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1、精讲精练系列精讲精练系列2.2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数课题背景课题背景1、尿素的利用、尿素的利用尿素尿素是一种重要的是一种重要的农业农业氮肥。氮肥。尿素尿素不能直接不能直接被被农农作物作物吸收。吸收。土壤中的土壤中的细细菌将尿素菌将尿素分解成氨分解成氨之后才能被植物利用。之后才能被植物利用。2、细细菌利用尿素的原因菌利用尿素的原因土壤中的土壤中的细细菌分解尿素是因菌分解尿素是因为为它它们们能合成能合成脲脲酶酶CO(NH2)脲脲酶酶+CO2NH3+H2O3、课题课题目的目的从土壤中分离出能从土壤中分离出能够够分解尿素的分解尿素的细细菌菌统计统计每克土壤每克土壤样样品中究竟含有多少品中究
2、竟含有多少这样这样的的细细菌菌一一.研究思路研究思路（一）筛选菌株（一）筛选菌株（二）统计菌落数目（二）统计菌落数目（三）设置对照（三）设置对照 1、实实例：例：启示：启示：寻寻找目的菌种找目的菌种时时要根据它要根据它对对生存生存 环环境的要求，到相境的要求，到相应应的的环环境中去境中去 寻寻找。找。原因：因原因：因为热为热泉温度泉温度70800C，淘汰了，淘汰了 绝绝大多数微生物只有大多数微生物只有Taq细细菌被菌被 筛选筛选出来。出来。DNA多聚多聚酶酶链链式反式反应应是一种在体外将是一种在体外将少量少量DNA大量复制大量复制的技的技术术，此此项项技技术术要求使用要求使用耐高温（耐高温（9
3、30C）的）的DNA聚合聚合酶酶。（一）筛选菌株（一）筛选菌株人人为为提供提供有利于目的菌株生有利于目的菌株生长长的条件的条件(包括包括营营养、温度、养、温度、pH等等)，同同时时抑制或阻止其他微生物抑制或阻止其他微生物生生长长。什么是什么是选择选择性培养基？性培养基？2、实验实验室中微生物的室中微生物的筛选筛选原理：原理：15.0g琼琼脂脂1.0g尿素尿素10.0g葡萄糖葡萄糖0.2gMgSO47H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO4从物理性从物理性质质看此培养基属于哪看此培养基属于哪类类？固体培养基固体培养基固体培养基固体培养基 3、土壤中分解尿素的、土壤中分解尿素的细细菌的分离
4、与菌的分离与计计数所需培养基：数所需培养基：在此培养基中哪些作在此培养基中哪些作为为碳源、氮源？碳源、氮源？碳源：碳源：葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素 氮源：氮源：尿素尿素尿素尿素培养基的培养基的氮源氮源为为尿素尿素，只有能合成，只有能合成脲脲酶酶的微生物才能分解尿素，的微生物才能分解尿素，以尿素作以尿素作为为氮源。氮源。缺乏缺乏脲脲酶酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生源而不能生长发长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选够选择择出分解尿素的微生物。出分解尿素的微生物。4、培养基、培养基选择
5、选择分解尿素的微生物的原理分解尿素的微生物的原理以尿素为唯一以尿素为唯一氮源的培养基氮源的培养基牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨培养基培养基是是分离尿素分离尿素细菌细菌判断该培养基判断该培养基有无选择性有无选择性实验组实验组对照组对照组培养基类型培养基类型是否接种是否接种目的目的结果结果只生长尿素细菌只生长尿素细菌生长多种微生物生长多种微生物是是 5、怎、怎样证样证明此培养基具有明此培养基具有选择选择性呢？性呢？1、显显微微镜镜直接直接计计数：数：利用利用血球血球计计数板数板，在，在显显微微镜镜下下计计算一定容算一定容积积里里样样品中微生物的数量。品中微生物的数量。不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活
6、菌；不适于不适于对对运运动细动细菌的菌的计计数；数；需要相需要相对对高的高的细细菌菌浓浓度；度；个体小的个体小的细细菌在菌在显显微微镜镜下下难难以以观观察；察；缺点：缺点：（二）统计菌落数目（二）统计菌落数目2.间间接接计计数法（数法（活菌活菌计计数法）数法）原理：原理：在稀在稀释释度足度足够够高高时时，微生物在固体培养基上所形成的，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落一个菌落 是由是由一个一个单细单细胞胞繁殖而成的，即繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个一个菌落代表原先的一个单细单细胞。胞。常用方法：稀常用方法：稀释释涂布平板法。涂布平板法。每克每克样样品中的菌落数品中的菌落数(CV)M其中
