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1、第七章第七章 黄酮类化合物（二）黄酮类化合物（二）学习目标：学习目标：1、掌握黄酮类化合物一般提取方法和主要分离方法的原理及与结构的关系。2、理解黄酮类化合物的色谱鉴定方法的原理和应用。3、掌握黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇、异黄酮和查耳酮的紫外光谱特征。4、掌握黄芩、葛根、银杏主要化学成分的结构特点和理化性质、提取分离方法、鉴定方法和生物活性。5、熟悉槐米、陈皮中主要化学成分的结构特点、理化性质和鉴别方法。重点：黄酮类化合物的提取及分离方法。难点：聚酰胺色谱，纸色谱。一、提取 黄酮苷和极性较大的苷元：甲醇，乙醇，甲醇-水（1：1），丙酮，乙酸乙酯；多糖苷：沸水；花色苷：0.1%盐酸进行提
2、取；苷元：氯仿，乙醚，乙酸乙酯。注意：苷类提取防止酶解。（一）溶剂萃取法：自浸膏中先用乙醚萃取苷元，再用乙酸乙酯反复萃取苷，最后用正丁醇萃取极性较大的苷。第三节 黄酮类化合物的提取分离（二）碱提酸沉法：1、常用碱水：石灰水，Na2CO3,，稀NaOH，碱性稀醇。2、酸沉：盐酸。注意：酸碱浓度不宜过高，碱性过强，破坏黄酮母核；酸性过强，生成烊?盐，影响产率。石灰水：可除去鞣质，果胶，粘液质，有利于纯化。但浸出效果不及NaOH，且有些黄酮可与钙结合成不溶性沉淀。稀NaOH：浸出效率高，但杂质多。二、分离方法 分离的基本依据：极性差异、酸性强弱、分子大小和特殊结构。（一）柱色谱法 1、硅胶柱色谱法：
3、适于分离异黄酮，二氢黄酮（醇）和高度甲基化或乙酰化的黄酮及黄酮醇类。分离苷元时：氯仿-甲醇混合溶剂洗脱。分离苷时：氯仿-甲醇-水或乙酸乙酯-丙酮-水洗脱。2、聚酰胺柱色谱：适合于黄酮类化合物的分离。其分离规律：（1）苷元相同时，以含水移动相洗脱，被吸附的强弱顺序为：苷元单糖苷双糖苷双糖键苷。（2）与酚羟基的数目有关，数目越多，吸附力越强。与酚羟基的位置有关，如果酚羟基所处的位置易形成分子内氢键，则吸附力减弱。一般来说查耳酮二氢黄酮，黄酮二氢黄酮。（3）不同类型黄酮类化合物，被吸附的强弱顺序为：黄酮醇黄酮二氢黄酮异黄酮。（4）分子内芳香化程度越高，共轭双键越多，则吸附力越强。3、葡聚糖凝胶色谱法
4、：凝胶类型：SsephadexLH-20和SephadexG两种类型的凝胶。分离苷元时：利用吸附作用，游离酚羟基数目越多，则吸附力越强，越难洗脱。分离苷时：主要靠分子筛，洗脱时按苷分子量由大到小的顺序依次被洗脱出柱体。常用的洗脱剂：碱性水溶液，含盐水溶液、醇及含水醇。（二）PH梯度法：用不同浓度的碱分离。混合物溶于有机溶剂，依次用NaHCO3、Na2CO3、0.2%NaOH、4%NaOH萃取，相应的黄酮类化合物洗脱顺序：7,4二羟基7或4羟基一般酚羟基羟基黄酮。（三）硼酸络合法:具有邻二酚羟基的黄酮类化合物可与硼酸络合生成易溶于水的化合物。三、中药实例（一）槐米：豆科槐Sophora japo
5、nica的花蕾。主要成分为黄酮（芦丁）含量23%。芦丁的溶解度：热水：1:200；冷水：1:10000；沸乙醇：1:60；沸甲醇：1:7。可溶于吡啶，甲酰胺和碱液，微溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯，不溶于氯仿，二硫化碳、乙醚、苯和石油醚。提取分离：水煮提取或碱溶酸沉法提取，水或乙醇重结晶。流程图见下页。注意：芦丁有邻二酚羟基，不太稳定，空气中会缓缓氧化变为暗褐色，碱性条件下更易氧化，因此用碱水提取时常加少量硼砂，使硼酸盐与邻二酚羟基络合保护酚羟基。具有清热燥湿、泻火解毒、止血安胎之功效，其化学成分主要含黄酮类成分，另有氨基酸、挥发油、糖和甾醇。（二）黄芩：唇形科黄芩的干燥根。（二）黄芩：唇形科黄芩的
