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1、1 关于常用分子生物学技术的原理及其应用第1页，讲稿共68张，创作于星期日2 分子杂交与印迹技术分子杂交印迹技术印迹技术的类别及应用1PARTMolecular Hybridization Blotting Technique第2页，讲稿共68张，创作于星期日3 在在DNA复复性性过过程程中中，如如果果把把不不同同DNA单单链链分分子子放放在在同同一一溶溶液液中中，或或把把DNA与与RNA放放在在一一起起，只只要要在在DNA或或RNA的的单单链链分分子子之之间间有有一一定定的的碱碱基基配配对对关关系系，就就可可以以在在不不同同的的分分子子之之间间形形成成杂杂化化双双链链(heteroduple
2、x)。一、分子杂交的原理1.核酸分子杂交核酸分子杂交(nucleic acid hybridization)第3页，讲稿共68张，创作于星期日4 2.杂化双链的形成杂化双链的形成第4页，讲稿共68张，创作于星期日5 二、印迹技术1.印迹技术印迹技术利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似等各种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为“blotting”，译为印迹技术。，译为印迹技术。第5页，讲稿共68张，创作于星期日6 2.印
3、迹技术流程印迹技术流程硝酸纤维素膜（NC）尼龙膜PVDF膜固定蛋白质，多糖和核苷酸第6页，讲稿共68张，创作于星期日7 用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针探针”，探针可，探针可以与固定在以与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。核酸分子存在。3.探针技术探针技术第7页，讲稿共68张，创作于星期日8 第8页，讲稿共68张，创作于星期日9 二、印迹技术的类别及应用Lipids脂类脂类Phosphomoieties磷酸基团磷
4、酸基团Glycoconjugates 复合糖复合糖第9页，讲稿共68张，创作于星期日10 1.DNA印迹印迹(Southern blotting)2.RNA印迹印迹(Northern blotting)3.蛋白质的印迹蛋白质的印迹(Western blotting)用于基因组用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。、重组质粒和噬菌体的分析。用于用于RNA的定性定量分析。的定性定量分析。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。二、印迹技术的类别及应用第10页，讲稿共68张，创作于星期日11 三三种种印印迹迹技技术术的的比比较较80杂交（紫外交联仪）第11页，讲稿共6
5、8张，创作于星期日12 1.DNA印迹印迹(Southern blotting)第12页，讲稿共68张，创作于星期日13 放放射射自自显显影影照照片片第13页，讲稿共68张，创作于星期日14 2.RNA印迹印迹(Northern blotting)Northern blot analysis of EGF and TGF-in the normal pancreas and pancreatic cancer.Nature Protocols 4,37-43(2008)The membrane was probed with the 32P-labeled EGF or TGF-cDNA an
6、d,as a loading control,the 7S cDNA.第14页，讲稿共68张，创作于星期日15 3.蛋白质的印迹蛋白质的印迹(Western blotting)沉淀沉淀化学发光化学发光荧光荧光第15页，讲稿共68张，创作于星期日16 4.其他：其他：4.1 斑点印迹斑点印迹(dot blotting)等位基因特异的寡核苷酸（Allele-specific oligonucleotide，ASO)镰状细胞性贫血sickle cell anemia 由编码血红蛋白（beta-hemoglobin）基因突变导致 第16页，讲稿共68张，创作于星期日17 4.2 原位杂交原位杂交(in
7、 situ hybridization)间接标记间接标记直接标记直接标记 2005 Nature Publishing Group Speicher,M.R.et al.人黑色素瘤组织切片：角蛋白Keratin 5（基底上皮细胞和细胞骨架）第17页，讲稿共68张，创作于星期日18 4.3 DNA芯片技术芯片技术(DNA array)第18页，讲稿共68张，创作于星期日19 PCR技术的原理与应用技术的原理与应用PCR工作原理PCR技术的主要用途2PARTThe Principle and Application of PCR Technology第19页，讲稿共68张，创作于星期日20 1.1