7、，其中，C代表某一稀代表某一稀释释度下平板上生度下平板上生长长的平均菌落数，的平均菌落数，V代表涂布平板代表涂布平板时时所用的稀所用的稀释释液的体液的体积积(ml)，M代表稀代表稀释释倍数。倍数。注意事注意事项项：为为了保了保证结证结果准确，一般果准确，一般选择选择菌落数在菌落数在30300的平板上的平板上进进行行计计数。数。为为使使结结果接近真果接近真实值实值可将同一稀可将同一稀释释度加到度加到三个或三个以上三个或三个以上的平皿中，的平皿中，经经涂布，培养涂布，培养计计算出菌落算出菌落平均数平均数。统计统计的菌落往往比活菌的的菌落往往比活菌的实际实际数目低数目低。设置对照的主要目的是排除实验
8、组中设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。响，提高实验结果的可信度。（三）设置对照（三）设置对照实实例：在做分解尿素的例：在做分解尿素的细细菌的菌的筛选筛选与与统计统计菌落数目的菌落数目的实验时实验时，A同学从同学从对应对应 的的106倍稀倍稀释释的培养基中的培养基中筛选筛选出大出大约约150个菌落，但是其他同学在同个菌落，但是其他同学在同样样 的稀的稀释释度下只度下只选择选择出大出大约约50个菌落。分析其原因。个菌落。分析其原因。原因：原因：土土样样不同，不同，培养基培养基污污染或操作失染或操作失误误(或者是混入了其他的含氮
9、物或者是混入了其他的含氮物质质)小小结结：通通过这过这个事例可以看出，个事例可以看出，实验结实验结果要有果要有说说服力，服力，对对照的照的设设置是置是 必不可少的。必不可少的。方案一：方案一：由其他同学用与由其他同学用与A同学相同土同学相同土样进样进行行实验实验 方案二：方案二：将将A同学配制的培养基在不加土同学配制的培养基在不加土样样的情况下的情况下进进行培养，作行培养，作为为 空白空白对对照，以照，以证证明培养基是否受到明培养基是否受到污污染。染。结结果果预测预测：如果如果结结果与果与A同学一致，同学一致，则证则证明明A无无误误；如果；如果结结果不同，果不同，则证则证明明A同学存在操作失同
10、学存在操作失误误或培养基的配制有或培养基的配制有问题问题。（一）土壤取样（一）土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。装入事先准备好的信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌灭菌。（二）制备培养基：（二）制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的制备以尿素为唯一氮源的选择培养基选择培养基。二二.实验的具体操作实验的具体操作应应在火焰旁称取土壤在火焰旁称取土壤10g。在稀在稀释释土壤溶液的土壤溶液的过过程中，每一步都要在火焰旁程中
11、，每一步都要在火焰旁进进行行（三）样品的稀释（三）样品的稀释实验时实验时要要对对培养皿作好培养皿作好标记标记。注明培养基。注明培养基类类型、培养型、培养时间时间、稀、稀释释度、度、培养物等。培养物等。（四）取样涂布（四）取样涂布分离不同的微生物采用不同的稀分离不同的微生物采用不同的稀释释度度稀释倍数稀释倍数目的目的细菌细菌104、105、106保证获得菌落数在保证获得菌落数在30300之间、之间、适于计数的平板适于计数的平板放线菌放线菌103、104、105真菌真菌102、103、104原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微
12、生物在土壤中含量不同在菌落在菌落计计数数时时，每隔，每隔24h统计统计一次菌落数目。一次菌落数目。选选取菌落数目取菌落数目稳稳定定时时的的记录记录作作为结为结果，果，以防止因培养以防止因培养时间时间不足而不足而导导致致遗遗漏菌落的数目。漏菌落的数目。培养不同微生物往往需要不同培养温度。培养不同微生物往往需要不同培养温度。细细菌：菌：3037培养培养12d放放线线菌：菌：2528培养培养57d霉菌：霉菌：2528的温度下培养的温度下培养34d。（五）微生物的培养与观察（五）微生物的培养与观察如果得到了如果得到了2个或个或2个以上个以上菌落数目在菌落数目在30300的平板，的平板，则说则说明稀明稀
13、释释操作操作比比较较成功，并能成功，并能够进够进行菌落的行菌落的计计数，如果数，如果同一稀同一稀释释倍数的三个重复的菌落倍数的三个重复的菌落数相差数相差较较大，表明大，表明试验试验不精确不精确，需要重新，需要重新实验实验。微生物的培养与观察微生物的培养与观察1.通通过对过对照照实验实验，若培养物有，若培养物有杂杂菌菌污污染，菌落数偏高；若培养物混入其他染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，氮源，则则菌落形菌落形态态多多样样，菌落数偏高，菌落数偏高，难难以以选择选择出分解尿素的微生物。出分解尿素的微生物。2.提示：提示：选择选择每个平板上每个平板上长长有有30300个菌落的稀个菌落的稀释释倍倍计
14、计算每克算每克样样品的菌品的菌数最合适。同一稀数最合适。同一稀释释倍数的三个重复的菌落数不能相差倍数的三个重复的菌落数不能相差悬悬殊，如相差殊，如相差较较大，表示大，表示实验实验不精确。不精确。三三.结果分析与评价结果分析与评价无菌操作无菌操作 做好标记做好标记 规划时间规划时间 四四.操作提示操作提示在以尿素在以尿素为为唯一氮源的培养基中加入唯一氮源的培养基中加入酚酚红红指示指示剂剂。培养某种培养某种细细菌后，如果菌后，如果PH升高，指示升高，指示剂剂将将变红变红，说说明明该细该细菌能菌能够够分解尿素分解尿素。测测定定饮饮水中水中大大肠肠杆菌杆菌数量的方法是将一定体数量的方法是将一定体积积的
