。1 .如何选用特殊细胞系培养基？培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM 或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬 浮细胞培养是一个好的开始。2 .何时须更换培养基？视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。3 .可否使用与原先培养条件不同之培养基？不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，假设骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。4可否使用与原先培养条件不同之血清种类？不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所
20、以血清的种类和品质对于细胞 的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物 上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。5 何谓 FBS, FCS, CS, HS ?FBS (fetal bovine serum)和FCS (fetal calf serum)是相同的意思，两者都是指胎牛血 清，FCS乃错误的使用字眼，请不要再使用。CS (calf serum)那么是指小牛血清。 HS (horseserum)那么是指马血清。6培养细胞时应使用5%或10% CO2?或根本没有影响？一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H作为pH的缓冲系统，而培养基中NaHC
21、O3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。当培养基中NaHCO3含量为每公升 3.7 g时，细胞培养时应使用10%CO2；当培养基中NaHCO3为每公升1.5 g时， 那么应使用5%CO2培养细胞。7 .Hank*s平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？ Hanks 平衡盐溶液(HBS)和Earles平衡盐溶液(EBS)有什么木质的功能差异？HBS和EBS的主要差异在于碳酸氢钠的水平，在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (O.35g/L)中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles 液在空气水平的CO2中，溶液会变碱，
22、Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希 望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液,。如果仅仅是清洗将要在细胞培养 基中储存的组织，用Hanks液就可以了。8 .细胞之接种密度为何？依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的 太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。9 .悬浮性细胞应如何继代处理？一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，稀释细胞浓度即可，假设培养液太多 时，可将培养角瓶口端稍微抬高，直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞 之培养液至另一新的培养角瓶，加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复前述步骤 即可。10 .冷冻管应如何解冻？取出冷冻管
23、后，须立即放入37。（2水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全 部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否那么易发生污染情形。另冷冻管由液 氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。11 .细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除DMSO?除少数特别注明对DMSO敏感之细胞外，绝大局部细胞株（包括悬浮性细胞），在 解冻之后，应直接放入含有新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新 鲜培养基以去除DMSO即可，如此可防止大局部解冻后细胞无法生长或贴附之问 题。12 .附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA浓度？应如何处理？一般使用之 irypsin-EDTA 浓度为 0.05% lr
24、ypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次开瓶后应 立即少量分装于无菌试管中，保存于-20 ,防止反复冷冻解冻造成irypsin之活 性降低，并可减少污染之机会。13 .欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？欲回收动物细胞，其离心速率一般为300xg （约LOOOrpm）, 5- 10分钟，过高之转 速，将造成细胞死亡。14 .细胞冷冻培养基之成份为何？动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 1（） %DMSO （dimethyl sulfoxide） 和9（） - 95 %原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSO稀释时 会放出大量热能，故不可将D
25、MSO直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完 成。15 .DMSO之等级和无菌过滤之方式为何？冷冻保存使用之DMSO等级，必须为Tissue culture grade之DMSO （如Sigma D2650）, 其本身即为无菌状况，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于4。 防止反复冷冻解冻造成DMSO之裂解而释出有害物质，并可减少污染之机会。假设 要过滤DMSO,那么须使用耐DMSO之Nylon材质滤膜。16 .冷冻保存细胞之方法？冷冻保存方法一：冷冻管置于4 3060分钟（-20 30分钟*） - -80 1618 小时（或隔夜）-液氮槽vaporphase长期储存。冷冻保存方法二
26、：冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 至- 80 以下，再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20 不可超过1小时，以 防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-8(rc冰箱中，惟存 活率稍微降低一些。17 .细胞欲冷冻保存时，细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial,融合瘤细胞那么以5x106 cells/ml vial为 宜。18 .培养基中是否须添加抗生素？除于特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。19 .应如何防止细胞污染？细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和
27、霉浆菌。主要的污染原因为无菌 操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技 术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。20 .如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？原那么上：直接灭菌后丢弃之。当重要的培养污染时.，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、 真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养 器皿和超净台，检查HEPA过滤器。高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反响实验确定 抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌 素如泰乐菌素时尤其
28、重要。下面是推荐确实定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。1.在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。2 .分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把 选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B推荐以下浓度，0.25, 0.50, 1.0,2.0, 4.0,8.0 mg/mlo3 .每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。4 .确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度23倍浓度的抗生素的培养液培养细 胞23代。5 .在无抗生素的培养基中培养细胞一代。6 .重复步骤4。7 .在无抗生素的培养基中培养46代，确定污染是否以已被
