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1、大肠杆菌感受态细胞制备及转化 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望实验目的实验目的掌握制备和保存大肠杆菌感受态细胞的掌握制备和保存大肠杆菌感受态细胞的方法方法掌握转化的方法技术掌握转化的方法技术了解转化过程中各因素对转化率的影响了解转化过程中各因素对转化率的影响感受态及转化实验原理感受态及转化实验原理定义定义感受态（感受态（Competence)Competence)：细菌处于容易吸收外源细菌处于容易吸收外源DNA DNA 的状态的状态转化（转化（tra
2、nsformation)transformation)：异源异源DNADNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞的过程的过程致敏过程致敏过程:用理化方法诱导细胞进入感受态的操作用理化方法诱导细胞进入感受态的操作在生长周期的任何时刻自动产生感受态；在生长周期的任何时刻自动产生感受态；（e.g.枯草杆菌）枯草杆菌）在生长周期的特定时刻产生感受态；在生长周期的特定时刻产生感受态；（e.g.大肠杆菌）大肠杆菌）细菌产生感受态的类型细菌产生感受态的类型 受体菌与质粒的选择受体菌与质粒的选择u受体菌：受体菌：E.Coli DH5：无Ap抗性u外源质粒外源质粒 Ampr抗性基因编码一种周质酶（-内酰胺酶）可特异
3、地切割Amp的-内酰胺环，从而使其失去杀菌能力 选择选择:如进行蓝白斑筛选时可选用DH5、JM109、TG1；用T7启动子进行原核表达时可选用BL21(DE3)；制备感受态细胞方法 原生质体法原生质体法 电击法电击法 特殊试剂诱导法：特殊试剂诱导法：CaCl2诱导法诱导法u +质粒DNA420C热击复苏Amp+细菌处于00C,CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面,经短时间420C热击处理,促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放在非选择性培养基上保温一段时间，使抗氨苄青霉素的表型表达后再转到含氨苄青霉素的选择性培养基上，长出来的菌即为转
4、入了外源基因的菌株。转化率定义及计算转化率定义及计算公式：公式：转化子数转化子数/ug ug DNADNA=单菌落数单菌落数 质粒浓度质粒浓度(ng/ul)ng/ul)X X 1 1uLuL2.5ng/uL X10 x1000影响转化效率的因素影响转化效率的因素p细菌的生长状态：细菌的生长状态：大肠杆菌在对数中期易产生感受态 OD值：0.30.5(5X107个/ml)p试剂的质量：试剂的质量：化合物及无机离子：Rb+、Mn+、二甲亚砜等p质粒质粒：大小、构型p外源外源DNADNA（质粒）与细胞的比例质粒）与细胞的比例：p器皿的洁净度器皿的洁净度p污染污染尽量所有打开器皿盖的操作都在超净台中进行
5、尽量所有打开器皿盖的操作都在超净台中进行感受态细胞的保存 制备好的感受态细胞每制备好的感受态细胞每100uL分装一支分装一支EP管管 轻轻混匀轻轻混匀-可以用可以用tip头轻轻搅匀头轻轻搅匀.4保存（不加甘油）保存（不加甘油），可保存一周；，可保存一周；加加30%甘油，甘油，-20 保存，可保存一月；保存，可保存一月；加加30%甘油，甘油，80 保存，可保存六月；保存，可保存六月；实验器材摇床分光光度计冷冻离心机超净工作台恒温水浴涂布棒恒温培养箱实验试剂LB液体培养基LB固体培养基氨苄青霉素0.1 M CaCl230%甘油实验流程1、接单菌落到接单菌落到5ml LB5ml LB液体培养基中，液
6、体培养基中，37370 0C C、190rpm190rpm振荡培养过夜振荡培养过夜2 2、5%5%（250 ul)250 ul)菌液接种到含菌液接种到含5 ml LB5 ml LB的试管中，的试管中，37370 0C C振荡培养振荡培养1-21-2小时，至小时，至ODOD600 600 0.4-0.5 0.4-0.5（已完成）（已完成）3 3、将将1.5mL1.5mL菌液转移到离心管中菌液转移到离心管中4 4、离心离心 5000rpm 5000rpm，4 40 0C C，5min5min5 5、倒出培养液倒出培养液6.用冰预冷的用冰预冷的1mL0.1M的的CaCl2 处理、悬浮细处理、悬浮细
7、胞，胞，7.冰上冰上20min8.(8.(取取1.51.5mL)5000rpmmL)5000rpm离心离心5 5minmin，倾去上清倾去上清9.100uL CaCl9.100uL CaCl2 2轻轻悬浮，冰浴轻轻悬浮，冰浴大肠杆菌大肠杆菌DH5感感受态的制备受态的制备实验流程大肠杆菌DH5受态的制备-1 ml-20 min实验流程质粒的转化质粒的转化1.1.实验样品实验样品:吸取50uL 感受态细胞到另一个1.5 ml EP管中，加入1uL 质粒（枪头轻轻混匀，勿吹 打）2.阴性对照阴性对照：DH5 感受态细胞50uL冰浴20mins42 90秒（静置，勿摇动）迅速放到冰上,冰浴2mins加
8、入950uL LB培养基，标明组号，37 200rpm 摇床培养 45 mins 制备制备LB琼脂平板琼脂平板(已完成已完成)含含Ap的的LB固体培养基倒平板固体培养基倒平板,每组每组5个个.（编号（编号1,2,3,4,5）不含不含Ap的的LB固体培养基平板固体培养基平板。（编号编号6）涂布涂布 样品样品(转化培养后的菌液转化培养后的菌液),涂布于涂布于1,2,3,4,5号号平板，各平板，各100100uLuL。阴性对照阴性对照(转化培养后的菌液转化培养后的菌液)100)100uL uL：涂布于：涂布于6 6号号平板。平板。静置静置15mins,倒置平板倒置平板37 培养过夜培养过夜 涂布棒的
9、使用 酒精灯的使用酒精灯的使用 使用前，浸入使用前，浸入75%酒精中；酒精中；在酒精灯上引燃涂布棒上的酒精（不要烧到手）；在酒精灯上引燃涂布棒上的酒精（不要烧到手）；等酒精烧完后，让涂布棒在空气中冷却；等酒精烧完后，让涂布棒在空气中冷却；涂布均匀；涂布均匀；将涂布棒重新除菌以备下一次使用。将涂布棒重新除菌以备下一次使用。观察结果（明天上午）观察结果（明天上午）预期实验结果：1-4号平板上出若干单菌落，说明？5号平板上没有可见菌落，说明？6号平板上出现大量菌落，说明？计数单菌落,计算转化率.p 如阴性对照中长出菌，可能原因是什么？如阴性对照中长出菌，可能原因是什么？p 菌的密度过高或培养时间过长时菌的密度过高或培养时间过长时 会在阳会在阳性菌的周围长出一些小的卫星菌落，它们是性菌的周围长出一些小的卫星菌落，它们是非非AmpAmp抗性的，试分析原因。抗性的，试分析原因。思考题思考题