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1、大肠埃希氏菌药典法生化大肠埃希氏菌药典法生化(shn hu)检检查查潘庆玲第一页，共二十七页。大肠大肠(dchng)埃希菌检查埃希菌检查l大肠埃希菌（Escherichiacoil）即大肠杆菌，为肠杆菌科埃希菌属的模式种。大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外。在药品中检出大肠埃希菌，表明该样品受到人和温血动物粪便的污染，即可能是污染肠道病原体。大肠埃希菌除普通大肠埃希菌外，还有致病性大肠埃希菌，可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。为了(wile)保证人体健康，口服给药制剂必须检查大肠埃希菌。第二页，共二十七页。标准标准(biozhn)l中国药典（2010年版）二部l口服给药制剂l细
2、菌(xjn)总数每1ml不得过100cful霉菌和酵母菌总数每1ml不得过100cful大肠埃希菌总数不得检出第三页，共二十七页。备料备料(bi lio)单（增菌培养）单（增菌培养）序号序号品名品名规格规格数量数量备注备注1锥形瓶锥形瓶250ml42刻度吸管刻度吸管10ml23刻度吸管刻度吸管1ml14烧杯烧杯250ml15量筒量筒100ml16胆盐乳糖培养基胆盐乳糖培养基100ml3装锥形瓶装锥形瓶7pH7.0无菌氯化无菌氯化钠钠-蛋白胨缓冲液蛋白胨缓冲液150ml1装锥形瓶装锥形瓶灭菌灭菌(mi jn)参数：参数：121、20min第四页，共二十七页。操作过程操作过程样品10ml90ml供
3、试液稀释液阴样阳10ml10ml10ml菌悬液1mlBL培养基BL培养基BL培养基培养温度(wnd)：36培养时间：1824h（必要时可延长至48h）第五页，共二十七页。备料备料(bi lio)单（快速生化试验）单（快速生化试验）序号序号品名品名规格规格数量数量备注备注1刻度吸管刻度吸管1ml32试管试管中中43MUG培养培养基基5ml4分装到试分装到试管中管中4靛基质靛基质灭菌灭菌(mi jn)参数：参数：115、20min第六页，共二十七页。操作过程操作过程阴样阳阴样阳本底靛基质试验紫外荧光0.2ml0.2ml0.2ml培养温度(wnd)：361培养时间：1824h第七页，共二十七页。备料
4、备料(bi lio)单（分离培养）单（分离培养）序号序号品名品名规格规格数量数量备注备注1EMB或麦或麦康凯琼脂康凯琼脂培养基培养基60ml1置皿置皿2平皿平皿3灭菌灭菌(mi jn)参数：参数：121、15min第八页，共二十七页。操作过程操作过程阴样阳EMB或麦康凯琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基接种环（四区划线法）接种环（四区划线法）培养温度(wnd)：361培养时间：1824h第九页，共二十七页。生化生化(shn hu)试验中试验中MUG在紫外等下在紫外等下显荧光的原理显荧光的原理l大肠埃希氏菌是指能产生-半乳糖苷酶分解(fnji)ONPG使培养液呈黄色，能产生-葡萄糖醛酸酶分解(fnji
5、)MUG使培养液在波长366nm紫外光下产生荧光的细菌。第十页，共二十七页。BL培养基培养基l配方(pifng)（每升）：l胨20.0g提供碳氮源l乳糖5.0g可发酵的糖类l氯化钠5.0g维持均衡的渗透压l磷酸氢二钾4.0g缓冲剂l磷酸二氢钾1.3gl去氧胆酸钠/牛胆盐0.5g/2.0g选择性抑菌剂第十一页，共二十七页。使用使用(shyng)方法方法l1、称取本品35.8g，加入蒸馏水或去离子水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶，每瓶100mL，121灭菌20min，待冷至常温后，备用。2、样品的处理。略。3、取胆盐乳糖增菌液3份，2份分别加入规定量的供试液，其中一份加入对照菌50100
6、个作阳性对照，第三份加入与供试液等量的稀释液作阴性对照。4、将三角瓶放入3035恒温培养箱内培养1824h。必要时可延长至48h。5、观察结果。阳性对照应生长(shngzhng)良好，阴性对照应无菌生长(shngzhng)。l质量控制：本品质控菌株接种后，于361培养1824h，培养结果肉汤呈混浊。第十二页，共二十七页。MUG培养基培养基l配方（每升）：l胰蛋白胨20.0g提供碳氮源l3号胆盐1.5g抑制革兰氏阳性菌l乳糖(rtn)5.0g可发酵的糖类l磷酸氢二钾4.0g缓冲剂l磷酸二氢钾1.5gl氯化钠5.0g维持均衡的渗透压lMUG0.05g第十三页，共二十七页。使用使用(shyng)方法
7、方法l1、称取本品37.05g，加入蒸馏水或去离子水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装于带有小倒管的试管中，115高压灭菌20min，待冷至常温，备用。2、将总大肠菌群多管发酵法初发酵产酸或产气的管进行大肠埃希氏菌检测。用烧灼灭菌的金属接种环或无菌棉签将上述试管中液体接种到EC-MUG肉汤管中。3、将已接种的EC-MUG管在培养箱或恒温水浴中44.50.5培养24h2h。如使用恒温水浴，在接种30min内进行培养，水浴箱的液面应高于EC-MUG肉汤液面。4、观察(gunch)结果：将培养基管置366nm紫外灯下约5cm处，以未接种培养物的EC-MUG培养基作空白对照，观察(gunch)有无蓝白
8、色荧光。空白对照管应无蓝白色荧光，试验管出现蓝白色荧光为阳性反应。l质量控制：大肠埃希菌菌株接种后于361培养1824h，结果产气，紫外灯下显荧光。第十四页，共二十七页。EMB琼脂琼脂(qingzh)培养基培养基l配方（每升）：l胨10.0g提供氮源、维生素、氨l牛肉浸出(jnch)粉3.0g基酸和碳源l氯化钠5.0g维持均衡的渗透压l乳糖10.0g可发酵的糖类l琼脂14.0g培养基凝固剂l曙红钠0.4g抑菌剂（革兰氏阳性菌）l亚甲蓝0.065gpH指示剂l在酸性条件下产生沉淀，形成紫黑色菌落或具黑色中心的外围无色透明的菌落。第十五页，共二十七页。使用使用(shyng)方法方法l1、称取本品4
9、2.5g，加入蒸馏水或去离子水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶，121高压灭菌15min。2、待培养基冷至50左右，以无菌手续，倾注灭菌平皿，待凝固后，备用。3、将供试液划线接种于平板上。4、将平板翻转，放入恒温培养箱中，3035培养1824h。5、观察结果。l质量(zhling)控制：本培养基倾注平皿待冷却后呈紫色，可有细微沉淀。大肠埃希菌菌株接种后。361培养1824h，培养结果呈黑心，有绿色金属光泽。第十六页，共二十七页。麦康凯琼脂麦康凯琼脂(qingzh)培养基培养基l配方（每升）l胨20.0g碳氮源、维生素和生长因子l牛胆盐5.0g抑制革兰氏阳性菌的生长l氯化钠5.0g维持均
10、衡的渗透压l琼脂14.0g培养基的凝固剂l乳糖10.0g可发酵的糖类l中性红0.03gpH指示剂l细菌(xjn)发酵乳糖产酸时菌落呈粉红色并在菌落周围出现胆盐沉淀的浑浊圈。第十七页，共二十七页。使用使用(shyng)方法方法l1、称取本品54.0g，加入蒸馏水或去离子水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶，121高压灭菌15min。2、待培养基冷至5055倾注灭菌平皿，待凝固后，备用。3、取待检样品划线接种于麦康凯平板。4、将平板置培养箱于3035培养1824h。5、观察结果。在做致泻大肠埃希氏菌检验时，观察结果不但要注意乳糖发酵的菌落，同时也要注意不发酵和迟缓(chhun)发酵的菌落。l
11、质量控制：大肠埃希菌菌株经361培养1824h菌落特征呈粉红或红，周围有混浊胆盐沉淀圈。第十八页，共二十七页。IMViCl用来测定(cdng)菌的生理生化特征的4个实验.lI:吲哚试验lM:甲基红试验lV:V.P试验lC:柠檬酸实验li是为个好读加上去的第十九页，共二十七页。吲哚吲哚(yn du)（indole）实验）实验l原理：有些细菌如大肠埃希菌、变形杆菌、霍乱弧菌等能分解原理：有些细菌如大肠埃希菌、变形杆菌、霍乱弧菌等能分解(fnji)培养基中的色氨酸生成吲哚（靛基质），经与试剂中的培养基中的色氨酸生成吲哚（靛基质），经与试剂中的对二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈红色，是为吲哚对二
12、甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈红色，是为吲哚试验阳性。试验阳性。l试验菌用蛋白胨水培养基试验菌用蛋白胨水培养基37培养培养24小时小时.l在培养液中加入乙醚在培养液中加入乙醚1ml(使呈明显的乙醚层使呈明显的乙醚层)充分振荡充分振荡,使使吲哚试剂溶于乙醚吲哚试剂溶于乙醚.静置片刻静置片刻,待乙醚浮于培养液上面时沿管待乙醚浮于培养液上面时沿管壁慢慢加入吲哚试剂壁慢慢加入吲哚试剂10滴滴.呈玫瑰红的为阳性呈玫瑰红的为阳性,不变色的为阴不变色的为阴.l(注注:加入吲哚试剂后加入吲哚试剂后,不可再摇动不可再摇动,否则红色不明显否则红色不明显)第二十页，共二十七页。甲基红试验甲基红试验(shyn)
13、lM:甲基红试验为肠道细菌的甲基红试验为肠道细菌的IMViC四类测试中四类测试中的的M，甲基红为一种，甲基红为一种(y zhn)酸性指示剂，根据酸性指示剂，根据肠道细菌的糖代谢途径的不同，最终产生酸性肠道细菌的糖代谢途径的不同，最终产生酸性产物不一，产物不一，PH值有所差异，导致甲基红显示值有所差异，导致甲基红显示出不同的颜色，从而用于鉴别肠道细菌。呈现出不同的颜色，从而用于鉴别肠道细菌。呈现红色为阳性；橘红色为弱阳性；黄色为阴性。红色为阳性；橘红色为弱阳性；黄色为阴性。l试验菌用葡萄糖蛋白胨培养基试验菌用葡萄糖蛋白胨培养基37培养培养24小小时时.l沿管壁加入沿管壁加入M.R.(甲基红甲基红
14、)试剂试剂3-4滴滴.红的为红的为阳性阳性,黄的为阴性黄的为阴性.第二十一页，共二十七页。甲基红试验甲基红试验(shyn)l原理原理:某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可进一步分解，产生甲酸、产生丙酮酸，丙酮酸可进一步分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的乙酸、乳酸等，使培养基的pH降至降至4.5以下，以下，当加入甲基红试剂则呈红色，为甲基红试验当加入甲基红试剂则呈红色，为甲基红试验(shyn)阳性。若细菌分解葡萄糖产酸量少，或产阳性。若细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质（如醇、酮、醚、生的酸进一步转化为其他物质（如醇、
15、酮、醚、气体和水等），则培养基的酸度仍在气体和水等），则培养基的酸度仍在pH6.2以以上，故加入甲基红指示剂呈黄色，是为阴性。上，故加入甲基红指示剂呈黄色，是为阴性。第二十二页，共二十七页。V.P试验试验(shyn)（乙酰甲基甲醇试验（乙酰甲基甲醇试验(shyn)）l某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养液中能分解葡某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养液中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境基甲醇，后者在强碱环境(hunjng)下，被空气中下，被空气中氧，氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基氧，氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色
16、化合物，称生成红色化合物，称VP（+）反应。）反应。l试验菌用葡萄糖蛋白胨培养基试验菌用葡萄糖蛋白胨培养基37培养培养24小小时时.l加入加入40%KOH 10-20滴滴,再加入等量再加入等量-茶酚茶酚,用力振荡用力振荡(拔去棉塞拔去棉塞)再放入再放入374h后再观察后再观察,仍无色产生为阴仍无色产生为阴.第二十三页，共二十七页。柠檬酸实验柠檬酸实验(shyn)l柠檬酸盐培养基系一综合性培养基，其中柠檬酸钠为碳的唯柠檬酸盐培养基系一综合性培养基，其中柠檬酸钠为碳的唯一来源。而磷酸二氢铵是氮的唯一来源。有的细菌如产气杆一来源。而磷酸二氢铵是氮的唯一来源。有的细菌如产气杆菌，能利用柠檬酸钠为碳源，
17、因此能在柠檬酸盐培养基上生菌，能利用柠檬酸钠为碳源，因此能在柠檬酸盐培养基上生长，并分解柠檬酸盐后产生碳酸盐，使培养基变为碱性。此长，并分解柠檬酸盐后产生碳酸盐，使培养基变为碱性。此时培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝色。不能时培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝色。不能利用柠檬酸盐为碳源的细菌，在该培养基上不生长，培养基利用柠檬酸盐为碳源的细菌，在该培养基上不生长，培养基不变色。不变色。l将试验菌培养在柠檬酸盐培养基斜面上将试验菌培养在柠檬酸盐培养基斜面上37培养培养24-28小时小时.l观察有无细菌生长与培养基颜色变化观察有无细菌生长与培养基颜色变化.如果如果(rgu)含有溴
18、麝香含有溴麝香草酚蓝的斜面蓝色者为阳性反应草酚蓝的斜面蓝色者为阳性反应,呈绿色的为阴性反应呈绿色的为阴性反应;含苯酚含苯酚红的斜面如果红的斜面如果(rgu)呈红色为阳性反应呈红色为阳性反应,呈黄色为阴性反应呈黄色为阴性反应.第二十四页，共二十七页。IMViC的作用的作用(zuyng)l这这4个试验主要是用来快速鉴别大肠杆菌和产个试验主要是用来快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌，多用于水的细菌检查。大肠杆菌虽气肠杆菌，多用于水的细菌检查。大肠杆菌虽非致病菌，但在饮用水中如超过一定数量，则非致病菌，但在饮用水中如超过一定数量，则表示水质受粪便污染表示水质受粪便污染(wrn)。产气肠杆菌也广泛。产气肠杆菌
19、也广泛存在于自然界中，因此检查水时，要将两者分存在于自然界中，因此检查水时，要将两者分开。开。第二十五页，共二十七页。谢谢谢谢(xi xie)！第二十六页，共二十七页。内容(nirng)总结大肠埃希氏菌药典法生化检查。阳性对照应生长良好，阴性对照应无菌生长。用烧灼灭菌的金属(jnsh)接种环或无菌棉签将上述试管中液体接种到EC-MUG肉汤管中。3、将已接种的EC-MUG管在培养箱或恒温水浴中44.50.5培养24h2h。空白对照管应无蓝白色荧光，试验管出现蓝白色荧光为阳性反应。细菌发酵乳糖产酸时菌落呈粉红色并在菌落周围出现胆盐沉淀的浑浊圈。4、将平板置培养箱于3035培养1824h。V:V.P试验第二十七页，共二十七页。