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1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。siRNA-对肿瘤抑制蛋白基因P53的siRNA设计-摘要3前言3一、siRNA作用机制3二、siRNA设计原理与规则31、siRNA反义链5末端碱基设计、siRNA正义链设计、G/C比例32、siRNA目的位置二级结构预测提高siRNA效率43、内部重复序列4三、对P53的siRNA设计过程41、设计大致步骤42、在GenBank数据库获取P53序列43、两种软件上的设计5参考文献8摘要：siRNA干扰技术作为一种新型的基因沉默技术，因其具有高校、高特异性、低毒性等优点，应用siRNA干扰技术开发新型
2、的靶向药物，已成为药物研究领域中重点发展方向之一。因此，了解siRNA干扰技术对未来药物领域学习有至关重要的作用。本文是利用NCBI的基因库(GeneBank)及两种计算机辅助设计软件对肿瘤抑制蛋白基因P53进行siRNA设计，并对方法和结果进行分析比对。前言：RNA干扰(RNAi)是由双链RNA介导的、在转录后mRNA水平关闭相应基因表达的过程。其中siRNA是RNAi发挥效应所必需的因子，因此掌握siRNA实验和设计方法非常重要。关于设计siRNA目前尚无可靠的规律，不过，不少实验室和科研机构都开发了相应的siRNA设计软件。设计siRNA设计是一个需要由软件完成的工作，接下来，我将用这两
3、种软件对肿瘤抑制蛋白基因P53进行siRNA设计，并进行分析。一、siRNA作用机制小干扰RNA作为与RNA干扰现象紧密相连的非编码RNA之一，是后基因组时代的重要研究工具。其作用机制首先是进入体内的siRNA双链解开，引导链（指siRNA反义链）进入RNA介导的沉默复合体（RISC），并切断具有序列特异性的mRNA，切断部位大约在与反义链配对序列的中部，然后靶mRNA进一步降解。二、siRNA设计原理与规则RNAi作用的成功与否，关键在于siRNA序列的结构。不同的siRNA序列沉默基因的效率差别很大。因此，理性设计有效siRNA就成为试验成功的一个关键因素。借助生物信息学手段以选择最佳si
4、RNA，可使用一些筛选模型优化寡核苷酸序列性质，诸如G/C比例，碱基变化以及序列中重复碱基数目。1、siRNA反义链5末端碱基设计、siRNA正义链设计、G/C比例目前,siRNA的设计有两种方法一种以有效序列为依据并应用统计学计算获得的设计规律。ReynoldsA等针对2个基因合成了180条siRNA,，通过测定其沉默效率，总结出理性设计有效siRNA的8条原则:：1）GC含量在30%55%之间；2）有义链1519位至少有3个A或U；3）避免出现倒置重复，会形成发卡；4)有义链19位为A；5）有义链3位为A；6）有义链10位为U；7）有义链19位非G或C；8）有义链13位非G。该原则已经被普
5、遍应用于siRNA的序列设计。另一种方法是以siRNA序列上的能量为依据，筛选可能的有效序列ChalkAM等通过收集文献发表的针对92个基因的有效的siRNA398条，应用氢键的能量分布规律进行分析，提出:1）总的siRNA双链能量1；2）反义链5端的结合能小于9；3）有义链5端结合能在59之间；4）GC含量在3653%之间；5）中间（712）的结合能小于13；6）反义链5端与正义链5端的能量差小于0；7）反义链5端与正义链5端的能量差最好在10之间。2、siRNA目的位置二级结构预测提高siRNA效率siRNA双链末端不同热力学稳定性，提示哪条链会进入RISC中。双链末端稳定性对于沉默效果预
6、测影响占60，二级结构预测可改善siRNA位点预测效率，80的非作用位点可以通过二级结构预测来排除。3、内部重复序列因包含内部重复序列或回文序列的siRNA可能形成潜在内部发卡结构或折叠结构，降低了siRNA有效浓度及沉默效力，故siRNA设计时应避免内部重复序列。三、对P53的siRNA设计过程1、设计大致步骤首先，从靶cDNA启动密码子下游50100bp处开始选择siRNA作用位点。5和37非编码区和启始密码子附近区域应尽量避兜一固为这些区域或是编码调节蛋白结合位点、非编码区结合蛋白或翻译启始复合物的区域它们可能对RISC复合物的形成造成干扰，而削弱RNAi的作用。找出启始密码子下游的AA
7、，将连同其后(N19)TT记录下来，即AA(N19)TT，计算这23hp中G和C碱基含量，最好在50左右(3055%之间)。假若碱基序列和G、C台量达不到上进要求，也可找AA牙头的21bp，即AA(N21)寡核苷酸。正义链siRNA序列相应就成为(N19)rIr或N21。对于后一种情况，在正义链sirNA序列的3末端加上TT，目的在于确保双链的对称性，使合成出的dsRNA正义、反义链具有3端突出；最后在NCBl和EST数据库查找并确定所设计的靶基曰是唯一的。2、在GenBank数据库获取P53序列cgtgctttccacgacggtgacacgcttccctggattggccagactgcct
8、tccgggtcactgccatggaggagccgcagtcagatcctagcgtcgagccccctctgagtcaggaaacattttcagacctatggaaactacttcctgaaaacaacgttctgtcccccttgccgtcccaagcaatggatgatttgatgctgtccccggacgatattgaacaatggttcactgaagacccaggtccagatgaagctcccagaatgccagaggctgctccccgcgtggcccctgcaccagcagctcctacaccggcggcccctgcaccagccccctcctggcccctgtcatctt
9、ctgtcccttcccagaaaacctaccagggcagctacggtttccgtctgggcttcttgcattctgggacagccaagtctgtgacttgcacgtactcccctgccctcaacaagatgttttgccaactggccaagacctgccctgtgcagctgtgggttgattccacacccccgcccggcacccgcgtccgcgccatggccatctacaagcagtcacagcacatgacggaggttgtgaggcgctgcccccaccatgagcgctgctcagatagcgatggtctggcccctcctcagcatcttatcc
10、gagtggaaggaaatttgcgtgtggagtatttggatgacagaaacacttttcgacatagtgtggtggtgccctatgagccgcctgaggttggctctgactgtaccaccatccactacaactacatgtgtaacagttcctgcatgggcggcatgaaccggaggcccatcctcaccatcatcacactggaagactccagtggtaatctactgggacggaacagctttgaggtgcatgtttgtgcctgtcctgggagagaccggcgcacagaggaagagaatctccgcaagaaaggggagcctc
11、accacgagctgcccccagggagcactaagcgagcactgtccaacaacaccagctcctctccccagccaaagaagaaaccactggatggagaatatttcacccttcagatccgtgggcgtgagcgcttcgagatgttccgagagctgaatgaggccttggaactcaaggatgcccaggctgggaaggagccaggggggagcagggctcactccagccacctgaagtccaaaaagggtcagtctacctcccgccataaaaaactcatgttcaagacagaagggcctgactcagactgacatt
12、ctccacttcttgttccccactgacagcctcccacccccatctctccctcccctgccattttgggttttgggtctttgaacccttgcttgcaataggtgtgcgtcagaagcacccaggacttccatttgctttgtcccggggctccactgaacaagttggcctgcactggtgttttgttgtggggaggaggatggggagtaggacataccagcttagattttaaggtttttactgtgagggatgtttgggagatgtaagaaatgttcttgcagttaagggttagtttacaatcagccacat
13、tctaggtaggggcccacttcaccgtactaaccagggaagctgtccctcactgttgaattttctctaacttcaaggcccatatctgtgaaatgctggcatttgcacctacctcacagagtgcattgtgagggttaatgaaataatgtacatctggccttgaaaccaccttttattacatggggtctagaacttgacccccttgagggtgcttgttccctctccctgttggtcggtgggttggtagtttctacagttgggcagctggttaggtagagggagttgtcaagtctctgctggccc
14、agccaaaccctgtctgacaacctcttggtgaaccttagtacctaaaaggaaatctcaccccatcccacaccctggaggatttcatctcttgtatatgatgatctggatccaccaagacttgttttatgctcagggtcaatttcttttttctttttttttttttttttctttttctttgagactgggtctcgctttgttgcccaggctggagtggagtggcgtgatcttggcttactgcagcctttgcctccccggctcgagcagtcctgcctcagcctccggagtagctgggaccacagg