6、干燥根。1、主成分的结构与性质：有30多种黄酮类成分。以游离存在的数目较多。含量以黄芩苷为主，也是抗菌的代表性成分。黄芩苷：含量高达4%5%，为葡萄糖醛酸苷。在酸水中溶解度小，不易被酸水解，能被黄芩酶水解。黄芩素：溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯及热冰醋酸。溶于稀氢氧化钠呈绿色，黄芩素具有5，6，7三羟基，在空气中易被氧化转为醌式结构而显绿色。汉黄芩苷：黄芩中特有的成分，5-羟基-8-甲氧基-黄酮-7-O-葡萄糖醛酸苷。除葡萄糖醛酸苷，也有葡萄糖苷。除黄酮外，也有少量的二氢黄酮及查尔酮。2、主成分的提取分离见参考书。四、理化检识：.HCI-Mg粉：黄酮（醇）、二氢黄酮（醇）；在盐酸在盐酸-镁粉作用下，
7、易被氢化还原，迅速生镁粉作用下，易被氢化还原，迅速生成成红紫红色红紫红色（个别有绿兰色）。（个别有绿兰色）。.四氢硼钠：二氢黄酮（醇）；取样品取样品10mg溶于甲醇，加溶于甲醇，加NaBH4 10mg，再滴，再滴加加1%浓盐酸或浓硫酸，呈浓盐酸或浓硫酸，呈红紫色。红紫色。.醋酸镁：二氢黄酮（醇）醋酸镁：二氢黄酮（醇）；醋酸镁甲醇液作显色剂，可在纸上进行。醋酸镁甲醇液作显色剂，可在纸上进行。二二氢黄酮（醇）类显氢黄酮（醇）类显天蓝色荧光天蓝色荧光，若具有，若具有C5-OH，色泽更明显。，色泽更明显。.五氯化锑：查尔酮；五氯化锑：查尔酮；查耳酮的查耳酮的CCl4溶液与五氯化锑作用生成溶液与五氯化锑
8、作用生成红或红或紫红沉淀紫红沉淀。.锆盐-枸橼酸：区别3-OH、5-OH黄酮；方法如下：.氨性氯化锶：邻二酚羟基黄酮.显绿显绿棕色棕色黑色沉淀。黑色沉淀。五、色谱检识（一）纸色谱：双向展开，少用。（二）硅胶薄层色谱：主要用于检识极性较小的黄酮。氯仿-甲醇或正丁醇-醋酸-水等系统展开。（三）聚酰胺薄层色谱：各种黄酮。游离黄酮：氯仿-甲醇、氯仿-甲醇-丁酮展开；黄酮苷：甲醇-乙酸-水、甲醇-水展开。六、紫外光谱和可见光谱一般程序：先测甲醇光谱，再测加各种诊断试剂的光谱，如为苷类，则先水解。1在甲醇溶液中的紫外光谱：（1）基本谱带在黄酮或黄酮醇母核上，有羟基，甲氧基等供电子基取代，可引起吸收带红移。
9、B环氧取代程度越高，带越向长波方向移动。A环氧取代，则使带、带红移6-17nm。但如果羟基甲基化或苷化，则相应的吸收峰向紫移，带更明显。（2）查耳酮及橙酮：带为主峰，带吸收弱。（3）异黄酮、二氢黄酮及二氢黄酮醇：都有苯甲酰系统，而无桂皮酰系统。紫外吸收峰都是带为强峰，带为弱峰。异黄酮：245270nm；二氢黄酮及二氢黄酮醇：270295nm。2、加入诊断试剂后引起紫外吸收峰的位移及在结构测定中的意义：以黄酮和黄酮醇为例 （1）甲醇钠：强碱性，使所有酚羟基解离，红移。A：带红移5060nm,且强度降低，说明结构中有3-OH，无4-OH。B：带红移40 65nm，且强度不下降，说明是有4-OH。C
10、：有游离7-OH，一般在320 330nm处有吸收，7-OH成苷，则无此吸收峰。D：含有3，4-及3，3，4-羟基结构的黄酮醇类，在甲醇钠存在下，易氧化分解，故吸收带会随时间的延长而衰退。（2）醋酸钠：可使7-或4-羟基解离，影响相应吸收带红移。A：7-OH，带红移520nm,含6，8位氧取代，幅度下降。B：4-OH黄酮，7-OH是否被取代，可判断，如果被取代，醋酸钠与甲醇钠引起的带位移相同或稍大。C：有邻位OH，吸收峰会逐渐衰退。（3）醋酸钠/硼酸：有邻二酚羟基时（5，6位除外）可引起相应吸收带红移。A环：带5 10nm B环：带12 30nm(4)三氯化铝及三氯化铝/盐酸：具有3-羟基，4
11、-羰基或5-羟基，4-羰基及邻二酚羟基结构的化合物螯合，引起红移。生成铝螯合物按相对稳定性排列顺序：3-OH（黄酮醇）5-OH（黄酮）5-OH（二氢黄酮）邻二酚羟基3-OH（二氢黄酮醇）。邻二酚羟基螯合物不稳定，会在盐酸中分解，使相应的吸收带紫移。A：样品+AICI3/HCl光谱等于样品+CH3OH光谱。表示无3-OH或5-OH或两者被取代。如样品甲醇液在加入AICI3/HCl后，带红移3555nm则示有5-OH而无3-OH；只红移1720nm时，示有6-氧取代；带红移约60nm，示有3-OH而无5-OH；带红移50-60nm，示同时有3-OH，5-OH。B：样品+AICI3与样品+AICI3
12、/HCl 光谱一样，则表示无邻二酚羟基；样品+AICI3与样品+AICI3/HCl比较，带紫移3040nm。示B环上有邻二酚羟基，仅紫移约20nm，示B环上有邻三羟基；若紫移在5065nm，则A及B环均有邻二酚羟基。七、氢核磁共振在黄酮类化合物结构测定中的应用主要规律：（一）A环质子较B环质子位于较高磁场。1、5,7-二羟基黄酮类化合物：H-6和H-8分别以双重峰出现在5.76.9ppm之间，J=2.5HZ,且H-6的化学位移比H-8的位于较高磁场。化学位移小。7-羟基成苷后，化学位移均向低磁场位移。5,7-二羟基黄酮 2、7-羟基黄酮类化合物：H-5因H-6的邻偶（J=9HZ),故表现为一个
13、双峰，且化学位移约为8ppm左右。H-6 因H-5的邻偶（J=9HZ)和H-8的远程偶合（J=2.5HZ),故表现为双二重峰。化学位移6.47.1之间。H-8因H-6的远程（J=2.5HZ），表现为双峰。A环上C5-H位于低场，是受C4-羟基的负屏蔽影响。7羟基黄酮（二）B环质子1、4-氧代黄酮类化合物：H-2、H-6：双峰（2H,J=8.5HZ）7.18.1ppm；H-3、H-5：双峰,(2H,J=8.5HZ)6.3 7.1ppm；2、3、4-二氧代黄酮类化合物：H-5 7.1 6.7(d,J=8.5HZ)H-2 7.2(d,J=2.5HZ)；H-6 7.9(q,J=2.5HZ和J=8.5H
14、Z)；3、3、4、5-三氧代黄酮类化合物：如果3、4、5均为羟基，为相同取代，H-2和H-6为单峰，化学位移在7.5 6.5ppm.（三）C环质子 1、黄酮类：H-3尖锐单峰，化学位移6.3ppm。2、异黄酮：H-2尖锐单峰，化学位移7.67.8ppm。H-2H-2，7.6-7.87.6-7.83、二氢黄酮：H-2q(J=11、5HZ)中心位于5.2ppm；H-3两个H分别裂分成四重峰，q(J=17或11、5HZ)中心位于2.8ppm4、二氢黄酮醇：H-2和H-3构成反式二直立键，J=11HZ,两个H分别裂分成四重峰,H-2在5.04.8ppm,H-3在4.3 4.1ppm；3-羟基成苷后，化
15、学位移移向低场，H-2在5.6 5.0ppm,H-3在4.6 4.3ppm。（2s，3s）二氢黄酮醇5、其他质子：酚羟基：12.4（5-OH）、10.93(7-OH)、9.70(3-OH)；C6、C8-C3：2.2 2.0（C6），2.1 2.4（C8）；甲氧基：4.1 3.5（s)。作业作业一、单选题A型题1、能溶于酸水，且显红色的黄酮类化合物是:A、矢车菊素B、葛根素C、槲皮素D、槲皮素7-葡萄糖苷E、黄芩苷B型题2-6A二氢黄酮B、黄酮苷C、3-OH和5-OH黄酮D、榕碱E、邻二酚羟基黄酮以下五中试剂可用于:2、氯化缌3、四氢硼钠4、二氯氧锆5、Molish反应6、醋酸镁7-10A、黄芩苷B、邻醌C、黄芩素D、二氢黄酮E、黄酮7、黄芩中的主要成分:8、黄芩中的化学成分结构类型属于:9、黄芩苷元因具有邻三羟基，结构不稳定，在空气中被氧化成绿色化:10、黄芩中的抗菌、消炎的主要活性成分是: