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1、微生物检验技术及硬件选择微生物检验技术及硬件选择中国工业微生物菌种保藏管理中心中国工业微生物菌种保藏管理中心 CICC姚粟姚粟医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 内容内容n微生物纯培养分离技术微生物纯培养分离技术n微生物检验技术及硬件设备微生物检验技术及硬件设备医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物纯培养分离技术微生物纯培养分离技术n纯培养物是指来源于同一单细胞的细胞群体。n获得纯培养物对微生物学研究至关重要。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物纯培养分离技术微生物纯培养分离技术涂布平板法平板划线法平板倾注法稀释摇管法液体培
2、养基分离法单细胞（孢子）分离法选择培养基分离法医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 涂布平板法涂布平板法1、少量样品加到平板中央（1mL）；2、玻璃三角涂棒浸入酒精；3、沾有酒精的涂棒在火焰上灼烧后使其冷却；4、无菌涂棒将样品均匀涂布琼脂培养基表面，适当条件下培养。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 平板划线法平板划线法斜线法曲线法方格法放射法四格法医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 平板划线法平板划线法斜线法：斜线法：用接种环以无菌操作挑取菌悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3-4条，再转动培养皿70角，并将接种环上剩余物
3、烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同法通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和第四次平行划线。曲线法曲线法：将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 平板划线法平板划线法血琼脂平板上的金黄色葡萄球菌（大的金黄色菌落）在划线过程中，细胞逐渐分散，培养后可形成单个菌落。成功获得纯培养物依赖于样品中混合在一起的细胞是否有效的被相互分开。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 平板倾注法平板倾注法对起始样品进行连续10倍稀释，将高稀释倍数的样品与冷却至适当温度的溶化琼脂培养基倒入无菌平皿后混合均匀，培养后获
4、得单菌落。培养基表面菌落为圆形，而培养基内部菌落呈豆状或透镜状。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 稀释摇管法稀释摇管法n适合厌氧菌的纯培养分离无菌琼脂培养基试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在50左右 梯度稀释后的待分离菌株加入试管中 摇匀、冷凝在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物 培养后，菌落形成在琼脂柱的中间 医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 液体培养基分离液体培养基分离不能在固体培养基上生长的微生物仍需要用液体培养基分离来获得纯培养。稀释法是液体培养基分离纯化常用的方法。在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过95%）表现为
5、不生长。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 单细胞（孢子）分离单细胞（孢子）分离单细胞（或单孢子）分离法是采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养。较大的微生物，可采用毛细管提取单个个体。个体相对较小的微生物，需采用显微操作仪，在显微镜下用毛细管或显微针、钩、环等挑取单个微生物细胞或孢子以获得纯培养。单细胞分离法对操作技术有比较高的要求。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 选择培养基分离选择培养基分离n选择培养基特性促生长能力抑制能力指示（鉴别）能力医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 选择培养基分离选择
6、培养基分离传统传统选择性培养基选择性培养基n血平板：血平板：适于各类细菌的生长，一般细菌检验标本的分离，都应接种此平板。n营养肉汤：营养肉汤：用于标本及各类细菌的增菌n巧克力血平板：巧克力血平板：其中含有V和X因子，适于接种疑有嗜血杆菌、奈瑟菌等的标本。n中国蓝平板或伊红美蓝平板：中国蓝平板或伊红美蓝平板：可抑制G+细菌，有选择地促进G-菌生长，是较好的弱选择性培养基。n麦康凯平板：麦康凯平板：具中等强度选择性，抑菌力略强，有较少革兰阴性菌不生长。nSS琼脂：琼脂：有较强的抑菌力，用于志贺菌和沙门菌的分离。n碱性琼脂：碱性琼脂：用于从粪便中分离霍乱弧菌及其它弧菌。医疗器械无菌检验员操作实务与洁