29、消除。21 .支原体(mycoplasma)污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨 之。22 .支原体污染会对细胞培养有何影响？支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。故进行实验 前，必须确认细胞为mycoplasma-free,实验结果之数据方有意义。23 .侦测出细胞株有支原体污染时，该如何处理？ 直接灭菌后丢弃，以防止污染其它细胞株。24 . C02培养箱之水盘如何保持清洁？定期（至少每两周一次）以无菌蒸储水或无菌去离子水更换之。25 .为何培养基保存于4久 冰箱中，颜色会偏暗红色，且pH值会越来
30、越偏碱性？ 培养基保存于4 冰箱中，培养基内之C02会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱 性。而培养基中之酸碱指示剂（通常为phenol red）的颜色也会随碱性增加而更偏暗 红。培养基偏碱之结果，将造成细胞生长停滞或死亡。假设培养基偏碱时，可以通 入无菌过滤之C02,以调整pH值。26 .各种细胞培养用的dish, flask是否均相同？不同厂牌的dish或flask,其所coating的polymer不同，制造程序亦不同，虽对 大局部细胞没有太大之影响，惟少数细胞那么可能因使用厂牌不同之dish或flask而 有显著之生长差异。27 .购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形？研
31、究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少，大都是因为离心过程操作上的失 误，造成细胞的物理性损伤，以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心，应 待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。28 .购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？研究人员在细胞培养时出现存活率不佳，常见原因可归纳为：培养基使用错误或培 养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后， 加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于-80 太久。29 .收到之冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落之原因？冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当，造成冷冻 管裂损
32、，建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱，乃因热胀冷缩之物 望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液，。如果仅仅是清洗将要在细胞培养 基中储存的组织，用Hanks液就可以了。8 .细胞之接种密度为何？依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释 的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。9 .悬浮性细胞应如何继代处理？一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，稀释细胞浓度即可，假设培养液太 多时，可将培养角瓶口端稍微抬高，直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细 胞之培养液至另一新的培养角瓶，加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复前述步 骤即可。10 .冷冻
33、管应如何解冻？取出冷冻管后，须立即放入37。（2水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内 全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否那么易发生污染情形。另冷冻管由 液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。11 .细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除DMSO?除少数特别注明对DMSO敏感之细胞外，绝大局部细胞株（包括悬浮性细胞），在 解冻之后，应直接放入含有新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新 鲜培养基以去除DMSO即可，如此可防止大局部解冻后细胞无法生长或贴附之问 题。12 .附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA浓度？应如何处理？一般使用之 trypsin-EDTA
34、浓度为 0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次开瓶后 应立即少量分装于无菌试管中，保存于-20。（2,防止反复冷冻解冻造成trypsin之 活性降低，并可减少污染之机会。13 .欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？欲回收动物细胞，其离心速率一般为300xg （约lOOOrpm）, 5 - 10分钟，过高之 转速，将造成细胞死亡。14 .细胞冷冻培养基之成份为何？动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - IO%DMSO （dimethyl sulfoxide） 和9095 %原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSO稀释时 会放出大
35、量热能，故不可将DMSO直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完 理现象，冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时，均 应立刻将冷冻管再一次扭紧。30 .L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量 来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解， 但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于 一些细胞具有毒性。31 .GlulaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I?这个二肽有多稳定？ GlutaMAX-I二肽是一个
36、L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来 保护。一种肽醐逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GiutaMAX-I二肽溶液有 最小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。32 .什么培养基中可以省去加酚红？酚红在培养基中用作PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。 研究说明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，(特别是雌激素)。为防止固醇类反响， 培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些 研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。33 .如何用台
37、盼兰计数活细胞？用无血清培养基把细胞悬液稀释到200200()个/毫升，在0.1毫升细胞悬液中加0.1 毫升().4%的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排 斥台盼兰，因而染成蓝色细胞是死细胞。34 .培养基中丙酮酸钠的作用是什么？丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但 是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。35 .二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？ 二价离子确实抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持 抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞
38、，以消除来自 培养基中所有的二价离子。36 .室温下配制的Tris-HCl溶液，在37使用时PH值是多少？缓冲液PH值随温度变化而变化。下表列出了 50mM Tris-HC溶液在4, 25, 37时，不同PH值。50mM Tris-HC 溶液在 4, 25, 37c时，不同 PH 值.如何从T25瓶中转移sf9细胞？能用胰蛋白酶消化吗？我们推荐使用脱落细胞的方法，此技术破坏性最小，生活力最高。通过使用巴斯 德吸液管，让细胞上培养基流动。作为一种选择你也可以轻轻拍打培养瓶。只有 在绝对必要的情况下，才使用胰酶消化细胞。37 .胰酶消化一个T25瓶的sf9细胞：1 .去除培养基。2 .用2mllx
39、PBS （足以覆盖细胞外表）洗涤细胞，去除PBS。3 .加入2ml lx胰酶EDTA （恰好覆盖细胞外表）。4 . 37 孵育5到10分钟。在仪器下检测看到5分钟后它们正在向上移动。5 .向细胞中加入2ml细胞培养液，移入锥形管，用2ml培养液洗瓶壁，移入同 一锥形管中。（培养基中的FBS终止了胰酶的活性。）.离心（UOOrpm）沉淀细胞。去除培养基。6 .用新的培养基重新悬浮细胞。传代。39.在Sf9,Sf21,和high Five细胞悬浮培养时，肝素的使用量是多少？为了防止悬浮培养细胞聚集的形成，使用肝素浓度为1（）单位/毫升细胞悬液。4（）.在重新冻存sf9细胞前，它可以传多少代？随着传
40、代的次数的增加，它的感染 能力会降低吗？通常情况当细胞经过3（）次传代后，应该返回冻存。无论什么时候计数时，都应 该检查细胞活力。如果超过95%的细胞保持有活力和在大约30小时左右加倍, 细胞仍然可以使用。如果活力和加倍时间下降，它们的感染力将不在是有效的。 41.贮存在冰箱中的瓶口已开的培养基，在放置几天后颜色变紫？这主要是由于在暴露到周围的CO2水平时，碳酸氢纳导致了 pH值的上升。您 可以在使用前松开瓶口，在CO2培养箱孵育培养基10-15分钟，来校正溶液的 pH值（确定松开瓶口以保证气体交换）。42 .细胞培养基偶然被冻，可否继续使用？如果细胞培养基偶然被冻，您应该熔化培养基并观察是否
41、有沉淀产生。如果没有 沉淀产生，培养基可以正常使用，如果出现沉淀，只能丢弃这些培养基。43 .无血清培养与有血清培养使用的抗生素量一样吗？当在无血清培养基中添加抗生素时，降低至少在有血清培养基中所使用浓度的 50%o血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血清培养条件下，抗生素不被灭 活，可能对于细胞到达毒性水平。44 .培养基中添加了血清和抗生素后，可长期保存吗？一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时，您应该在两到三周内使用它。因 为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。45 .培养基及其它添加物和试剂可反复冻融吗？大局部添加物和试剂最多可以冻融3次，如果次数更多都会在包含蛋白的溶液
42、引 起一定水平的降解和沉淀，将会影响它的性能。46 .为什么要在溶解的一周内使用贮存在4冰箱中的液体胰蛋白酶溶液？ 胰蛋白酶在4c就可能开始降解，如果在室温下放置超过30分钟，就会变得不 稳定。47 .保存血清最好的方法？我们建议血清应保存在-5至-20。假设存放于4时: 请勿超过一个月。假设一 次无法用完一瓶，建议无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。48 .如何解冻血清才不会使产品质量受损？将血清从冷冻箱取出后，先置于28c冰箱使之融解，然后在室温下使之全融。但必须注意的是，融解过程中必须规那么地摇晃均匀。49 .血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理？血清中沉淀物的出现有许多种
43、原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性 所造成，而血纤维蛋白（形成凝血的蛋白之一）在血清解冻后，也会存在于血清中， 亦是造成沉淀物的原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。假设欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心, 上清液即可接着加入培养基内一起过滤。最好不使用过滤的方法去除这些絮状沉 淀物，因为它可能会阻塞过滤膜。50 .为什么要热灭活血清？加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞 和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在免疫学研究，培养ES细胞、 平滑肌细胞时，推荐使用热火活血清。51 .有必要做热灭活吗
44、？实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。经此 处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因 为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血 清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是“小黑 点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在37c环境中，又会 使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。假设非必须，可以不需要做热处理这一步。不但节省时间，更确保血清的质量！52 .为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀？有些胎牛血清产品没有预老化，储存在2 8时，血清中的各种蛋白和脂蛋
45、白 (如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在一20储存胎牛血清，防止反复冻融。53 .如何防止沉淀物的产生？我们建议您在使用血清的时候，注意以下的操作：(1)解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-20至4至室温)，假设血清解冻时 改变的温度太大(如-20至37),非常容易产生沉淀物。(2)解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。(3)请勿将血清置于37太久。假设在37c放置太久，血清会变得混浊，同时血清 中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。(4)血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，
46、假设非必要，可以无须做此步骤。 (5)假设必须做血清的热灭活，请遵守56, 3()分钟的原那么，并且随时摇晃均匀。 温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。成。15 .DMS0之等级和无菌过滤之方式为何？冷冻保存使用之DMSO等级，必须为Tissue culture grade之DMSO （如Sigma D2650）,其本身即为无菌状况，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保 存于4。防止反复冷冻解冻造成DMSO之裂解而释出有害物质，并可减少污染 之机会。假设要过滤DMSO,那么须使用耐DMSO之Nylon材质滤膜。16 .冷冻保存细胞之方法？冷冻保存方法一：冷冻管置于4 3
47、060分钟（-20 30分钟*） - -80 16-18 小时（或隔夜）-液氮槽vaporphase长期储存。冷冻保存方法二：冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降13 至- 80 以下，再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20 不可超过1小时，以 防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-8（TC冰箱中，惟存 活率稍微降低一些。17 .细胞欲冷冻保存时，细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial,融合瘤细胞那么以5x106 cells/ml vial 为宜。18 .培养基中是否须添加抗生素？除于特殊筛选系统中外，
48、一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。19 .应如何防止细胞污染？细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无 菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作 技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。20 .如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？原那么上：直接灭菌后丢弃之。当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、 真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养 器皿和超净台，检查HEPA过滤器。高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而