15、ttcatgccaccatggccagccaacttttgcatgttttgtagagatggggtctcacagtgttgcccaggctggtctcaaactcctgggctcaggcgatccacctgtctcagcctcccagagtgctgggattacaattgtgagccaccacgtccagctggaagggtcaacatcttttacattctgcaagcacatctgcattttcaccccacccttcccctccttctccctttttatatcccatttttatatcgatctcttattttacaataaaactttgctgccaaaaaaaaaaaaaaaaaa
16、aa3、两种软件上的设计（1）金斯瑞GenScript(图片1，以上图片为在金斯瑞软件中选择目标参数的图片)siRNAcandidatetargetsafterHomologyfiltering:窗体顶端No.SequenceStartGC%ScoresE/ThermodynamicSNPsOff-targetPos-Motifs1.AAGCGAGCACTGTCCAACAAC97852.3820.003.73/-37.60NA0/4602.AAGAGAATCTCCGCAAGAAAG92242.8619.173.17/-33.40NA0/4603.AATGCTGGCATTTGCACCTAC164
17、047.626.922.87/-36.20NA0/4604.AATTTGCGTGTGGAGTATTTG66338.10-1.022.82/-30.70NA0/460（表格1，以上表格为通过金斯瑞GenScript设计的siRNA）GenScript会根据我们的要求找到siRNA靶位点，得到候选序列。候选序列通过BLAST/SmithWaterman将被过滤，以除去非唯一的序列与一个唯一的和全面的EST/mRNA的集合。siRNA的候选人的排名是基于使用E参数的一种特有算法。在筛选的条件中包括GC的范围、双链、研究物种、研究器官、目标基因序列的大小、序列的排序等，细致的筛选条件有利于我们精确的筛
18、选出目的siRNA，本软件一个很好的地方还包括可以自动利用blast软件对选择的靶序列比对进行同源性分析，排除siRNA非特异性抑制其它基因的可能性，对我们这些基础操作者极其便利。另外，得出的结果中包括基因序列、siRNA在源基因中的起始位置、GC比例、分数、热力学等，这些可以让我们优先选取适合的siRNA。siRNAatWHITEHEAD（图片2，以上图片为在siRNAatWHITEHEAD软件中选择目标参数的图片）（图片3，图片3为为通过siRNAatWHITEHEAD软件设计的siRNA）siRNAatWHITEHEAD软件包括的设置参数有基因序列、siRNA模式、GC比例、排除一行中更
19、多的A、T、排除一行中更多的G、siRNA的碱基等，本软件需要手动利用blast软件对选择的靶序列比对进行同源性分析，排除siRNA非特异性抑制其它基因的可能性，siRNA的模式有三种，分别是A=AAN19TT；B=NAN19NN；C=N2CGN8AUN8AUN2；得出的siRNA模式列于表格中，用这种软件得出的结果内容包括siRNA序列在源基因序列中的整体位置，siRNA两条链的序列以及mRNA序列，热力学范围。相对于金斯瑞软件，本软件的一个优点是siRNA序列罗列的更加清楚，有利于我们研究更快速地开展。缺点是并没有直接利用blast软件对选择的靶序列比对进行同源性分析，但是，结果并没有收到
20、影响，网站很方便地提供了blast软件。结果分析：两种软件得到的结果不一样，是由于在使用软件时设置的参数不一致所致，不同的筛选条件会得出不一样的实验结果。金斯瑞GenScript软件各个影响因素误差更加小，保留到了第2个小数点，然后有针对性的对几个影响因素（GC比例、热力学）总结分析，将每个siRNA通过分数的升降序进行排列。而就siRNAatWHITEHEAD软件设置的参数更加细致，得出的结果也会更加明晰，但是，分析的结果误差会更大。总之，两种软件各有各的优点，可依据自己喜好选择。参考文献：1、 方翔，曹以诚，杜正平，郭旭，卓敏siRNA理性设计原理分析期刊论文生命的化学2007，27（4）
21、2、 樊鹏程，贾正平，马骏，王荣siRNA设计研究进展及在线设计期刊论文细胞与分子免疫学杂志2008，24（2）3、 许德晖，黄辰，刘利英，宋土生高效siRNA设计的研究进展期刊论文遗传2006,28(11)4、 赵俊峰RNAi抑制G250基因以及对肾癌786-0细胞生物学特性影响的实验研究博士论文南方医科大学200804215、 张鹏辉，涂植光，杨明清siRNA的设计、合成与转染及其在RNA干扰中的应用期刊论文国外医学(临床生物化学与检验学分册)2003，24（4）6、 蒋建伟，史金桃，吴智慧，曾慧兰，严玉霞，陈涛，丁文婷增殖细胞核抗原siRNA序列的设计、合成与筛选期刊论文中国病理生理杂志2008，24（3）7、 白莉，杨忠亮，李荣田用于RNA干涉的siRNA的设计与合成期刊论文黑龙江科技信息2008（6）