《石墨烯量子点类酶活力测定紫外-可见分光光度法(T-CSTM 00198—2021).pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《石墨烯量子点类酶活力测定紫外-可见分光光度法(T-CSTM 00198—2021).pdf（16页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、 ICS 17.180 CCS C 04 团 体 标 准 T/CSTM 00198-2021 石墨烯量子点 类酶活力测定 紫外/可见分光光度法 Graphene quantum dotsDetermination of enzyme-like activities Ultraviolet-visible spectrophotometry 2021-08-04 发布 2021-11-04 实施 中关村材料试验技术联盟 发布 T/CSTM 00198-2021 I 目 录 前 言.II 引 言.III 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 测量原理.2 5 仪器.3 6
2、试剂和设备.3 7 试样前处理.3 8 测量条件和步骤.4 9 数据处理和计算.4 10 不确定度来源分析.5 11 检测报告.5 附录 A（资料性）DAP 标准曲线的测量.6 附录 B（资料性）石墨烯量子点类过氧化物酶活力测定实例.8 附录 C（资料性）石墨烯量子点类酶活力测试报告格式.10 附录 D（资料性）起草单位和主要起草人.11 参考文献.12 T/CSTM 00198-2021 II 前 言 本文件参照GB/T 1.12020 标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国材
3、料与试验团体标准委员会基础与共性技术领域委员会（CSTM/FC00）提出。本文件由中国材料与试验团体标准委员会基础与共性技术领域委员会（CSTM/FC00）归口。T/CSTM 00198-2021 III 引 言 石墨烯量子点是指直径小于100 nm的石墨烯片层，具有光稳定性高、尺寸小、生物相容性好、发光可调和类酶催化活力等诸多优点，在荧光生物成像和生化检测方面潜力巨大，是目前碳基纳米生物材料的研究热点。特别是其优异的（光）热增强的类酶活力在生化检测方面具有巨大应用前景。石墨烯量子点具有pH依赖的类过氧化物酶、氧化酶和过氧化氢酶活力。在酸性条件下，石墨烯量子点能催化双氧水氧化过氧化物酶（如辣根
4、过氧化物酶）的常见底物（邻苯二胺OPD，3,3,5,5-四甲基联苯胺TMB，2,2二氮-双（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）铵盐ABTS）发生颜色变化，表现出类过氧化物酶活力。在中性和碱性条件下，则能催化氧化双氧水发生歧化反应，产生氧气和水，表现出类过氧化氢酶活力。石墨烯量子点具有多种类酶活力，为规范其类酶活力的表征，本文件规定了石墨烯量子点类酶活力的检测方法。T/CSTM 00198-2021 1 石墨烯量子点 类酶活力测定 紫外/可见分光光度法 1 范围 本文件规定了紫外/可见分光光度法测定石墨烯量子点类酶活力的术语和定义、测量原理、仪器、试剂和设备、样品的前处理、测量条件和步骤、数据处理和计
5、算、不确定度来源分析和检测报告。本文件适用于紫外/可见分光光度法表征石墨烯量子点的类酶活力，底物为邻苯二胺，底物浓度为9.74 mmolL-1。其他纳米颗粒类酶活力的表征亦可参照执行。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 19267.2 刑事技术微量物证的理化检验 第2部分：紫外-可见吸收光谱法 GB/T 30554.3 纳米科技 术语 第3部分：碳纳米物体 GB/T 30544.13-2018 纳米科技 术语 第13部