15、水用的水用细细菌菌过滤过滤器器过滤过滤后，后，将将滤滤膜放到膜放到 伊伊红红美美蓝蓝 培养基上培养，大培养基上培养，大肠肠杆菌杆菌菌落呈菌落呈现现黑色黑色，通，通过记过记述述得出水得出水样样中大中大肠肠杆菌的数量。杆菌的数量。五五.课外延伸课外延伸大肠杆菌呈大肠杆菌呈 黑色中心黑色中心 ,有或无金属光泽有或无金属光泽大肠杆菌在大肠杆菌在伊红美蓝琼脂伊红美蓝琼脂(EMB)(EMB)上典型特征上典型特征 本课题知识小结本课题知识小结:对细对细菌群体生菌群体生长规长规律律测测定正确的表述是（定正确的表述是（）A在液体培养基上在液体培养基上进进行行 B至少接种一种至少接种一种细细菌菌 C接种一个接种一
16、个细细菌菌 D及及时补时补充消耗的充消耗的营营养物养物质质解析：解析：细细菌群体菌群体生生长规长规律的律的测测定定是人是人们们在一定条件下在一定条件下进进行的。行的。这这些条件是：些条件是：一一种种细细菌、恒定容菌、恒定容积积的培养基，液体培养基、定的培养基，液体培养基、定时测时测定定细细菌菌总总数数。在。在这这些些条件下，才能条件下，才能测测定出定出细细菌的生菌的生长规长规律。律。测测定定时时只能用一种只能用一种细细菌的子菌的子细细胞群胞群体的体的变变化化规规律表达微生物的生律表达微生物的生长长；恒定容；恒定容积积是是给给微生物提供一定的生存微生物提供一定的生存环环境；液体培养基才能通境；液
17、体培养基才能通过样过样品推品推测细测细菌菌总总数。若接种多种数。若接种多种细细菌，菌，则则会会发发生生种种间间斗争而不能斗争而不能测测定一种微生物的生定一种微生物的生长规长规律。在接种律。在接种时时，要保，要保证证一定的接一定的接种量。种量。A六六.例题解析例题解析1.对细对细菌群体生菌群体生长规长规律律测测定的正确的表述是（定的正确的表述是（）A.在液体培养基上在液体培养基上进进行行 B.至少接种一种至少接种一种细细菌菌 C.接种一个接种一个细细菌菌 D.及及时补时补充消耗的充消耗的营营养物养物质质 2.使用使用选择选择培养基的目的是（培养基的目的是（）A.培养培养细细菌菌 B.培养真菌培养
18、真菌 C.使需要的微生物大量繁殖使需要的微生物大量繁殖 D.表表现现某微生物的特定性状与其他微生物加以区某微生物的特定性状与其他微生物加以区别别3.能合成能合成脲脲酶酶的微生物所需要的碳源和氮源分的微生物所需要的碳源和氮源分别别是是()A.CO2和和N2 B.葡萄糖和葡萄糖和NH3 C.CO2和尿素和尿素 D.葡萄糖和尿素葡萄糖和尿素实践训练实践训练A CD4.下列下列说说法不正确的是（法不正确的是（）A.科学家从科学家从7080度度热热泉中分离到耐高温的泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合聚合酶酶 B.统计统计某一稀某一稀释释度的度的5个平板的菌落数依次个平板的菌落数依次为为M1、M2、M3、
19、M4、M5，以以M3作作为该样为该样品菌落数的估品菌落数的估计值计值 C.设设置置对对照照实验实验的主要目的是排除的主要目的是排除实验组实验组中非中非测试测试因素因素对实验结对实验结果的影响，果的影响，提高提高实验结实验结果的可信度果的可信度 D.同其他生物同其他生物环环境相比，土壤中的微生物数量最大，种境相比，土壤中的微生物数量最大，种类类最多。最多。5.为为培养和分离出酵母菌并淘汰培养和分离出酵母菌并淘汰杂杂菌，常在培养基中加入（）菌，常在培养基中加入（）A.较较多的氮源物多的氮源物质质 B.较较多的碳源物多的碳源物质质 C.青霉素青霉素类药类药物物 D.高高浓浓度食度食盐盐BC练一练练一
20、练1.用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目，其结果与实际值相比（用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目，其结果与实际值相比（）A.比实际值高比实际值高 B.比实际值低比实际值低 C.和实际值一致和实际值一致 D.比实际值可能高也可能低比实际值可能高也可能低2.下列能下列能选择选择出分解尿素的出分解尿素的细细菌的培养基是菌的培养基是()A.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、尿素、葡萄糖、尿素、琼琼脂、水脂、水B.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、葡萄糖、琼琼脂、水脂、水C.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4.7H2O、尿素、尿素、琼琼脂、水脂、水D.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4.7H2O、牛肉膏、蛋白、牛肉膏、蛋白胨胨、琼琼脂、水脂、水精讲精练系列精讲精练系列