《课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 (6)(精品).ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 (6)(精品).ppt（30页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、一一.分解尿素的细菌分解尿素的细菌：尿素尿素是一种重要的是一种重要的农业氮肥。农业氮肥。尿素尿素不能直接不能直接被被农作物农作物吸收。吸收。土壤中有的细菌能将尿素土壤中有的细菌能将尿素分解成分解成氨氨之后才能被植物利用。之后才能被植物利用。因为这些细菌能合成因为这些细菌能合成脲酶：脲酶：CO(NHCO(NH2 2)2 2脲酶脲酶脲酶脲酶 +H +H2 2OO+CO+CO2 22NH2NH3 3土壤中土壤中分解尿素的细菌分解尿素的细菌的的分分离离和计数和计数常见的分解尿素的细菌：常见的分解尿素的细菌：芽孢杆菌芽孢杆菌、小球菌小球菌、假单胞杆菌假单胞杆菌、棒状杆菌棒状杆菌等等二二.课题目的：课题目
2、的：1.1.从土壤中分离出从土壤中分离出能够分解尿素的细菌能够分解尿素的细菌2.2.统计统计每克土壤每克土壤样品中究竟含有样品中究竟含有多少这样的细菌多少这样的细菌三三.研究思路：研究思路：(一一).).筛选菌株筛选菌株(二二).).统计菌落数目统计菌落数目(三三).).设置对照设置对照 1.1.实例实例：PCR技术技术启示：寻找启示：寻找目的菌种目的菌种时要根据它对生存环境时要根据它对生存环境 的要求，到的要求，到相应的环境相应的环境中去寻找。中去寻找。原因：原因：因为热泉温度因为热泉温度707080800 0C C，淘汰了绝大多数微生物淘汰了绝大多数微生物 只有只有TaqTaq细菌被筛选出
3、来。细菌被筛选出来。该技术是一种在该技术是一种在体外体外 将少量将少量DNA大量复制大量复制 (PCR)的技术的技术，此项此项 技术要求使用耐技术要求使用耐高温高温(93930 0C C)的的DNADNA聚合酶聚合酶。.筛选菌株筛选菌株热泉热泉筛选方法：筛选方法：抑制大多数微生物的生长抑制大多数微生物的生长 促进促进目的菌株目的菌株的生长的生长2.2.实验室中微生物的筛选原理：实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于人为提供有利于目的菌株目的菌株生长的条件生长的条件(包括包括营养、温度、营养、温度、pHpH等等)，同时抑制或阻止其他，同时抑制或阻止其他微生物生长。微生物生长。结果：结果：培养一
4、定时间后，该菌数量上升，培养一定时间后，该菌数量上升，再通过再通过平板稀释平板稀释等方法对它进行等方法对它进行 纯化培养分离纯化培养分离。15.0g15.0g琼脂琼脂1.0g1.0g尿素尿素10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖0.2g0.2gMgSOMgSO447H7H2 2OO2.1g2.1gNaHNaH2 2POPO4 41.4g1.4gKHKH2 2POPO4 43.3.土壤中分解尿素的细菌的土壤中分解尿素的细菌的分离分离与与计数计数所需的所需的从物理性质看此培养基属于哪类？从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基固体培养基培养基培养基：在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳
5、源、氮源？碳源碳源：氮源氮源：培养基的培养基的氮源为尿素氮源为尿素，只有能合成，只有能合成脲酶脲酶的微生的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就就能够选择出分解尿素的微生物能够选择出分解尿素的微生物。4.4.培养基选择分解尿素的微生物的原理培养基选择分解尿素的微生物的原理:在微生物学中，将允许在微生物学中，将允许特定种类特定种类的微生物生长，的微生物生长，同时同时抑制或阻止其他种类抑制或阻
6、止其他种类微生物生长的培养基，微生物生长的培养基，叫做叫做选择培养基选择培养基选择培养基选择培养基:5.5.怎样证明怎样证明此培养基具有选择性呢此培养基具有选择性呢？以尿素为以尿素为唯一氮源唯一氮源的培养基的培养基牛肉膏牛肉膏蛋白胨蛋白胨培养基培养基是是分离分离尿素尿素细菌细菌判断该判断该培养基培养基有无选有无选择性择性实验组实验组对照组对照组培养基培养基 类型类型是否是否接种接种目的目的结果结果只生长只生长尿素细菌尿素细菌生长多种生长多种微生物微生物是是1 1、显微镜直接计数：、显微镜直接计数：利用利用血球计数板血球计数板(血细胞计数板血细胞计数板)，在显微镜，在显微镜下计算一定容积里样品中
7、微生物的数量。下计算一定容积里样品中微生物的数量。.统计菌落数目：统计菌落数目：不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点：缺点：2.2.间接计数法（间接计数法（活菌计数法）活菌计数法）原理：原理：在稀释度足够高时，微生物在固在稀释度足够高时，微生物在固 体培养基上所形成的体培养基上所形成的一个菌落一个菌落是是 由由一个单细胞一个单细胞繁殖而成的，即繁殖而成的，即一一 个菌落代表原先的一个单细胞。个菌落代表原先的一个单细胞。常用方法：稀释