8、.聚合酶链式反应聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)(Polymerase Chain Reaction,PCR)一、PCR技术的工作原理1983年 27岁年轻科学家 Mullis发明获得了1993年的诺贝尔奖1969年Thomas D.Brock 报道了在黄石公园温泉中发现了一种新的细菌 Thermus aquaticus(Taq)1971年 DNA polymerase 从T.aquaticus 分离出来，这种酶可以在75 高温保持活性。第20页，讲稿共68张，创作于星期日21 5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15
9、5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 第21页，讲稿共68张，创作于星期日22 Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。第22页，讲稿共68张，创作于星期日23 2.PCR2.PCR技术原理示意图技术原理示意图 第23页，讲稿共68张，创作于星期日24 模板模板DNA特异性引物特异性引物耐热耐热DNA聚合酶聚合酶dNTPsMg2+3.PCR体系基本组成成分第24页，讲稿共68张，创作于星期日25 4.PCR的基本反应步骤的
10、基本反应步骤变性变性95C95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C第25页，讲稿共68张，创作于星期日26 PCR的原理 演示第26页，讲稿共68张，创作于星期日27 利利用用特特异异性性引引物物以以cDNA或或基基因因组组DNA为为模模板板获获得得已已知知目目的的基基因因片片段段,或或与与逆逆转转录录反反应应相相结结合合，直直接接以以组组织和细胞的织和细胞的mRNA为模板获得目的片段为模板获得目的片段从从cDNA文文库库或或基基因因组组文文库库中中获获得得序序列列相相似似的的新新基基因片段的主要方法因片段的主要方法二、二、PCR技术技术的主要用途的主要用途1.目的基因的克隆目的基因的克隆第27
11、页，讲稿共68张，创作于星期日28 利利用用PCR技技术术可可以以随随意意设设计计引引物物在在体体外外对对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。PCR技技术术高高度度敏敏感感，对对模模板板DNA的的量量要要求求很很低低，是是DNA和和RNA微微量量分分析析的的最最好好方法。方法。3.DNA和和RNA的微量分析的微量分析2.基因突变基因突变第28页，讲稿共68张，创作于星期日29 将将PCR技技术术引引入入DNA序序列列测测定定，使使测测序序工工作作大为简化，也提高了测序的速度；大为简化，也提高了测序的速度；待待测测DNA片片段段既既可可克克隆隆到到
12、特特定定的的载载体体后后进进行行序列测定，也可直接测定。序列测定，也可直接测定。PCR与与其其他他技技术术的的结结合合可可以以大大大大提提高高基基因因突突变检测的敏感性变检测的敏感性。4.DNA序列测定序列测定5.基因突变分析基因突变分析第29页，讲稿共68张，创作于星期日30 目的：从组织或细胞中获得目的基因从组织或细胞中获得目的基因 对已知序列对已知序列RNA进行定性和半定量进行定性和半定量1.逆转录逆转录PCR技术（技术（Reverse transcription PCR）三、几种重要的三、几种重要的PCR衍生技术衍生技术Crystallographic structure of HIV
13、-1 reverse transcriptase核酸酶核酸酶聚合酶聚合酶第30页，讲稿共68张，创作于星期日31 PCR的原理 演示第31页，讲稿共68张，创作于星期日32 HIV Retrovirus reverse transcription（optional）第32页，讲稿共68张，创作于星期日33 原位原位PCR方法将目的基因的扩增与定位相结合。方法将目的基因的扩增与定位相结合。2.原位原位PCR技术技术(in situ PCR)第33页，讲稿共68张，创作于星期日34 3.实时实时PCR技术技术通通过过动动态态监监测测反反应应过过程程中中的的产产物物量量，消消除除了了产产物堆积对定量
14、分析的干扰，亦被称为定量物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量PCR。QR3355上游上游引物引物下游下游引物引物荧光标记引物荧光标记引物RQ 3355第34页，讲稿共68张，创作于星期日35 3.1 3.1 实时实时PCR技术原理技术原理第35页，讲稿共68张，创作于星期日36 3.2 3.2 实时实时PCRPCR分类：分类：实时实时PCR非探针类非探针类 SYBR Green（DNA 小沟）小沟）探针类探针类1.TaqMan1.TaqMan探针法探针法 （累积荧光）（累积荧光）2.2.分子信标探针法分子信标探针法 （发卡结构）（发卡结构）3.FRET3.FRET探针法探针法 （实时可逆）（实