7、净室管理，北京，2012 选择培养基分离选择培养基分离n新型显色培养基显色培养基利用微生物自身代谢产生的利用微生物自身代谢产生的酶与相应显色底物反应显色酶与相应显色底物反应显色的原的原理来检测微生物的培养基。理来检测微生物的培养基。OrganismEnzyme Substrate Color Coliforms-galactosidaseX-GALBlue Escherichia coli-galactosidase-Glucuronidase MUGfluorescenceEscherichia coli O157-galactosidaseX-GALBlue医疗器械无菌检验员操作实务与洁净
8、室管理，北京，2012 微生物菌种检验技术微生物菌种检验技术采用多相鉴定技术确定菌株的分类地位采用多相鉴定技术确定菌株的分类地位采用菌株分型技术进行污染菌溯源分析采用菌株分型技术进行污染菌溯源分析医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物菌种检验技术微生物菌种检验技术n分类等级界（Domain）门（Phylum）纲（Class）目（Order）科（Family）属（Genus）种（Species）三界系统三界系统细菌细菌真核生物真核生物古菌古菌“种种”：微生物基本分类单元：微生物基本分类单元医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物菌种检验技术微生物菌种
9、检验技术“种种”的定义：一个种（基因型种）是有相似的定义：一个种（基因型种）是有相似G+C组成并通过组成并通过DNA杂交试验判断有杂交试验判断有70%或更大相似或更大相似性的菌株的集合。性的菌株的集合。种的鉴定：种的鉴定：确定新的分离物属于已知确定新的分离物属于已知分类单元分类单元“种种”的过程。的过程。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物菌种检验技术微生物菌种检验技术微生物菌种检验微生物菌种检验微生物微生物菌种鉴定菌种鉴定目标菌检验：它是不是某一种菌目标菌检验：它是不是某一种菌?菌种鉴定菌种鉴定:它是什么菌？（未知菌）它是什么菌？（未知菌）控制菌：控制菌：大肠埃希菌
10、（Escherichia coli）大肠菌群（Coliform）沙门菌（Salmonella）铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）梭菌（Clostridium）白假丝酵母（Candida albicans）致病菌：致病菌：大肠埃希菌（Escherichia coli）大肠菌群（Coliform）沙门菌（Salmonella）金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）阪岐肠杆菌（Enterobacter sakazaki）致贺
11、氏菌（Shigella）副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）规范的检测鉴定方法规范的检测鉴定方法中国药典中国药典GB/T 4789.3-4.5.6.7.9.10.13.14.30.40常规鉴定、多相鉴定常规鉴定、多相鉴定医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 常规鉴定常规鉴定n掌握菌株的基本特征，如细胞的形状、革兰氏染色及其他形态学特征；营养类型、需氧性等生理生化特征。n在此基础上根据分类（鉴
12、定）手册，确定菌株属于哪一大类（群、组），进行特征测定。n根据测定结果逐步缩小菌株的归属范围，初步确定科、属。n进一步测定种的鉴别特征。n如鉴定结果涉及新的分类单元，则进行包括基因型在内的全面鉴定。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 用于鉴定的形态学特征用于鉴定的形态学特征特征特征微生物类群微生物类群细胞形状所有主要类群细胞大小所有主要类群菌落形态所有主要类群超微结构特征所有主要类群染色行为细菌、一些真菌纤毛和鞭毛所有主要类群运动机制滑行细菌，螺旋体内生孢子形状和位置形成内生孢子细菌孢子形态和位置细菌、藻类、真菌细胞内含物所有主要类群颜色所有主要类群医疗器械无菌检验员操作实
13、务与洁净室管理，北京，2012 用于鉴定的生理生化特征用于鉴定的生理生化特征碳源和氮源运动性细胞壁组成渗透耐性能源氧关系发酵产物最适pH和生长范围一般营养类型光合作用色素最适生长温度和范围盐需求及耐性发光次级代谢产物形成能量转换机制对代谢抑制剂和抗生素的敏感性贮藏内含物医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 基因型鉴定技术基因型鉴定技术nG+Cmol%n16S rDNA,26S rDNA D1/D2,5.8S rDNA ITS region,n-tubulin gene,calmodulin gene,gyrA gene,pheS gene and other housekee
14、ping genes.nDNA Barcoding gene sequence analysis,MultiLocus Sequence Analysis(MLSA)nDNA-DNA hybridizationnRAPD,RFLP,AFLP,SSCP,DGGE,LAMP,rep PCR.医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 基因型分析鉴定水平基因型分析鉴定水平n不同指纹图谱和不同指纹图谱和DNA分析技术的鉴定水平分析技术的鉴定水平多相鉴定技术多相鉴定技术Polyphasic Identification Technology医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，201