6、分：石墨烯及相关二维材料 3 术语和定义 GB/T 19267.2、GB/T 30554.3和GB/T 30544.13-2018界定的及下列术语和定义适用于本文件。3.1 石墨烯 graphene 石墨烯层 graphene layer 单层石墨烯 single-layer graphene；monolayer graphene 由一个碳原子与周围三个近邻碳原子结合形成蜂窝状结构的碳原子单层。注1：它是许多碳纳米物体的重要构建单元。注2：由于石墨烯仅有一层，因此通常被称为单层石墨烯。石墨烯缩写为1LG，以便区别于缩写为2LG的双层石墨烯和缩写为FLG的少层石墨烯。注3：石墨烯有边界，而且在碳
7、-碳键遭到破坏的地方有缺陷和晶面。来源：GB/T 30544.13-2018，定义3.1.2.1 3.2 少层石墨烯 few-layer graphene；FLG 由三到十个完美的石墨烯层堆垛构成的二维材料。来源：GB/T 30544.13-2018，定义3.1.2.10 T/CSTM 00198-2021 2 3.3 石墨烯量子点 graphene quantum dots 在常温下具有量子尺寸效应的少层石墨烯。3.4 类酶活力 enzyme-like activity 类酶材料催化特定化学反应的能力。注：类酶活力的大小可用在一定条件下，类酶催化某一化学反应的速度来表示，类酶催化反应速度愈大
8、，类酶活力愈高，反之活力愈低。3.5 类酶活力单位 enzyme-like activity unit 特定条件下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量，单位为U。3.6 底物 substrate 参与酶催化反应的物质。注：可为化学元素、分子或化合物。4 测量原理 石墨烯量子点能催化双氧水氧化色原底物邻苯二胺（OPD）发生反应，生成橘黄色产物2,3-二氨基吩嗪（DAP）。反应方程如公式（1）：222 OPD+H ODAP+H O石墨烯量子点.（1）产物DAP的特征峰在吸收光谱350 nm800 nm，最大吸收处为420 nm。通过测试最大吸收处的吸光度变化
9、，可计算获得反应速率。石墨烯量子点类酶催化反应中，当底物浓度非常大时,反应相对于底物为零级反应，反应速率接近于一个恒定值。石墨烯量子点类酶活力的计算如公式（2）：VAlt.（2）式中：石墨烯量子点类酶活力，在1 min内转化1 mol底物的酶量，单位为酶活力单位（U）；V样品溶液的总体积，单位为升（L）；底物氧化产物在测量波长处的摩尔吸收系数，单位升每摩尔米（L mol-1 m-1）；l样品池的光程，单位为米（m）；A特征峰在最大吸收处（420 nm）的吸光度；t反应进行的时间，单位为分钟（min）；A/t单位时间底物氧化产物在测量波长处吸光度的变化，单位为每分钟（min-1）。T/CSTM
10、00198-2021 3 5 仪器 校准、检定或校正的紫外/可见吸收光谱仪。仪器应具有“动力学模式”，波长范围在 350 nm800 nm，吸光度最大允许误差0.005，波长最大允许误差2 nm。6 试剂和设备 6.1 试剂 试剂包括石墨烯量子点水分散液、超纯水、OPD、参考样品 DAP 和双氧水（30 wt%）。石墨烯量子点水分散液应为稳定无沉降的液体。所有试剂的纯度应至少为分析纯，超纯水电阻率应达到 18 Mcm（25）。6.2 设备 6.2.1 概述 设备包括样品池、温度计、天平、可调移液器、容量瓶和计时器。6.2.2 样品池 光程为（10.000.05）mm的比色皿。6.2.3 温度计
11、 用于测量环境的温度，最大允许误差1，实际分度值0.1。6.2.4 天平 用于称量试剂的质量，实际分度值0.1 mg，重复性（砝码检验）0.1 mg（100 g）。6.2.5 可调移液器 100 L、200 L、1 mL和5 mL可调移液器，最大允许误差1.5%，重复性0.3%。6.2.6 容量瓶 10 mL、50 mL和250 mL的容量瓶，最大允许误差0.2%。6.2.7 计时器 最大允许误差0.5%，实际分度值0.01 s。7 试样前处理 7.1 0.1 molL-1 OPD溶液的配置 称量OPD 0.108 g，溶解于8 mL水中，转移至10 mL容量瓶中，加水至容量瓶刻度。配置的OP
12、D溶液应放置于0 4 冰水混合物中保存，并在12 h内使用。7.2 l molL-1双氧水溶液的配置 用移液器移取102 L双氧水加入到装有约8 mL超纯水的10 mL容量瓶中，加水至容量瓶刻度。配置的双氧水溶液应避光保存。T/CSTM 00198-2021 4 8 测量条件和步骤 8.1 DAP标准曲线的测量 DAP标准曲线的测量参见附录A。8.2 测量条件 8.2.1 紫外/可见吸收光谱仪参数设定 设置紫外/可见吸收光谱仪的扫描波长范围（推荐350 nm800 nm）、扫描步长（推荐2 nm4 nm）、扫描时间间隔（推荐1 min4 min）、扫描总时间（推荐小于1 h）和扫描速度（推荐小
13、于600 nmmin-1）等参数。8.2.2 反应条件 将环境温度设定为（251），并将第6章中的设备和试剂放置于此温度条件下至少半小时。8.3 测量步骤 8.3.1 自动校零 按仪器说明书自动校零。8.3.2 空白测试 在样品池中依次加入2740 L超纯水、40 L 1 molL-1双氧水溶液（7.2）和300 L 0.1 molL-1 OPD溶液（7.1），样品的总体积V为3.08 mL。混匀后置于样品光路中，按8.1.1条件测试样品池的紫外/可见吸收光谱，获得不同扫描时间OPD自氧化的吸收光谱图。记录第i次测量的时间ti和特征吸收峰最大吸收处的吸光度Ai。8.3.3 样品测试 若需要加入
14、石墨烯量子点分散液的体积为V1，则计算加入超纯水的体积V2为2740 L-V1。在样品池中依次加入V2体积的超纯水、40 L 1 molL-1双氧水溶液（7.2）、300 L 0.1 molL-1 OPD溶液（7.1）和V1体积的石墨烯量子点分散液，样品的总体积V为3.08 mL。混匀后置于样品光路中，按8.1.1条件测试样品池的紫外/可见吸收光谱，获得不同扫描时间酶催化底物OPD的吸收光谱图。记录第i次测量的时间ti和特征吸收峰最大吸收处的吸光度Ai。注：测量样品中石墨烯量子点的浓度推荐为0.25 gL-12.5 gL-1。8.3.4 重复性测试和数据保存 重复8.3.2和8.3.3至少3次
15、，将仪器所测谱图或图像保存，并记录仪器状态和测量数据。9 数据处理和计算 9.1 将8.3.2获得数据以ti为横坐标，Ai为纵坐标，作图后采用最小二乘法进行线性拟合，斜率记为k0。9.2 将8.3.3获得数据以ti为横坐标，Ai为纵坐标，作图。由于反应初期为孵化过程（一般为3min15min），所以应舍弃反应初期明显非线性的数据点，再采用最小二乘法进行线性拟合，斜率记为kGQDs。9.3 将kGQDs-k0替代A/t代入式（1）中，即可计算获得石墨烯量子点类酶活力，参见附录B。T/CSTM 00198-2021 5 10 不确定度来源分析 测试结果的不确定度来源包括但不限于：（1）仪器校准、特
16、征峰的吸光度A、反应时间t、测试溶液的体积V、样品池的光程l、DAP的摩尔吸收系数、称量质量和容量瓶体积等；（2）数据的线性拟合斜率kGQDs和k0；（3）测量的重复性。11 检测报告 测试报告应包含但不限于以下信息，参见附录C：a)委托者信息：名称、地址等；b)样品信息：测量样品名称、编号等；c)测量依据（包括发布或出版年号）；d)测量仪器；e)样品的测试条件；f)测量结果；g)测量结构：测量人员、校验人员、测量日期、结果名称、地址等。T/CSTM 00198-2021 6 附 录 A（资料性）DAP 标准曲线的测量 A.1 实验样品：DAP（分析纯，纯度为 98%）。A.2 实验内容：DA
17、P 标准曲线的测量。A.3 实验分析方法：紫外/可见分光光度法。A.4 测试条件：紫外/可见吸收光谱仪的模式设定为“普通模式”，波长扫描范围 350800 nm，扫描步长 2 nm，扫描速度 600 nmmin-1；环境温度为（251）。A.5 测量步骤 A.5.1 酸碱溶液的配置 1)用移液器移取833 L 37%浓盐酸至10 mL容量瓶中，加水至容量瓶刻度，即得1 mol/L的盐酸溶液。2)称量0.400 g NaOH粉末，溶解于8 mL水中，转移至10 mL容量瓶中，加水至容量瓶刻度，即得1 mol/L的NaOH溶液。A.5.2 DAP标准溶液的配制 1)称量0.01072 g DAP粉
