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1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。yjdhfsouyghoui-第二节细菌的遗传分析内容：一、转化二、接合一、转化定义转化（transformaton）是指某些细菌通过其细胞膜摄取周围供体的染色体片段，并将此外源DNA片段通过重组参入自己的染色体组过程。只有当参入DNA片段产生新的表现型时，才能测知转化的发生。发现首先由Griffith（1928）首先在肺炎双球菌中发现，1949年Avery等在分子水平上加以研究，证实了转化因子为DNA。大部分转化作用是用肺炎双球菌、枯草杆菌和流感嗜血杆菌等完成的。转化的过程供体DNA与受体细胞间的最初
2、相互作用有4个因素影响最初的相互作用a.转化片段大小。肺炎双球菌的成功转化，转化DNA片段至少有800bp，枯草杆菌至少16000bp。b.形态。双链DNAc.浓度。对某一个特定的基因来说，供体DNA分子数目与细胞成功的转化之间有一定的相关。一般在转化一定数目DNA之前，两者成正比。如从一个抗链霉素细菌菌株提取DNA转化链霉素敏感的细胞，直到每个细胞含有10个DNA分子之前，抗性转化体的数目一直与DNA分子存在的数目直接成比例。每个细菌摄取DNA分子数10-12)b.混合培养A和B菌株。在完全的培养基上培养数小时。c.培养物离心，涂布在基本培养基上培养，结果发现长出了一些原养型（met+，bi
3、o+，thr+，leu+）的菌落。疑问是由于转化还是由于细胞直接接触而发生的遗传物质交换和重组？U型管实验1950年Davis设计（如下图）先在U管底部放入滤片，该滤片可阻止细菌通过，但不影响大分子（DNA）流过。左管加入A菌株，右管加入B菌株。左管用棉塞紧，右管加抽进气管。右管抽进气轮流加压或抽气吸引使左右大分子完全混合。待两臂细胞在完全培养基中停止生长后，将它们分别涂布在基本培养上，结果都没有出现原养型，说明直接接触是必要条件。Hayes的试验HayesW（1952）实验A菌株（链霉素处理）B菌株原养型重组体的数目没有减少B菌株（链霉素处理）A菌株没有重组作用发生说明接合中的遗传物质转移是
4、一种单向过程。接合的解释（机理）F因子的发现Hayes和Caraili-sforza（1953）进一步发现：A成为供体，是因为它有一个性因子（sexfactor）的致育因子（fertilityfactor），简称为F因子。携带F因子的菌株称为供体菌或雄性，用F+表示；没有F因子的菌株称为雌性，用F-表示。F因子结构与特性结构大小：环状,约为细菌组DNA的2%,94.5kb。基因簇:含有转移、复制和插入等序列(如下图)。特性F因子由DNA组成，是染色体外的遗传物质，能自主繁殖存在，并可以单独存在细胞质中。F因子有三种存在状态：（1）没有F因子，即F-，没有F因子的细胞称为雌性受体F-。（2）包含
5、一个自主状态的F因子，即F+，含有F因子的细胞称为雄性供体F+。（3）包含一个整合到自已染色体组内的F因子，即重组型Hfr（highfrequencerecombination，高频率重组）。Hfr使两个菌株数杂交后所产生的重组体频率大大增加（1000倍）。F因子插入不是随机的，而有许多特定的位点（如下图）。F因子整合到染色体上是可逆过程，即F因子可整合到染色体上，也可从染色体上分离下来，在切除分离中往往发生错误，分离出一个携带F因子和部分染色体基因的遗传因子，这种特殊的F因子称为F因子。F因子的转移（接合）图10-8F因子的转移有三种方式：一是含有F+因子细菌向不含F+因子的F-细菌转移，即