15、2 微生物菌种鉴定技术微生物菌种鉴定技术n表征（表型）特征表征（表型）特征形态特征生理和代谢特征生态特征n遗传（基因型）特征遗传（基因型）特征蛋白质比较核酸碱基组成核酸序列 Erko Stackebrandt,DSMZ,Braunschweig,Germany医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 nCMCC(F)98003 标准菌株CMCC(F)98003保藏于中国医学细菌菌种保藏管理中心。2005年开始,CMCC(F)98003作为丝状真菌的代表菌株被中国药典(第8版)指定为标准菌株。多相鉴定实例多相鉴定实例 CMCC(F)98003 医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理
16、，北京，2012 n形态学鉴定CYA培养基,25C培养7 dnBiologBiolog鉴定生长浊度试验nITS rDNAITS rDNA区序列分析ITS4:5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3ITS5:5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3n-微管蛋白基因序列分析Bt2a:5-GGTAACCAAATCG GTGCTGCTTTC-3Bt2b:5-ACCCTCAGTGTAGT GACCCTTGGC-3反反应应体系：体系：100 L,10 扩增缓冲液10 L;DNA模板1 L;dNTP(每种2.5 mmol/L)8 L;引物(10 L/L)各2.5 L;Taq DNA聚合酶
17、(2.5 U/L)1.3 L;无菌超纯水补足总体积100 L。反反应应程序：程序：94C 5 min;94C 1 min,55C 1 min,72C 1 min,30个循环;72C 10 min,4C保存。多相鉴定实例多相鉴定实例 CMCC(F)98003 医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 n形态学鉴定图 2525C C培养7 d7 d菌种的宏观形态和显微形态Fig Macromorphology and micromorphology on 25Fig Macromorphology and micromorphology on 25C,7 dC,7 d注:A菌落形态;
18、B:分生孢子梗形态(100);C:分生孢子形态(400).Note:A:Colony morphology,B:Conidiophore morphology(100);C:Conidial morphology(400).该菌株的形态学特征符合黑曲霉A.niger的形态特征多相鉴定实例多相鉴定实例 CMCC(F)98003 医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 nBiolog鉴定注:没有生长;+:生长旺盛;w:微弱(边界)生长;v:可变.Note:No growth;+:Strong growth;w:Weak growth;v:Varied growth.表表 碳源利用情
19、况碳源利用情况Table Carbon Source Utilization碳源Carbon sourceATCC16888Aspergillus nigerATCC16404Aspergillus brasiliensis CMCC(F)98003麦芽糖Maltose+-甲基-D-葡萄糖苷-Methyl-D-Glucoside+D-海藻糖D-Trehalose+L-苹果酸L-Malic Acidv+-酮戊二酸-Ketoglutaric acidw苦杏仁苷Amygdalin+D-果糖D-Fructose+v+多相鉴定实例多相鉴定实例 CMCC(F)98003 医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室
20、管理，北京，2012 nITS rDNA区序列分析图 CMCC(F)98003CMCC(F)98003的ITS rDNAITS rDNA区序列和-微管蛋白基因序列PCRPCR扩增结果Fig ITS rDNA and-tubulin gene PCR Fig ITS rDNA and-tubulin gene PCR amplification results of CMCC(F)98003amplification results of CMCC(F)98003注:M:DL2000 marker;1:ITS rDNA区PCR扩增结果;2:-微管蛋白基因PCR扩增结果.Note:M:DL2000
21、 marker;1:ITS rDNA PCR amplification result;2:-tubulin gene PCR amplification result.表表 ITS序列特殊位点碱基差异序列特殊位点碱基差异Table Difference of base position in ITS sequence碱基位点Base position140166172173Aspergillus brasiliensis IMI 381727CCTCAspergillus niger ATCC 16888ATAACMCC(F)98003ATAA注:以18S和ITS1区之间的TTACCG序列中
22、的第一个“C”为1位点.Note:The first C in the border sequence(TTACCG)of 18S and ITS1 is here defined as position 1.多相鉴定实例多相鉴定实例 CMCC(F)98003 医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 nITS rDNA区序列分析图 基于ITS区rDNA序列的黑色组曲霉的NJ系统发育树Fig A Neighbor Joining Tree of Aspergillus section Nigri.based on Their ITS DNA Sequences注:图中发育树节点只