15、时可逆）第36页，讲稿共68张，创作于星期日37 第37页，讲稿共68张，创作于星期日38 TaqMan探针法实时PCR原理示意图第38页，讲稿共68张，创作于星期日39 PCR和Real time 的比较 演示第39页，讲稿共68张，创作于星期日40 基因文库基因文库基因组DNA文库cDNA文库3PARTGene Library第40页，讲稿共68张，创作于星期日41 基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library)cDNA文库文库(cDNA library)n基因文库基因文库(gene library)是指一个包含了某一生物体全部是指一个包含了某一生物体全部DNADNA
16、序列的序列的克隆群体。克隆群体。对基因结构和功能进行研究的第一步对基因结构和功能进行研究的第一步第41页，讲稿共68张，创作于星期日42 基因组基因组DNADNA文库是指生物的文库是指生物的基因组基因组DNA的信的信息（包括所有的编码区和非编码区）以息（包括所有的编码区和非编码区）以DNA片段形片段形式贮存的克隆群体。式贮存的克隆群体。用于构建基因组文库的载体有用于构建基因组文库的载体有 噬菌体、粘噬菌体、粘粒和酵母人工染色体等。粒和酵母人工染色体等。一、基因组一、基因组DNA文库文库第42页，讲稿共68张，创作于星期日43 1.1.基因组文库和基因组文库和cDNA文库的构建和筛选文库的构建和
17、筛选20kb第43页，讲稿共68张，创作于星期日44 第一轮筛选第一轮筛选第二轮筛选第二轮筛选第三轮筛选第三轮筛选2.2.基因组文库筛选结果举例基因组文库筛选结果举例第44页，讲稿共68张，创作于星期日45 二、二、cDNA文库文库cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条件文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部下所表达的全部mRNAmRNA经逆转录而合成的经逆转录而合成的cDNA序序列列的克隆群体，它以的克隆群体，它以cDNA片段的形式贮存着该组片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。织细胞的基因表达信息。第45页，讲稿共68张，创作于星期日46 纳米抗体噬菌体文库的构建纳米抗体噬菌体
18、文库的构建第46页，讲稿共68张，创作于星期日47 生物淘筛生物淘筛M13 phage第47页，讲稿共68张，创作于星期日48 生物芯片技术生物芯片技术基因组DNA文库cDNA文库4PARTBiological Chip Technique第48页，讲稿共68张，创作于星期日49 是指将许多特定的是指将许多特定的DNADNA片段有规律地紧密排列片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检扫描
19、，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。该技术亦被称作该技术亦被称作DNA微阵列微阵列(DNA microarray)。一、基因芯片一、基因芯片1.1.基因芯片基因芯片(gene chip)第49页，讲稿共68张，创作于星期日50 2.2.基因芯片工作流程示意图基因芯片工作流程示意图Heatmap第50页，讲稿共68张，创作于星期日51 DNA microarray的原理 演示第51页，讲稿共68张，创作于星期日52 是是将将高高度度密密集集排排列列的的蛋蛋白白分分子子作作为为探探针针点点阵阵固固定定
20、在在固固相相支支持持物物上上，当当与与待待测测蛋蛋白白样样品品反反应应时时，可可捕捕获获样样品品中中的的靶靶蛋蛋白白，再再经经检检测测系系统统对对靶靶蛋蛋白白进进行行定定性性和定量分析的一种技术。和定量分析的一种技术。二、蛋白质芯片二、蛋白质芯片蛋白质分子间的亲和反应蛋白质分子间的亲和反应1.蛋白质芯片蛋白质芯片(protein chip)2.蛋白质芯片蛋白质芯片作用原理作用原理第52页，讲稿共68张，创作于星期日53 Protein microarray的原理 演示第53页，讲稿共68张，创作于星期日54 生物大分子相互作用研生物大分子相互作用研究技术究技术蛋白质相互作用研究技术DNA蛋白质
21、相互作用分析技术5PARTThe Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study第54页，讲稿共68张，创作于星期日55 一、蛋白质相互作用研究技术一、蛋白质相互作用研究技术为什么研究蛋白质相互作用？为什么研究蛋白质相互作用？研究蛋白质复合物研究蛋白质复合物DNA的复制和转录的复制和转录蛋白质的合成和分泌蛋白质的合成和分泌信号转导和代谢信号转导和代谢第55页，讲稿共68张，创作于星期日56 标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质理的、分析蛋白质体外体外直接相互作用直
22、接相互作用的方法。的方法。1.亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）应用：应用：证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合分析两种分子结合的具体结构部位分析两种分子结合的具体结构部位筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子 第56页，讲稿共68张，创作于星期日57 标签融合标签融合蛋白沉淀蛋白沉淀实验流程实验流程示意图示意图第57页，讲稿共68张，创作于星期日58 2.2.酵母双杂交技术的基本原理酵母双杂交技术的基本原理和用途和用途利用酵母转录激活因子利用酵母转录激活因子 GAL4的生物特性的生
23、物特性 DNA结合区（结合区（binding domain，BD）促进转录的活性区（促进转录的活性区（activation domain，AD）基因表达激活基因表达激活第58页，讲稿共68张，创作于星期日59 酵母双杂交技术的基本原理演示酵母双杂交技术的基本原理演示第59页，讲稿共68张，创作于星期日60 酵母双杂交系统的应用酵母双杂交系统的应用证明两种证明两种已知基因序列已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物的蛋白质可以相互作用的生物信息学推测。信息学推测。分析分析已知存在相互作用已知存在相互作用的两种蛋白质分子的相互作用的两种蛋白质分子的相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。功能结构域或关
24、键的氨基酸残基。将拟研究的蛋白质的编码基因与将拟研究的蛋白质的编码基因与BD基因融合成为基因融合成为“诱饵诱饵”表达质粒，可以筛选表达质粒，可以筛选AD基因融合的基因融合的“猎猎物物”基因表达文库，筛选基因表达文库，筛选未知的相互作用蛋白质未知的相互作用蛋白质。第60页，讲稿共68张，创作于星期日61 二、二、DNA-蛋白质相互作用分子分析技术蛋白质相互作用分子分析技术为什么研究为什么研究DNADNA和蛋白质相互作用？和蛋白质相互作用？研究研究DNA-蛋白质复合物蛋白质复合物基因表达的基础基因表达的基础研究基因表达调控的机制研究基因表达调控的机制研究对象研究对象转录因子所结合的特定转录因子所结
25、合的特定DNA序列序列基因的调控序列所结合的蛋白质基因的调控序列所结合的蛋白质第61页，讲稿共68张，创作于星期日62 Electrophoretic mobility shift assay，EMSADNADNA结合蛋白与相应结合蛋白与相应DNA序列间的相互作序列间的相互作可以做定性和定量分析可以做定性和定量分析是转录因子研究的经典方法。是转录因子研究的经典方法。研究研究RNA结合蛋白和特定结合蛋白和特定RNA序列间的相互作用。序列间的相互作用。1.电泳迁移率变动测定电泳迁移率变动测定核心：蛋白质与核心：蛋白质与DNA探针结合会增大其分子量探针结合会增大其分子量第62页，讲稿共68张，创作于
26、星期日63 放放射射自自显显影影未结合探针未结合探针结合有蛋白的探针结合有蛋白的探针标记探针标记探针1X1X1X1X核蛋白提取物核蛋白提取物1X10X10X未标记探针未标记探针10Xn凝胶迁移实验结果示意图凝胶迁移实验结果示意图第63页，讲稿共68张，创作于星期日64 Chromatin immunoprecipitation assay,ChIP（二）染色质免疫沉淀法（二）染色质免疫沉淀法是目前可以研究体内是目前可以研究体内DNA与蛋白质相互作用的主要方法与蛋白质相互作用的主要方法1.活细胞状态中固定活细胞状态中固定DNA-蛋白质复合物蛋白质复合物2.随机切断为短染色体片段随机切断为短染色体
27、片段3.免疫学方法沉淀复合物免疫学方法沉淀复合物第64页，讲稿共68张，创作于星期日65 n染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图第65页，讲稿共68张，创作于星期日66 1.1.掌掌握握印印迹迹技技术术的的原原理理、类类别别及及用用途途；Southern、Western印印迹迹技技术术的的基基本实验流程；探针的概念、种类与标记本实验流程；探针的概念、种类与标记2.2.熟悉：熟悉：Northern印迹法的基本实验流程及用途印迹法的基本实验流程及用途3.3.掌握：掌握：PCR技术的工作原理、基本反应步骤和主要用途；技术的工作原理、基本反应步骤和主要用途；4 4 逆转
28、录逆转录PCR、原位、原位PCR、实时、实时PCR技术的原理及应用技术的原理及应用大纲知识点要求：大纲知识点要求：第66页，讲稿共68张，创作于星期日67 5.5.掌握：基因文库的概念、种类及用途掌握：基因文库的概念、种类及用途 6.6.了解：基因组了解：基因组DNA文库、文库、cDNA文库构建的基本过程文库构建的基本过程7.掌掌握握：基基因因芯芯片片的的概概念念、工工作作的的基基本本原原理理及及用用途途；蛋蛋白白质质芯芯片片的概念、工作原理及用途的概念、工作原理及用途8.了解：基因芯片、蛋白质芯片的基本过程工作流程了解：基因芯片、蛋白质芯片的基本过程工作流程9.掌掌握握：标标签签蛋蛋白白沉沉淀淀、酵酵母母双双杂杂交交的的原原理理和和用用途途；EMSA、ChIP的的原原理和用途；理和用途；大纲知识点要求：大纲知识点要求：第67页，讲稿共68张，创作于星期日68 2023/4/22023/4/2感谢大家观看第68页，讲稿共68张，创作于星期日