6、F+F-；二是重组型Hfr细菌向F-细菌转移，即HfrF-；F细菌向F-细菌转移，即FF-。这三种方式的转移过程和特点如下：a、F+F-（a）F+细菌通过纤毛与F-细菌接触并发生相互作用。（b）F+细菌出现缺口，双链之一被切断，从断端转移F因子的一条链到F-细菌中。（c）F因子的一条链一进入F-细菌中，就在F-细菌中复制新的F因子。（d）复制完成后，F-细菌变成F+，同时原有F+细胞也完成F因子另一条链的复制，所以转移是F+的拷贝。所以最终是F-细菌变成F+细菌，而原有的F+细菌则不变。b、HfrF-特点是染色体按定向和均匀速度逐渐进入F-细菌，DNA转移是从oriT起始，F因子的主要部份在最
7、后进入受体。所以大部分F因子并没有进入受体，中途断开，最终F-细菌没有变成F+细菌。c、FF-主要作用是构建稳定的部分二倍体的菌，并能高效表达。F+、F和F+Hfr菌的比较Hfr和F+共同特点：a.用链霉素处理均不影响与受体杂交。b.与受体杂交后,出现的重组体中以大多数非选择性性状是F-受体的遗传性状。c.均带有F因子特定表型效应性伞毛。差异之处：a.HfrF-F+F-(高出1000倍)b.F+F-。最后是F-F+，但供体染色体基因非常低频率地转移。HfrF-。最后F-还是F-，但部分染色体高频转移。c.F菌除了有许多与Hfr和F+相同性质外,最大特点是构建部分二倍体菌。2.用中断杂交试验作染
8、色体连锁图设计人Jacob和wollman(50年代）根据HfrF-是染色体按定向和均匀逐渐进入F-细菌，大部分F因子并没有进入受体，中途断开的原理，设计中断杂交试验，目的证明接合时遗传物质从供体到受体的转移是直线进行的。中断杂交试验过程把Hfr菌株与F-菌株混合培养Hfr：strsa+b+c+d+F-：sfrra-b-c-d-其中str为链霉素，s感r抗性a+：叠氨化物抗性基因azira-：对azrs（敏感）b+：对T1噬菌体抗性tonArb-：对T1敏感（tonAs）c+：半乳糖（galb+）原养型c-：半乳糖缺陷型d+：乳糖（lac+）原养型d-：乳糖缺陷型培养一定时间取样，把菌液放在食
9、物搅拌器内搅拌，以中断杂交。稀释接种到含有链霉素培养基上，杀死Hfr。对形成菌进行影印培养测试其基因型，确定a、b、c、d每个基因转移到F-细胞时间。结果（图10-11）9min开始出现少量Na3N抗性，表明azir已进入F-；11min出现T1抗性，表明tonAr已进入；18min出现galb原养型，表明galb+已进入；24min出现lac原养型，表明lac+已进入。分析Hfr菌株基因是按一定的线性顺序依次进入F-的，也就是说，染色体从原点开始是以直线方式进入F-细胞的（图10-12），离原点愈近，进入愈早，反是则晚。图10-12根据中断杂交实验作出的大肠杆菌直线连锁图单位：分钟，O是原点
10、，F是F因子。不同Hfr菌株的进一步试验不同Hfr菌株试验作出基因连锁图，基因顺序不相同，见表10-1。表10-1用中断杂交法确定的几个Hfr菌株的基因顺序从表10-1可以看出，虽然不同，但有规律性，如所有的his基因都有gal在一边，gly在另一边，其他基因也是如此，除非它们连锁群的另一端。其差异是由于转移的原点不同和方向不同所致（图10-13）。进一步说明F因子和细菌染色体都是环状的。Hfr细胞染色体的形成，则因F因子插入环状染色体的不同位置，因而形成了不同的转移原点和转移方向。3.大肠杆菌的环状染色体图如果2个基因间的转移时间2min的间杂交不可靠，应采用传统的重组作图法。杂交Hfrla
11、c+ade+F-lac-ade-lac+乳糖不发酵ade-胸嘌呤缺陷型用完全培养基但不加膘嘌呤，可选出F-ade+的菌落由于lac+ade-近，两者相继进入时间相距很短，难以准确界定，所以只能根据产物确定。如果选出ade+同时也选出lac+，说明lac-ade间没有发生过交换；如果是lac-说明发生交换（图10-14）重组率=lac-ade+/(lac+ade+)+(lac-ade+)100%=22%两个位点是的时间单位约为1min，可见1个时间单位（分钟）大约相当于20%的重组值。用重组率与中断杂交法测的基因距离大致符合的，根据接合的实验，用中断杂交法基因重组等方法已绘制出大肠杆菌K12环状遗传图（图10-17）。-