大肠杆菌感受态细胞制备2.docx

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1、一、实验目的学习大肠杆菌感受态细胞的制备方法，并通过转化的方法导入DNAo二、实验原理在进行基因克隆时，体外构建的DNA重组子必须导入合适的受体细胞，才可以复 制，增殖和表达。裸露的外源DNA直接进入细胞体内称为转化。载体与外源目的 基因构成的重组载体可以通过转化直接导入受体细胞，从而实现基因在异源细胞 的表达。进行转化时，要求细胞处于容易吸收外源DNA的状态，即感受态，重组 分子才能进入细胞内。通过CaCl 2处理的大肠杆菌细胞就是一种感受态细胞。在0冷冻处理时，处 于CaCl 2低渗溶液中的大肠杆菌细胞膨胀成球形。DNA可吸附于其外表。在短 暂的热冲击下，细胞吸收外源DNA,然后在丰富培养

2、基内复原并增殖，表达外源 基因。带有选择标记基因的外源载体在受体细胞内可表达时，受体细胞表现标记基因的 表型，使转化子与非转化子在选择培养基上区分开来。三、材料、试剂及器具1、材料E. coli DH5 apUC19质粒2、试剂（1）0. Imol/L CaCl 2 （灭菌）0（2） LB液体培养基、固体培养基。配制每升培养基，应在950mL去离子水中加入：胰蛋白陈（bacto - typtone）10g酵母提取物（bacto - yeast extract）5gNaCl10g摇动容器直至溶质完全溶解，用NaOH调节pH至7.0,加入去离子水至终总体积 为IL, 121c湿热高温灭菌20min

3、o（3）氨苇青霉素（帆）：用无菌水配制成lOOmg/mL溶液，置-20冰箱保存。2. 划线培养到LB平板上，30度，16-20h.3. 挑单菌落，取5ml摇过夜。4. 接1ml加入到15nli培养基的比例，用大瓶摇（保证供氧）。18度,摇6h以上（按实际生长情况延长。5. 0. 05M Gael2悬浮后冰浴30分钟。6. 4000rpm, 10分钟。7. 0. 05M Cacl2今 15%甘油重悬。8. 200微升每份包装，-70保存.视情况而定，第一步可省略，这个方法是我们实验室综合几种方法而改进的，用 的情况不错，效率也挺高，可以保存至少两个月。3、器具(1)超净工作台。(2)恒温水浴锅。

4、(3)恒温摇床、培养箱。四、操作步骤以下操作均须无菌环境，在超净工作台上进行。一、感受态细胞的制备从大肠杆菌DH5 a的培养平板上挑取一个单菌落接于2mLLB液体培养基的试管中，37振荡培养过夜。以1%的接种量将以上过夜培养物接种于液体培养基中I 37振荡培养23h!将菌液转移到1.5mL离心管中,冰上放置lOmin!4000rpm,离心lOmin回收细胞倒出培养液，将管倒置Imin以便培养液流尽I用冰冷的0. Imol/L CaCl 21mL,悬浮沉淀立即放在冰上保温30min4, 4000rpm,离心lOmin,回收细胞用冰冷的0. Imol/L CaCl 2 0. 1mL悬浮细胞(务必放

5、冰上)I分装细胞，每100p 1 一份。此细胞为感受态细胞。二、质粒pUC19的转化在loop 1新鲜配制的感受态细胞中加入pl-C19 DNA2p l(W50ng),混匀同时做以下对照管受体菌对照：loop 1感受态细菌+2|J 1无菌水质粒对照：100p 1 0. Imol/L CaCl 2溶液+2p 1质粒I冰上放置30minI将管放到42c循环水浴热冲击90sI取出，迅速冰浴2minI每管加400p 1 LB液体培养基，37c慢摇复苏lhI取50P 1已转化的感受态细胞或对照样品，各分别涂在含有或不含有氨芳青霉素的培养皿中待吸干菌液后，倒置培养皿，于37培养过夜次日观察，并记录转化情况

6、，计算转化率（转化子数gDNA） o大肠杆菌电转化感受态细胞制备第一天：1 .将适合菌株（如XLl-Blue, DH5a ）置于LB或其他营养丰富的培养基上，在 37 C下过夜培养.高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）以备第二天摇瓶用2 .准备几瓶灭菌水（总量约1.5升），保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用第二天：3 .转移0.2-lml过夜培养物至装有500nli LB（或其他营养丰富的培养基）的1-2 升挡板恐？4 . 37 C下剧烈振荡培养2-6小时.定时监控值（培养1小时后每半小时测定一次）5 .当值到达时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少15 分钟（需要的话这种方式可以存放培

7、养液数小时）.细胞在4 C 5000g下离心15分钟，弃上清液（如需要，沉淀可在4 C的10% 甘油中保存一两天）6 .用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中（几 毫升），然后加水稀释至离心管的2/3体积。7 .照上面步骤重复离心，小心弃去上清液.照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞8 .离心，弃上清液.用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞14.照上面步骤离心，小心 弃去上清液（沉淀可能会很松散）15 .用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml.将细胞按150p 1等份装入微量离心管，于-80。C保存转化方法：1 .在冰上解冻电感受态细胞添加l-10p 1

8、DNA ,冰上培育约5分钟.添加1-3p 1 DNA ,冰上培育约5分钟2 .转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器（无泡）中.加载 P1000,准备好 300P 1 LB 或 2xYT3 .对电穿孔容器进行脉冲（200欧姆，25p Fd, 2.5千伏）（检查时间常数，应该 在3以上）.立即添加300H 1的LB或2xYT至电穿孔容器中4 . 37 C下培养细胞40分钟至1小时以复原大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法大肠杆菌电转化感受态细胞制备第一天：L将适合菌株（如XLl-Blue, DH5。）置于LB或其他营养丰富的培养基上，在 37 C下过夜培养.高温灭菌大的离心瓶（250

9、-500D11）以备第二天摇瓶用2 .准备几瓶灭菌水（总量约1.5升），保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用第二天：3 .转移0.2Tml过夜培养物至装有500ml LB（或其他营养丰富的培养基）的1-2 升挡板X恐？4 . 37 C下剧烈振荡培养2-6小时.定时监控值（培养1小时后每半小时测定一次）5 .当值到达时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少15 分钟（需要的话这种方式可以存放培养液数小时）8,细胞在4 C 5000g下离心15分钟，弃上清液（如需要，沉淀可在4 C的10% 甘油中保存一两天）9 .用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中（儿 毫升），然后加水

10、稀释至离心管的2/3体积。10 .照上面步骤重复离心，小心弃去上清液.照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞11 .离心，弃上清液.用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞14.照上面步骤离心，小心 弃去上清液（沉淀可能会很松散）15 .用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml.将细胞按150p 1等份装入微量离心管，于-80 C保存转化方法：1 .在冰上解冻电感受态细胞添加1-lOp 1 DNA ,冰上培育约5分钟.添加1-3口 1 DNA ,冰上培育约5分钟2 .转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器（无泡）中.加载 P1000,准备好 300H 1 LB 或 2xYT3 .

11、对电穿孔容器进行脉冲（200欧姆,25p Fd, 2.5千伏）（检查时间常数，应该 在3以上）.立即添加300p 1的LB或2xYT至电穿孔容器中4 . 37 C下培养细胞40分钟至1小时以复原.转移细胞至适当的选择培养基上培养大肠杆菌感受态细胞的五种制备方法方法一：细菌转化的方法多以Mendel和Higa （1970）的发现为基础，其基本方法是用冰预冷的CaCI2 或多种2价阳离子等处理细菌，使之进入感受态得以转化。用CaCI2制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞，常用于成批制备感受态细菌。本法适用于 大多数大肠杆菌菌株，且迅速、重复性好。操作过程简述如下。1.从37c培养1620h的新鲜平板

12、中挑取一个单菌落（如大肠杆菌DH52）,或1ml新鲜的 1620h过夜培养物，转到一个含有lOOmILB培养基的1L或500ml烧瓶中。于37剧烈 振摇培养约23h （旋转摇床200300r/min）,每隔2030min测量OD600值=0.40 2.在无菌条件下将细菌转移到一个，用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中，在冰上放置10 20min。3 .于4c用SorvallGS2转头（或与其离心管相配的转头）以4000r/min离心lOmin,以回收 细胞。4 .倒数培养液，将管倒置lmin以使最后残留的痕量培养液流尽。5 .以10ml用冰预冷的0.1mMCaCI2重悬每份沉淀，放于冰上。6 .于

13、4用SorvallGS3转头（或与其相应的转头）以4000r/min离心lOmin,以回收细胞。7 .倒出培养液，将管倒置lmin以使最后残留的痕量培养液流尽。8 .每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1M CaCI2重悬每份沉定，此时，可以迅速将细胞 分装成小份，液氮中冰冻，-70C贮存备用。9 .用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取2003转移到无菌的微量离心管中，每 管加DNA或连接反响混合物（体积04，DNA50ng）,轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放 置 30min。0 将离心管放到预加温到40的循环水浴中的试管架上，放置90s2min,不要摇动试管。1 快速将管转移到冰浴中

14、，使细胞冷却12min。每离心管加800HlsOC培养基，用水浴将培养基加温到37,然后将管转移到37c摇床上， 温育 45min 使细菌及苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。13.将适当 体积（每个90mm平板可达2001）已转化的感受态细胞转移到含200mmol/l MgS04和相 应抗生素的SOB培养基上。14 .将平板置于室温至液体被吸收。15 .倒置平皿，于37培养，1216h后可出现菌落。方法二：CASsuper One-Step Competent Cell Preps Kit采用一种简单便捷的方法处理大肠杆菌，使其成 为感受态细胞，便于质粒DNA的转化，可满足一般实验的要

15、求。与CaCI2法相比具有多种 优点：使用方便，只需一步即可完成感受态细胞的制备；转化效率略高于CaCI2法，一般 可达106-108cfu/Pg,满足一般实验需要；感受态细胞制成后即可保存于-70C,无须加入甘 油，并且经长期保存活力无明显下降。准备工作：1 .从液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌冻存菌，在LB平板上划线，37度过夜至长 出单菌落。挑形态饱满的单菌落2个，分别接种5ml LB培养基中，37, 250rpm, 过夜培养。2 .次口从5mlLB培养物吸取200Hl转入50mlLB培养基中（250ml锥形瓶），37 , 250rpm培养 2 小时，此时 OD600约 。感受态细胞的制备

16、：3 .吸取1ml菌液到1.5ml离心管里，5000rpm离心5分钟,弃去上清。4 .加入1003预冷的Solution A,悬浮菌体,冰浴30分钟。5 .此时感受态细胞已经制成可立即使用或-70保存。细胞转化：6 .在感受态细胞中加入100pg-10ngDNA,混匀，冰浴30分钟，然后42 1分钟热 击，再次冰浴2分钟。加入OSmlLB培养基,20plSolution B, 37,振荡 培养1小时。7 .取适当菌液(100-2003)涂布相应抗性的平板。8 .过夜培养约16个小时，数菌落数，计算转化率。补充说明：1 .所用器具一定要清洁；.操作步骤2中培养基的装量也是很重要的，建议装量不要高

17、于此值：500ml锥形 瓶装100ml培养基，250ml锥形瓶装50ml培养基；2 .在收获菌体前半小时还可以在培养基中加入20mM的MgCI2 ,效果会更好一些；.为保证细胞处于对数生长期，培养后的菌体的OD值不要高于0.6；3 .制备感受态细胞时所有操作尽量保证在冰上操作：6,细胞转化操作步骤6中也可以不必进行热击，冰浴后直接加入新鲜LB,简化操作 步骤，但转化效率低于热击方法，适用于对转化率要求不高的实验。方法三：1、取1%大肠杆菌E.coli接种于含2mlLB培养基的试管中，37振荡培养过夜2、取0.1ml过夜培养物转种于含10ml LB培养基的三角瓶中，37振荡培养3h至OD600=

18、0.33、然后把培养物倒入1.5ml离心管中，冰浴lOmino4、在4下以4000rpm离心5min,去上清液5、把菌体悬浮丁 15ml冰冷的0.1MCaCI2溶液中，置冰上30min6、然后再在4下以4000rpm离心lOrnin,去上清液7、将菌体悬浮于0.1mlCaCC溶液中,冰浴放置4-12hr备用。方法四：(1)将1ml过夜培养的细菌(如DH52、TGI. TM101)接种于100ml2xYT培养于500ml烧 机 于37刷烈振荡，通能200rpm培养的细菌密度约OD550=0.20.5(5xl07cells/ml),需2 4ho(2)将培养物放于冰上致冷10min,于4c离心细菌培

19、养物，lOOOOrpm离心10min。(3)弃除上清，将细菌悬浮于原始培养体积的一半(约50mD的50mMeaCI2和10mmTrisHCI (pH8.0)无菌冷冻液体中。(4)将细菌悬浮放在冰上约5min,然后将悬浮物于410000/rpm离心10min.(5)弃上清，悬浮细菌于原始培养体积的1/15的50mMCaCI和10mMTrisHCI (pH8.0)无 菌冷冻中。此时的细胞是感受态细胞，即可用于转化。200Hl分装于无菌的1.5ml微量离心 管中，贮存于-80C冰箱中。方法五：TSB法（也是本人热衷的方法）.药品制备lMMg2+（lMMgSO4和IM MgCI2等体积混合）,用0.2

20、2um滤膜超滤除菌。TSB液（30mL/80mL菌液）（现配现用）：PEG33503gTryptone 0.3gYeast extract 0.15gNaCI0.3g以上 1210Cz15min 灭菌后，加入 IM Mg2+600uL,以及 DMSO 3mL.步骤：（1）活化菌株（2）挑单菌落培养于5mL的液笨培养基中（3）取液体培养物50uL于80mL的液体培养基中进行扩大培养370c培养 34 小时，OD600 在 0.4 0.6（5）离心，去上清（6）加入20mLTSB,重悬（7）离心,去上清（8）加入lOmLTSB,再加入15 20%的甘油,分装保存注，整个操作过程均应在冰上进行。所用

21、药品均需灭菌。转化程序（1）取出2003感受态细胞慢慢使其溶化，并立即放于冰上，加入DNA或连接反响混合物， DNA量通常450mge用手指弹打试管10次，使之混匀，然后放在冰上4045min。（2）将管放于42水浴中2min。（3）然后每管直接加入1.0ml2xYT培养基，倒置混匀，并于37培养812h,干浴或水浴， 不需振摇。此期间使细菌生长并开始表达抗菌素。 IPTG （200mg/ml）o（5）铺板使细菌混合物干后，倒转平板放于3037培养箱中1822h0克隆在此期间应 该出现，否那么转化不成功。常用的大肠杆菌感受态细胞的制备方法除以上几种外，还有很多。各种方法都各有其优缺点, 我们在选择方法的时候应根据自己实验具体情况而定。以期获得最高的转化效率大肠杆菌感受态细胞的制备（实验室修改版）1.1.从-70冰箱取出菌种。按1： 1000比例接种复壮。