23、显示Bootstrap值大于50%数值,图例为遗传距离.Note:Numbers above branches are bootstrap values.Only values above 50%are indicated.Bar,genetic distance.CMCC(F)98003与与A.niger ATCC 16888聚类在分类距离最近的一个分支上,序列相似性达100%。CMCC(F)98003与黑色组的其他种序列同源性也具有很高的相似性,序列同源性均在98.6%100%之间。多相鉴定实例多相鉴定实例 CMCC(F)98003医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 n
24、-微管蛋白基因序列分析图 基于-微管蛋白基因序列的黑色组曲霉的NJ系统发育树Fig Neighbour-joining tree based on-tubulin sequence data of Aspergillus section Nigri注:图中发育树节点只显示Bootstrap 值大于50%数值,图例为遗传距离.Note:Numbers above branches are bootstrap values.Only values above 50%are indicated.Bar,genetic distance.CMCC(F)98003与黑曲霉A.niger CBS554.6
25、5T序列同源性为100%。CMCC(F)98003与黑色组的其他种序列同源性均在94.7%以下。多相鉴定实例多相鉴定实例 CMCC(F)98003医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 n结合形态学、碳源利用情况和ITS rDNA序列系统发育分析等多相鉴定的结果,将CMCC(F)98003鉴定为黑曲霉（Aspergillus niger）。多相鉴定实例多相鉴定实例 CMCC(F)98003医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 微生物菌种鉴定新技术及设备微生物菌种鉴定新技术及设备n微生物快速鉴定技术微生物快速鉴定技术MLSAPCR-SSCPPCR-DGGEPFG
26、EFT-IRREAL-TIME PCRLAMPn菌株快速鉴定系统菌株快速鉴定系统BIOLOG Automatic Identification SystemVITEKVIDAS DiversiLabRiboprinter ABI-(MicroSeq)医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 MLSA(Multilocus Sequences Analysis)nMLST技术通过测序技术揭示看家基因的等位基因突变来对菌株进行分型和鉴定。n看家基因(housekeeping gene)几乎都存在保守性，但不同的种或菌株间又存在差异即变异性。n关键点:菌种的选择、基因位点的选择、特异引
27、物的设计。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 PCR-SSCPnPCR-SSCP(Polymerase chain reaction single strand conformation polymorphism)是聚合酶链式反应与单链DNA 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术相结合的一种用于检测基因突变的方法。n利用不同构象单链DNA 在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中泳动速率的差异,能快速有效地检测出DNA短片段中存在的单核苷酸突变。nPCR-SSCP已广泛应用于各种基因多态性的研究。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 PCR-DGGEn变性梯度凝胶电泳（DGG
28、E）是根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统，在碱基序列存在差异的DNA双链解链时需要不同的变性剂浓度，一旦解链，在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳行为将发生很大的变化。n将PCR得到的等长DNA片段在含有变性剂梯度的凝胶中进行电泳，序列不同的DNA片段就会在各自相应的变性剂浓度下变性，发生空间构型的变化，染色后在凝胶上呈现为分开的条带，每个条带代表一个特定序列的DNA片段。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 PCR-DGGE医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 PFGEnPFGE(Pulsed Field Gel Electrophoresis)脉冲场凝胶电
29、泳应用于分离纯化大小在10-2000kb之间的DNA片段。n电泳在两个不同方向的电场周期性交替进行，DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间依赖于分子大小，DNA越大，构象改变需要时间越长，在凝胶移动中越慢。n大小不同的DNA片段被分离。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 FT-IRn应用傅里叶变换红外光谱方法（FT-IR）结合多变量统计分析的手段，可以实现对菌种进行分类和鉴别。n核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物等细胞大分子物质的结构和组成信息可以反映在红外光谱图上。n细菌细胞的生化物质的某些功能基团的差异可以成为区分和鉴定不同菌株的基础。n在菌种(species)
30、甚至菌株(strain)水平上提供鉴别结果。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 FT-IR路春霞、刘源、孙晓红等，应用傅里叶变换红外光谱区分鉴定四种食源性致病菌的研究，化学学报，2011年第69卷，第1期，101-105医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 REAL-TIME PCRnReal-time PCR实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 LAMPnLAMP(Loop-mediated I
31、sothermal Amplification)核酸环介导等温扩增技术主要是针对靶基因的6个不同的区域，设计4种引物。n在恒定温度下（65C）进行扩增反应。n操作简单、快速高效、高特异性和高灵敏度。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 BIOLOG 鉴定系统鉴定系统MicrostationOmnilog医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 VITEK生化鉴定系统生化鉴定系统nVITEK对细菌的鉴定是以每种细菌的微量生化反应为基础，不同种类的VITEK试卡（检测卡）含有多种的生化反应孔。n目前VITEK系统的检测卡微生物常用的有7种，即：革兰氏阳性菌鉴定卡（G
32、PI）、革兰氏阴性菌卡（GNI+）、非发酵菌卡（NFC）、酵母菌卡（YBC）、厌氧菌卡（ANI）、芽胞杆菌卡（BAC）、奈瑟氏菌嗜血杆菌卡（NHI），以及药敏检测卡等。n可鉴定405种细菌。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 VIDAS病原菌鉴定系统病原菌鉴定系统n应用酶联免疫法，检测测蓝色荧光（ELFA）抗原（细菌、蛋白）的含量与标本中抗原的含量成正比。n测试范围：沙门氏菌、李斯特菌、单核细胞增生李斯特菌、葡萄球菌肠毒素、大肠埃希菌O157、弯曲菌、免疫浓缩沙门氏菌、免疫浓缩大肠埃希菌O157。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 基于基于Rep-PCR
33、重复序列聚合酶扩增反应重复序列聚合酶扩增反应genome1.1.rep-PCR引物与许多分布在整个基因组上的、特异性的重复序列配对rep-PCR primers2.2.经过PCR扩增形成多个不同长短的片段3.这些扩增的片段根据其质量差异，经电泳被分离(+)(-)4.得到由多条带组成的、强弱不一的、专一性rep-PCR DNA指纹图谱指纹图谱 Size of amplified fragments(time)DiversiLab菌株分型鉴定系统DiversiLab特定指纹图谱的形成特定指纹图谱的形成医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 Acinetobacter Aspergi
34、llusBacillus BifidobacteriumBordetella Burkholderia CampylobacterCandidaClostridiumC.perfringens Enterobacter Enterococcus EscherichiaHaemophilus Klebsiella LactobacillusLegionellaListeriaMycobacterium M.TuberculosisMycoplasmaNeisseriaNon-fermenterPropionibacteriumPseudomonasSalmonellaSerratia Shige
35、lla Staphylococcus Stenotrophomonas StreptococcusTricophytonMould/Moulddiscriminates Aspergillus,Fusarium,ZygomycetesDermatophytediscriminates Tricophyton,MicrosporumYeast/yeastdiscriminates Candida,SaccharomycesDiversiLab DNA指纹图谱试剂盒医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 Riboprinter 全自动微生物鉴定系统Riboprinter鉴定系统基于
36、核糖体分型技术。鉴定系统基于核糖体分型技术。为环境分离物、致病菌、有害生物体、质控菌株、有益生物体建立基因为环境分离物、致病菌、有害生物体、质控菌株、有益生物体建立基因指纹图库。指纹图库。可以鉴定到株水平。可以鉴定到株水平。医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012 ABI DNA鉴定系统(MicroSeq)n鉴定系统包括3500 xL DNA 测序仪、数据库分析软件、细菌和真菌试剂盒。n检测基因组上不同的区域16S,18S,23S,28S,5S,ITS 核糖体r-RNA 基因n其他特异基因组上的区域:n多位点序列分析(MLST)Multi locus sequence typingn扩增片段长度多态性(AFLP)AFLP-DNA Fingerprinting ABI