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1、大肠杆菌感受态细胞制备第1页，共13页，编辑于2022年，星期六一、实验目的n通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备的方法和技术。第2页，共13页，编辑于2022年，星期六二、实验原理n感受态细胞制备感受态细胞制备:所谓感受态是指受体细胞处于容易吸收所谓感受态是指受体细胞处于容易吸收外源外源DNA的一种生理状态，可以通过物理与化学方法的一种生理状态，可以通过物理与化学方法诱导形成，也可以自然形成，在基因工程技术中通常诱导形成，也可以自然形成，在基因工程技术中通常采用诱导的方法。用于转化的受体菌细胞一般是限制采用诱导的方法。用于转化的受体菌细胞一般是限制-修饰系统（修饰系统（Restricti
2、on-Modification）缺陷的变异株，）缺陷的变异株，以防止对导入的外源以防止对导入的外源DNA的切割，用符号的切割，用符号R-M-表示。表示。第3页，共13页，编辑于2022年，星期六二、实验原理n其基本原理是：细菌处于其基本原理是：细菌处于0的的CaCl2低渗溶液中，低渗溶液中，会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生变化，转化混合会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生变化，转化混合物中的质粒物中的质粒DNA形成抗形成抗DNase的羟基的羟基-钙磷酸复合物钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经过黏附于细胞表面，经过42短时间的热激处理，促短时间的热激处理，促进细胞吸收进细胞吸收DNA复合物，在丰富的培养
3、基上生长数复合物，在丰富的培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，在选择培养基小时后，球状细胞复原并分裂增殖，在选择培养基上可获得所需的转化子。上可获得所需的转化子。第4页，共13页，编辑于2022年，星期六 三、实验材料与设备三、实验材料与设备n1、用品与与仪器：、用品与与仪器：n 超净工作台、恒温培养箱、移液器、微型离心管等、台式冷超净工作台、恒温培养箱、移液器、微型离心管等、台式冷冻高速离心机、冰箱、制冰机等；冻高速离心机、冰箱、制冰机等；n1.5mL 与与0.5mL Eppendorf 管、管、tip头头、烧杯、量筒。、烧杯、量筒。镊子、试镊子、试管三角瓶、玻璃涂棒、酒精灯、无菌
4、牙签、管三角瓶、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、吸水纸，一次性吸水纸，一次性塑料手套等；塑料手套等；nE.coli DH5受体菌受体菌(R-M-)，pGEX-4T-2质粒质粒(Ampr)。第5页，共13页，编辑于2022年，星期六三、实验材料与设备三、实验材料与设备n2 2、试剂：、试剂：nLBLB培养基培养基:蛋白胨蛋白胨 10g/L10g/L，酵母提取物，酵母提取物 5g/L5g/L，NaCl 10g/LNaCl 10g/L，琼脂，琼脂粉粉 15g/L15g/L（固体培养基），用（固体培养基），用10 mol/L10 mol/L的的NaOHNaOH调节调节pHpH为为7.07.0，高压灭，高压
5、灭菌；菌；n氨苄青霉素贮存液：浓度氨苄青霉素贮存液：浓度50-100mg50-100mgmLmL；n含有抗菌素的含有抗菌素的LBLB平板培养基：将配置好的平板培养基：将配置好的LBLB固体培养基高压灭菌后，固体培养基高压灭菌后，冷却到冷却到6060度左右，加入氨苄青霉素（终浓度为度左右，加入氨苄青霉素（终浓度为50g50gmLmL浓度浓度50-50-100g100gmLmL）；）；第6页，共13页，编辑于2022年，星期六超净工作台第7页，共13页，编辑于2022年，星期六恒温培养箱第8页，共13页，编辑于2022年，星期六制冰机第9页，共13页，编辑于2022年，星期六高速冷冻离心机和超速离
6、心机等高速冷冻离心机和超速离心机等第10页，共13页，编辑于2022年，星期六四、实验操作n1、从新活化的、从新活化的E.coli DH5平板上挑取一平板上挑取一单菌落单菌落，接种于，接种于35ml LB液体培养中，液体培养中，37振荡培养至对数生长期振荡培养至对数生长期(12h左右左右)；n 2、将该菌悬液以、将该菌悬液以1:1001:50转接于转接于100ml LB液体培养基中，液体培养基中，37振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔2030min测一次测一次OD600，至，至OD600为为0.30.5时停止培养，并转装到时停止培养，并转装到1
7、.5 mL离心管离心管中；中；n 3、培养物于冰上放置、培养物于冰上放置20min；n 4、04，4000g离心离心10min，弃去上清液，加入，弃去上清液，加入1 mL冰冷的冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心悬浮细胞溶液，小心悬浮细胞,冰浴冰浴20分钟；分钟；第11页，共13页，编辑于2022年，星期六四、实验操作n 5、04，4000g离心离心10min，倒净上清培养液，再用，倒净上清培养液，再用1.0 mL冰冰冷的冷的0.1mo1L CaCl2溶液溶液轻轻悬浮轻轻悬浮细胞，冰浴细胞，冰浴20min；n 6、04，4000g离心离心10min，弃去上清液，加入，弃去上清液，加入10
8、0 L冰冷的冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，溶液，小心悬浮细胞小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液；受态细胞悬液；n 7、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，如果在如果在4放置放置1224h，其转化效率可以增高，其转化效率可以增高46倍倍；也可加入占总体积；也可加入占总体积15左左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置于离心管中，置于-70条条件下，可保存半年至一年。件下，可保存半年至一年。第12页，共13页，编辑于2022年，星期六五、思考题n制备感受态细胞时，应特别注意哪些环节？第13页，共13页，编辑于2022年，星期六