8、涂布平板法。常用方法：稀释涂布平板法。每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数(C(CV)V)M M其中，其中，C C代表某一稀释度下平板上生长的平代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，均菌落数，V V代表涂布平板时所用的稀释液代表涂布平板时所用的稀释液的体积的体积(ml)(ml)，M M代表稀释倍数。代表稀释倍数。P23说明设置重复组的重要性。在在设设计计实实验验时时，一一定定要要涂涂布布至至少少3 3个个平平板板，作作为为重重复复组组，才才能增强实验的说服力与准确性能增强实验的说服力与准确性。在在分分析析实实验验结结果果时时，一一定定要要考考虑虑所所设设置置的的重重复复组组的的结结果果是是否
9、一致否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在3030 300300的平板上进行计数。的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个同一稀释度加到三个 或三个以上的平板中或三个以上的平板中，经涂布，培养计算出，经涂布，培养计算出 菌落平均数菌落平均数统计的菌落往往比活菌的实际数目低。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。注意事项注意事项某同学在稀释倍数为某同学在稀释倍数为10106 6 的培养基中测得平板上的培养基中测得平板上菌落数的平均数为菌落数
10、的平均数为234234，那么每克样品中的菌落，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml0.1ml）()()A.2.34A.2.3410108 8B.2.34B.2.3410109 9C.234C.234D.23.4 D.23.4 跟踪训练4B判断培养基中是否有杂菌污染判断培养基中是否有杂菌污染:(:(方法方法)将未接种的培养基同时同条件进行培养将未接种的培养基同时同条件进行培养判断选择培养基是否具有筛选作用判断选择培养基是否具有筛选作用:(方法方法)完全培养基完全培养基（营养成分齐全营养成分齐全）接种后培养接种后培养观察菌落数目。观察菌
11、落数目。主要目的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。结果的影响，提高实验结果的可信度。(三三)设置对照设置对照在做在做分解尿素的细菌分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的的筛选与统计菌落数目的实验时，实验时，A A同学从对应的同学从对应的10106 6倍稀释的培养基中倍稀释的培养基中筛选出大约筛选出大约150150个菌落，但是其他同学在同样的个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约稀释度下只选择出大约5050个菌落。个菌落。分析其原因分析其原因。原因：原因：土样不同土样不同培养基污染或操作失误培养基污染或操作失误(或者是混
12、入了其他或者是混入了其他 的含氮物质的含氮物质)操作实例操作实例解决方案解决方案小结：小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有通过这个事例可以看出，实验结果要有 说服力，对照的设置是必不可少的。说服力，对照的设置是必不可少的。方案一方案一方案一方案一：由其他同学由其他同学用与用与A A同学相同土样同学相同土样进行实验进行实验 方案二方案二方案二方案二：将将A A同学配制的培养基在不加土样的情况同学配制的培养基在不加土样的情况 下进行培养，作为空白对照，下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染以证明培养基是否受到污染。结果预测：结果预测：如果结果与如果结果与A A同学一致同学一致,则证
13、明则证明A A无误；无误；如果结果不同如果结果不同,则证明则证明A A同学存在操作同学存在操作 失误或培养基的配制有问题。失误或培养基的配制有问题。解决方案解决方案实验实验设计设计从从肥肥沃沃、酸酸碱碱度度接接近近中中性性的的湿湿润润土土壤壤中中取取样样。先先铲铲去去表表层层土土3 3 cmcm左左右右，再再取取样样，将将样样品品装装入入事先准备好的信封中。事先准备好的信封中。“微生物的天然培养基微生物的天然培养基”土壤土壤 一一 土壤取样土壤取样数量最大、种类最多数量最大、种类最多大约大约70%70%90%90%是细菌是细菌取土样用的取土样用的小铁铲小铁铲和和盛土样的的信封盛土样的的信封在使
14、用前在使用前 都要都要灭菌灭菌。二二 制备培养基制备培养基 初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此 选择了一个较宽的范围选择了一个较宽的范围:稀释倍数为稀释倍数为10103 310107 7。准备准备牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基和和选择培养基选择培养基。每个。每个 稀释度下需要稀释度下需要3 3个选择培养基，个选择培养基，1 1个牛肉膏蛋白个牛肉膏蛋白 胨培养基胨培养基.共需要共需要1515个选择培养基个选择培养基、5 5个牛肉膏个牛肉膏 蛋白胨培养基蛋白胨培养基、8 8个灭菌试管和个灭菌试管和1 1个灭菌移液管。个灭菌移液管。稀释相同倍数的菌液，
15、在牛肉膏蛋白胨培养基稀释相同倍数的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基 上生长的菌落数目应明显上生长的菌落数目应明显多于多于选择培养基上的选择培养基上的 数目，因此，数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对 照，用来判断照，用来判断选择培养基选择培养基是否起到了是否起到了选择作用选择作用。应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤10g10g10g10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行分离不同的