18、末，加少量水溶解，加入3.5 mL 1 mol/L盐酸溶液，搅拌溶液使DAP粉末完全溶解。注：DAP不溶于水。加入酸后，DAP上的-NH2和H+结合，生成离子态的-NH3+，可溶解于水。2)向溶液中加入4 mL 1 mol/L的NaOH溶液，使溶液pH达到11以上。将上述溶液转移至250 mL容量瓶中，加水至容量瓶刻度，摇匀。即制得250 mL 200 mol/L的DAP溶液，备用。注：DAP在酸性时为离子态，吸收峰约为450 nm；在中性或碱性时为分子态，吸收峰为420 nm，与OPD氧化后的吸收峰位置相同（见图B.1）。所以，将溶液的调为碱性。3)准备6个50 mL容量瓶，将其编号为16。
19、在16号容量瓶中分别加入0.1、0.25、0.5、1.25、2.5和5 mL制备的200 mol/L DAP溶液。再向6个容量瓶中分别加入0.5 mL 1 mol/L的NaOH溶液，加水至容量瓶刻度，摇匀。16号样品中的DAP溶液浓度依次为0.4、1、2、5、10和20 mol/L。A.5.3 紫外/可见吸收光谱测试 采用去离子水对紫外/可见吸收光谱仪的基线进行校正。向1 cm1 cm比色皿中加入3 mL待测的DAP标准溶液进行润洗，共润洗两次。再向1 cm1 cm比色皿中加入3 mL待测的DAP标准溶液进行紫外/可见吸收光谱测试。单次取样测试3次，在420 nm的吸光度取平均值。依次对16号
20、的样品溶液进行测试。DAP在碱性时会非常缓慢的析出，所以应在完成A.5.2后1小时内完成紫外/可见吸收光谱测试。A.6 测试结果分析 16号样品溶液的紫外/可见吸收光谱图及其拟合的标准曲线图分别见图A.1 a）和图A.1 b）。从图A.1 a）可以看出，DAP最大吸收处的波长为420 nm。DAP浓度与其吸光度呈现很好的线性关系，线性T/CSTM 00198-2021 7 拟合后拟合度R2=0.9997，见图A.1 b）。经计算DAP的摩尔吸收系数为（1.9570.049）104 L mol-1 cm-1(包含因子k=2)。a）不同浓度 DAP 的紫外/可见吸收光谱图 b）在 420 nm 处
21、拟合的标准曲线图 图 A.1 不同浓度 DAP 的紫外/可见吸收光谱图和在 420 nm 处拟合的标准曲线图 (a)(b)T/CSTM 00198-2021 8 附 录 B（资料性）石墨烯量子点类过氧化物酶活力测定实例 B.1 实验样品：石墨烯量子点水分散液（约 1 g/L）。B.2 实验内容：石墨烯量子点类过氧化物酶活力测定。B.3 实验分析方法：紫外/可见分光光度法。B.4 测试条件：波长扫描范围 350800 nm，扫描步长 2 nm，扫描时间间隔 2 min，扫描总时间 20 min，扫描速度 400 nm/min。B.5 测试结果分析 B.5.1 空白自氧化速率测定 向比色皿（1 c
22、m 1 cm）中依次加入 2740 L 超纯水、40 L H2O2(1 molL-1)溶液、300 L OPD(0.1 molL-1)溶液混合混匀，总体积 3080 L。将比色皿置于紫外/可见吸收光谱仪中，25恒温测量不同时间点空白溶液的吸收光谱。由吸收光谱计算出 OPD 的自氧化速率。测试三个空白样品。B.5.2 石墨烯量子点催化 H2O2氧化 OPD 的速率测定 向比色皿（1 cm 1 cm）中依次加入 740 L 超纯水、40 L(1 molL-1)H2O2溶液、300 L(0.1 molL-1)OPD 溶液和 2000 L(1 g/L)石墨烯量子点分散液混合均匀。将比色皿置于紫外/可见
23、吸收光谱仪中，25 恒温测量反应溶液不同时间点的吸收光谱，见图 B.1。由于反应前 10 min 为孵化过程，计算石墨烯量子点催化 H2O2氧化 OPD 的反应速率时，不使用此部分数据。扣掉空白速率，代入公式（2），求出其类过氧化物酶活力，见图 B.2。对于 OPD 的氧化产物 DAP，其在 420 nm 处的DAP见附录 A。去自氧化后A/t=0.00186 min-1，求得 OPD=(3.88 0.29)10-4 U(包含因子 k=2)。图 B.1 加入石墨烯量子点后样品溶液在不同反应时间的吸收光谱图 T/CSTM 00198-2021 9 图 B.2 DAP 在 420 nm 处有（红线
24、）无（黑线）石墨烯量子点的吸光度随反应时间的变化关系图 T/CSTM 00198-2021 10 附 录 C（资料性）石墨烯量子点类酶活力测试报告格式 石墨烯量子点类酶活力测试报告格式如下：报告编号：_ 1 委托者 名称：_ 地址：_ 联系方式：_ 2 测试样品 测试样品名称：_ 测试样品编号：_ 3 测试依据：_ 4 紫外/可见吸收光谱仪 制造单位：_ 型号：_ 编号：_ 仪器检定/校准证书编号：_ 检定/校准结果：_ 5 样品的测试条件 样品池：_温/湿度：_ 扫描时间间隔：_ 波长扫描范围：_ 扫描步长：_ 扫描总时长：_ 6 测试结果 OPD自氧化速率：_ 石墨烯量子点催化H2O2氧化
25、OPD的速率：_ 石墨烯量子点的类酶活力：_ 7 测试机构 测试人员：_ 校验人员：_ 测试日期：_ 机构名称：_ 地址：_ 8 授权机构：_ 授权证书编号：_ T/CSTM 00198-2021 11 附 录 D（资料性）起草单位和主要起草人 本文件起草单位：国家纳米科学中心、中国计量科学研究院、枣庄学院。本文件主要起草人：纪英露、吴晓春、蔡瑞、樊慧真、李硕、贾志立、刘建波、高欣爽、刘忍肖。T/CSTM 00198-2021 12 参考文献 1 GE J,LAN M,ZHOU B,LIU W,GUO L,WANG H,JIA Q,NIU G,HUANG X,ZHOU H,MENG X,WAN
26、G P,LEE C-S,ZHANG W,HAN X.A graphene quantum dot photodynamic therapy agent with high singlet oxygen generationJ.Nat.Commun.,2014,5,1-8.2 JU J,CHEN W.In situ growth of surfactant-free gold nanoparticles on nitrogen-doped graphene quantum dots for electrochemical detection of hydrogen peroxide in bio
27、logical environmentsJ.Anal.Chem.,2015,3,1903-1910.3 LI Q,ZHANG S,DAI L,LI L S.Nitrogen-doped colloidal graphene quantum dots and their size-dependent electrocatalytic activity for the oxygen reduction reactionJ.J Am Chem Soc,2012,46,18932-18935.4 LI Y,ZHAO Y,CHENG H,HU Y,SHI G,DAI L,QU L.Nitrogen-do
28、ped graphene quantum dots with oxygen-rich functional groupsJ.J Am Chem Soc,2012,1,15-18.5 QU D,ZHENG M,DU P,ZHOU Y,ZHANG L,LI D,TAN H,ZHAO Z,XIE Z,SUN Z.Highly luminescent s,n co-doped graphene quantum dots with broad visible absorption bands for visible light photocatalystsJ.Nanoscale,2013,24,1227
29、2-12277.6 ZHUO S,SHAO M,LEE S T.Upconversion and downconversion fluorescent graphene quantum dots:Ultrasonic preparation and photocatalysisJ.Acs Nano,2012,8,1059-1064.7 JIANG B,DUAN D M,GAO L Z,ZHOU M J,FAN K L,TANG Y,XI J Q,BI Y H,TONG Z,GAO G F,XIE N,TANG A F,NIE G H,LIANG M M,YAN X Y.Standardized assays for determining the catalytic activity and kinetics of peroxidase-like Nanozymes J.Nature Protocols,2018,13,1506-1520._