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1、细胞培养的常见问题及解决方案王德选两种实验的优缺点n动物实验n细胞培养n活细胞n条件控制n样本均一n研究内容便于观察、检测、记录n研究范围广，费用相对经济n缺乏神经和内分泌调节，不稳定问题零：我可以养细胞吗？n阅读细胞培养相关理论及实验平台培训n细胞种类及培养条件的确立n参考文献，专业书籍及网站，询问他人，参考类似细胞的培养n原代培养或购买细胞株，请有经验的老师指导操作问题一：怎样做到不污染？n、为细胞培养工作创造一个良好的洁净环境n必备消毒器械：培养瓶，吸管，离心管等与细胞培养相关的器械n酒精灯，试管架，剪刀，镊子，废液缸等n常备物品：酒精棉球，75%酒精喷雾瓶，消毒纸巾n以上物品选择固定的
2、位置放好，以便随取随用。问题一：怎样做到不污染？n、工作人员培养成良好的工作习惯n定期为工作间做清洁，75%酒精擦拭，过氧乙酸可防止霉菌污染n定期用75%酒精擦拭擦拭培养箱内的托盘，更换消毒水n工作区或工作台在实用前用紫外线照20-30分钟。问题一：怎样做到不污染？n、工作人员培养成良好的工作习惯n提前10分钟打开吹风机n工作人员操作前洗手，戴帽，戴口罩，手套n所用培养基等试剂从冰箱取出后用用75%酒精擦拭后再放工作台n试剂瓶开启后，要倾斜放在试管架上n操作过程中尽量减少谈话问题二：怎样观察活细胞和死细胞n、活细胞n透明，饱满，清晰问题二：怎样观察活细胞和死细胞n、死细胞n灰暗，无光泽问题三：
3、细胞在什么时候传代最好？如何掌握细胞生长密度？n一般情况下，细胞在生长至完全汇合后就要传代，所有细胞都有一个共同要求，即不宜生长过密（也就是通常说的长老了），许多细胞系都有它的生长特点：n成堆成片的生长n成克隆样生长问题三：细胞在什么时候传代最好？如何掌握细胞生长密度？n有接触抑制的细胞，就要在它完全汇合前传代，即80%密度，不然细胞就会引起分化。n刚拿到细胞株怎么办？问题四：细胞消化时怎样掌握火候n细胞生长汇合密度为80%-100%时就要消化传代n消化液浓度：0.05%T+0.02%EDTA 0.25%T+0.03%EDTAn消化液的问题四：细胞消化时怎样掌握火候n细胞在消化前先加消化液，洗
4、一下倒掉，再加消化液消化5-15分钟，细胞没有消化成园形时不要振动，待细胞完全变圆后，加新鲜培养基，按1:3或按要求分瓶。此过程一般不需要离心，培养基中的血清会中止消化液的活性。n有没其它消化方式，时间如何控制？消化液要吸出吗？n常见问题：细胞没反应或消化过度怎么办？问题五：悬浮细胞如何传代？n细胞密度在2106，也就是掌握在生长至最大密度之前传代，方法:离心弃去旧液，加新鲜培养液将细胞混匀，然后分成3-6瓶（或按要求分瓶）。问题六：细胞在培养过程中经常出现一些黑点点，是污染吗？n肉眼观察液体是否浑浊n镜下观察黑点是否游动，要与布朗运动区别n细胞状态如何n以上都不是，可能属于以下情况问题七：培
5、养中黑点点是怎么形成的？n细胞生长过老n使用的血清等试剂反复冻融n培养基的PH不合适n培养基配制过程中水质、容器不合格如何防止黑点点是的生成？n掌握细胞传代的最佳时机。n减少血清等试剂的冻融次数，培养基无需在37水浴（拿出放半小时）n培养基的PH调到最佳(略酸，特殊细胞特殊要求)n严格控制水质、容器严格洗刷如何处理黑点点？n慢速离心，换新瓶。（500-600prm 5min）n如果是贴壁细胞，用D-Hanks或PBS洗，或将细胞消化下来，移入离心管内慢速离心，然后弃上清，加入新鲜培养液继续培养n类似于层析的方法，先将5ml血清加入离心管，再将细胞悬液浓缩于1ml液体中，然后加入血清上层，慢速离
6、心。问题八：怎样让细胞适应新的条件？n从原条件逐渐过度：原3/4新1/4 1:1 1/4:3/4完全新培养基n换成新的培养基后应连续传三代再做实验比较稳定n以上实验应做对照n谢谢！n支原体是一种大小介于细菌和病毒之间(最小直径02um)并独立生活的微生物约有1%可通过滤菌器。支原体无细胞壁形态呈高度多形性可为圆形、丝状或梨形。支原体形态多变，在光境下不易看清内部结构。电镜下观察支原体膜为三层结构其中央有电干密度大的密集颗粒群或丝状的中心束。支原体多吸附或散在于细胞表面和细胞之间。横断面与细胞微绒毛相似，但微绒毛电子密度比支原体小，且中央无颗粒群或中央束。支原体代谢需固醇类物质、部分种类需要精氨
7、酸、O 2或葡萄糖，每一种支原体都有自身持点。多数支原体适合于偏碱条件下生存(PH7680)，对酸耐受性差。对热比较敏感，对一般抗生素不敏感。支原体污染细胞后培养液可不发生混浊多数情况下细胞病理变化轻微或不显著，细微变化也可由于传代、换液而缓解因此易被忽视。但个别严重者，可致细胞增殖缓慢甚至从培养器皿脱落。为确定有无支原体污染可做如下检测：相差显微境检测：将细胞按种于事先放置于培养瓶内的盖玻片上，24h后取出，用相差油镜观察支原体呈暗色微小颗粒位于细胞表面和细胞之间。荧光染色法：荧光染色用能与DNA特异性结合的荧光染料Hoechst 33258，可使支原体内含有的DNA着色，染色后用荧光显微镜
8、观察。具体方法如下：首先将细胞接种盖玻片上，在细胞未长满前取出玻片，用不合酚红的Hanks液漂洗一下，用l：3醋酸甲酵固定10Min，然后用生理盐水漂洗置于用生理盐水配浓度为50pgml的Hoechst 33258中染色10min。染色后用蒸溜水洗12min向细胞面滴加pH55磷酸缓冲液数滴，然后置荧光显微镜下观察。镜下支原体为散在于细胞同围或附于细胞膜表面的亮绿色小点。电镜检查；用扫描电镜方法简便快速也可以利用透射电镜。DNA分子条文检查或支原体培养等方法：检出率高但方法较为复杂 有专门的去除支原体的试剂，在培养液中加入试剂后传代培养3星期左右就可以去除。我是因为在做免疫荧光的时候在显微镜下看到有支原体污染，然后加mycoplasma remove reagent大约过了3星期在用的时候就没有支原体污染了。