16、微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保证获得菌落数在目的：保证获得菌落数在目的：保证获得菌落数在目的：保证获得菌落数在30303030300300300300之间、适于计数的平板之间、适于计数的平板之间、适于计数的平板之间、适于计数的平板（三）样品的稀释（三）样品的稀释(P23P23)问题问题：为什么分离不同的微生物要采用不同的为什么分离不同的微生物要采用不同的 稀释度？测定土壤中
17、细菌的总量和测定稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定 土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用 的稀释范围相同吗？的稀释范围相同吗？原因原因：土壤中各类微生物的数量土壤中各类微生物的数量(单位单位:株株/g/g)是不同的。是不同的。结论：结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不同为获得不同类型的微生物，就需要按不同 的稀释度进行分离，同时还应当有针对性的稀释度进行分离，同时还应当有针对性 地提供选择培养的条件。地提供选择培养的条件。例例：在干旱土壤中的上层样本中：在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为好氧及兼性厌氧细菌数约为21852185万，万，放线菌数
18、约为放线菌数约为477477万，霉菌数约为万，霉菌数约为23.123.1万。万。.取样涂布取样涂布实验时要实验时要对培养皿作对培养皿作好标记。注好标记。注明培养基类明培养基类型、培养时型、培养时间、稀释度、间、稀释度、培养物等。培养物等。如果得到了如果得到了2 2个或个或2 2个以上菌落数目在个以上菌落数目在3030300300的的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。，需要重新实验。.微生物的培养
19、与观察微生物的培养与观察在菌落计数时，每隔在菌落计数时，每隔24h24h统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。培养不同微生物往往需要不同培养温度。培养不同微生物往往需要不同培养温度。细细 菌：菌：30303737培养培养1 12d2d 放线菌：放线菌：25252828培养培养5 57d7d 霉霉 菌：菌：25252828的温度下培养的温度下培养3 34d4d。微生物的培养与观察微生物的培养与观察 一一 无菌操作无菌操作1.1.取土用的小铁铲的盛土
20、样的信封在使用前都取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都 需要灭菌。需要灭菌。2.2.应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的 土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。3.3.在稀释土壤溶液的过程中，在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。每一步都要在火焰旁操作。二二 做好标记做好标记 注明培养基种类、培养日期、注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。平板培养样品的稀释度等。三三 规划时间规划时间操作提示操作提示1.1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数 偏高；偏高；若培养物混入
21、其他氮源，则菌落形态多样，菌若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌 落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。2.2.选择每个平板上长有选择每个平板上长有3030300300个菌落的稀释倍个菌落的稀释倍 数计算每克样品的菌数最合适。数计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬不能相差悬 殊，如相差较大，表示实验不精确殊，如相差较大，表示实验不精确结果分析与果分析与评价价1.1.在以在以尿素尿素为唯一氮源的培养基中加入为唯一氮源的培养基中加入酚酚 红红指示剂。培养某种细菌后，如果指示剂。培养某种细菌后，如果
22、PHPH升升 高，指示剂将高，指示剂将变红变红，说明该细菌能够分，说明该细菌能够分 解尿素。为什么？解尿素。为什么？2.2.测定饮水中大肠杆菌数量的方法是：测定饮水中大肠杆菌数量的方法是：将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到将滤膜放到 伊红伊红-美蓝美蓝 培养基上培养，培养基上培养，大肠杆菌大肠杆菌菌落呈现黑色菌落呈现黑色，通过记算得出，通过记算得出 水样中大肠杆菌的数量。水样中大肠杆菌的数量。五五.课外延伸课外延伸大肠杆菌呈深紫色大肠杆菌呈深紫色,中心有或无金属光泽中心有或无金属光泽大肠杆菌在伊大肠杆菌在伊红美蓝琼脂红美蓝琼脂(EMB)(EMB)上典型特征上典型特征 本课题知识小结本课题知识小结: