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1、分子生物学常用技术及其应用分子生物学常用技术及其应用一基因工程的基本概念DNA重组不同来源的DNA分子通过末端共价连接而形成重新组合的DNA分子的过程。基因工程采用人工方法将不同来源的DNA进行重组，并将重组后的DNA引入宿主细胞中进行增殖或表达的过程。生物技术包括基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程。克隆通过无性繁殖所产生的与亲代完全相同的子代群体。二、工具酶限制性核酸内切酶：能从中间有选择性地切割DNA分子特异序列。DNA连接酶DNA聚合酶逆转录酶多核苷酸激酶碱性磷酸酶末端脱氧核苷酸转移酶三、载体载体必须符合以下几点要求：（1）能在宿主细胞内复制并具有较高的拷贝数（2）容易进入宿主细胞（
2、3）具有多个限制性核酸内切酶单一的酶切位点（4）容易从宿主细胞中分离纯化（5）有容易被识别筛选的标志常用的载体包括：质粒、噬菌体、粘粒、病毒由质粒与噬菌体构成四、重组DNA技术的基本原理 制备DNA片段，并通过载体将其导入受体细胞，在受体细胞中复制、扩增，以获得单一DNA分子的大量拷贝。五、重组DNA技术的基本过程（一）制备目的基因和载体；（一）制备目的基因和载体；（二）（二）DNADNA的重组；的重组；（三）重组（三）重组DNA导导入宿主细胞入宿主细胞（四）（四）DNA重组体的筛选和鉴定重组体的筛选和鉴定（五）（五）DNADNA重组体的重组体的 扩增和表达扩增和表达（一）目的基因的（一）目的
3、基因的 制备：制备：目目的的基基因因的的筛筛选选和和分分离离可可采采用用以以下下方方法法进行：进行：1直接从染色体直接从染色体DNA中分离：中分离：仅适用于原核生物基因的分离，较少采仅适用于原核生物基因的分离，较少采用。用。2人工合成人工合成：根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。合成。适应于编码小分子多肽的基因。3 从从 mRNA合合 成成cDNA：采采用用一一定定的的方方法法钓钓取取 特特 定定 基基 因因 的的mRNA，再再通通过过逆逆转转录录酶酶催催化化合
4、合成成其其互互补补DNA（cDNA），除除去去RNA链链后后，再再用用DNA聚聚合合酶酶合合成成其其互互补补DNA链链，从从而而得得到到双双链链DNA。这这一一方方法法通通常常可可得得到到可可表达的完整基因。表达的完整基因。4从基因文库中筛选：从基因文库中筛选：将将某某一一种种基基因因DNA用用适适当当的的限限制制酶酶切切断断后后，与与载载体体DNA重重组组，再再全全部部转转化化宿宿主主细细胞胞，得得到到含含全全部部基基因因组组DNA的的种种群群，称为称为G文库文库(genomic DNA library)。将将某某种种细细胞胞的的全全部部mRNA通通过过逆逆转转合合成成cDNA，然然后后转转
5、化化宿宿主主细细胞胞，得得到到含含全全部部表表达达基基因因的的种种群群，称称为为C-文文库库(cDNA library)。C-文库具有组织细胞特异性。文库具有组织细胞特异性。5利用利用PCR合成：合成：(聚合酶链反应）如如已已知知目目的的基基因因两两端端的的序序列列，则则可可采采用用聚聚合合酶酶 链链 反反 应应（polymerase chain reaction,PCR）技技术术，在在体体外外合合成成目目的的基基因。因。分子生物学常用技术及其应用分子生物学常用技术及其应用主要通过DNA连接酶和双链DNA粘性末端序列互补结合。1、粘性末端连接 利用同种限制性内切酶切开载体和DNA分子，能产生相
6、同的粘性末端，在T4连接酶作用下遍可互补。2、同聚物加尾连接 在酶的催化下人为在DNA链3末端添加多聚脱氧单核苷酸，制造粘性末端。3、平末端连接 在 T4 DNA连接酶的作用下，直接连接DNA平端末端，效率较低。4、人工接头连接在平端DNA末尾加上人工合成的具有限制性DNA内切酶的DNA片段，再用内切酶作用产生粘性末端。（三）将外源性DNA导入宿主细胞常用的方法两种：1、转化 转化指将质粒或其他外源性DNA导入处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。包括CaCl2制备感受态宿主细胞、法电穿孔法、显微注射法、基因枪法等2、感染 感染以噬菌体进入宿主细胞或病毒进入宿主细胞中繁殖的过程。用灭
7、活的噬菌体或病毒的蛋白质外壳包裹重组的DNA分子，使其进如宿主细胞。（四）目的基因的筛选和鉴定常用的方法包括：遗传学方法、免疫学方法、核酸杂交法、PCR、核苷酸序列测定、DNA限制内切酶图谱分析法等。遗传学法：载体经常带有抗药基因，利用含有该药物的培养基直接分离。分子杂交法：利用32P标记的探针与被检对象进行杂交鉴定。免疫学法：利用特异性抗体与基因表达产物结合的方法。（五）克隆基因的表达 不同的目的基因在真核和原核表达体系中表达结果不同。真核细胞可用于表达原核基因原核细胞表达的真核基因产物还需要进一步加工处理，如甲基化、糖基化、折叠六、基因工程在医学中的应用应用于医学基础研究疾病的诊断和基因治
8、疗生产基因工程药物：既可改造传统制药工业，提高产量，也可用于新蛋白类药物的生产。制造转基因动物：可用于药物蛋白生产、器官移植人类基因工程组计划蛋白质工程：通过基因工程改变蛋白质分子生物学常用技术及其应用核酸分子杂交依据两条单核苷酸链之间的碱基互补、变性和复性的原理，用已知碱基序列的单链核苷酸片段作为探针，检测待测样品中是否存在与其互补的同源核苷酸序列的方法。一、核酸分子杂交的基本原理探针核酸分子与变性的被检核酸分子复性，通过碱基互补的原则，形成杂交分子。探针必须带有标记，可用于定性和定量分析（二）核酸分子杂交的基本方法Southern印迹杂交 待测核酸是DNA片段，是DNA与DNA杂交，指将酶
9、切并经电泳分离的DNA片段固定在载体上，与探针进行杂交。Northern印迹杂交 待测核酸是RNA片段，指将待测RNA经分离后固定在载体上，与探针进行杂交。斑点及狭缝印迹杂交 直接将变性核酸固定在载体上，用探针进行杂交。优点是一张膜同时可用多种不同探针检测原位杂交 直接用探针和细胞内的核酸进行杂交三、探针的特征（一）探针的特征1、要带有标记物2、应是单链3、具有高度的特异性4、探针长段不一，短探针杂交速率快且特异性强5、标记的探针应具有高度的灵敏性、稳定、标记方法简便、安全（二）探针的种类与制备1、基因组DNA探针直接从基因组分离2、cDNA探针通过逆转录生成3、寡核苷酸探针人工聚合成4、RN
10、A探针转录生成（三）探针的标记物放射性标记物：32P、35S、3H、125I、131I非放射性标记物：生物素、地高辛、荧光素、酶（四）标记方法体内标记法：将标记物掺入培养基体外标记法：化学法或酶法分子生物学常用技术及其应用聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR）体外体外高效、快速、特异高效、快速、特异地扩增地扩增 目的基因或目的基因或DNA片段的技术。片段的技术。分子生物学常用技术分子生物学常用技术及其应用及其应用其原理类似于其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适条件的体外合成提供一种合适条件模板模板DNA，寡核苷酸引物，寡核苷酸引物，D
11、NA聚合酶，合适的缓冲液系聚合酶，合适的缓冲液系统和统和DNA变性、复性及延伸的温度与时间等，使变性、复性及延伸的温度与时间等，使目的目的DNA得以迅速扩增得以迅速扩增 DNA的体内复制：的体内复制：原料：原料：模板模板DNA（基因组基因组DNA），），随机小分子随机小分子RNA引物，引物，dNTPs酶：酶：DNA聚合酶，解旋酶，引发酶聚合酶，解旋酶，引发酶反应条件：反应条件：胞液环境，胞液环境，37 反应过程：反应过程：模板模板DNA解旋、引发体的解旋、引发体的形成、延长形成、延长（三阶段）（三阶段）产物：产物：模板模板DNA（基因组基因组DNA）拷）拷贝数增加贝数增加一倍一倍 原料：原料：
12、模板模板DNA（基因组基因组DNA，cDNA）一对一对特异性特异性寡核苷酸引物，寡核苷酸引物，dNTPs酶：酶：Taq DNA聚合酶聚合酶反应条件：反应条件：合适的缓冲液，三种合适的缓冲液，三种变化的变化的温度温度（94，50-70，72），一定的），一定的循环循环数数（25-35）反应过程：反应过程：DNA模板变性（解链）、模板变性（解链）、模板与引物退火模板与引物退火、引物延伸、引物延伸（三阶段，（三阶段，多循环多循环）产物：产物：目的目的DNA（特异性）拷贝数增加（特异性）拷贝数增加2 2n n倍倍.PCR分子生物学常用技术及其应用分子生物学常用技术及其应用与体内与体内DNA解链过程不同
13、，解链过程不同，PCR中作为模板的双链中作为模板的双链DNA是通过是通过95左右的高温使其发生变性，形成单链左右的高温使其发生变性，形成单链DNA 分子生物学常用技术及其应用分子生物学常用技术及其应用 PCR通通常常需需要要两两条条寡寡核核苷苷酸酸链链作作为为DNA合合成成时时的的引引物物（primer）,这这两两个个引引物物分分别别与与待待扩扩增增模模板板DNA的的目目标标片片段段两两端端的的序序列列互互补补。在在降降低低温温度度的的过过程程中中（一一般般为为70-75 ，通通过过控控制制退退火火条条件件，引引物物就就能能准准确确地地与与扩扩增增区区域域的的两两端配对。端配对。primers
14、引物短，不易缠绕；引物短，不易缠绕；设计的引物是与模板设计的引物是与模板DNA两端序列互补；两端序列互补；引引物物的的量量远远大大于于模模板板分分子子的的量量，引引物物与与模模板板DNA形形成成双双链的几率远远高于链的几率远远高于DNA分子自身的复性。分子自身的复性。分子生物学常用技术及其应用分子生物学常用技术及其应用在在PCR反应体系中的反应体系中的DNA聚合酶，能够催化反应体系中游聚合酶，能够催化反应体系中游离的单核苷酸（离的单核苷酸（dNTPs）由引物）由引物53方向，按碱基配对方向，按碱基配对的原则延伸，形成两条与模板的原则延伸，形成两条与模板DNA互补的复制链互补的复制链。Taq 酶
15、酶dNTPSl 新合成的链又可作为下轮循环反应的模板新合成的链又可作为下轮循环反应的模板。热变性热变性-复性复性-延伸延伸的过程就是一个的过程就是一个PCR循环循环 每一循环后的模每一循环后的模板均比前一循环增加板均比前一循环增加1倍。理论上讲，扩增倍。理论上讲，扩增DNA产量是呈指产量是呈指数上升的，即数上升的，即n个循环后，产量为个循环后，产量为2n拷贝。而实际上，拷贝。而实际上，PCR的扩增倍数为的扩增倍数为（1+X）n，X为扩增效率，平均为为扩增效率，平均为75%热变性热变性-复性复性-延伸延伸25-35 次循环次循环百万倍扩增百万倍扩增尽管尽管PCR扩增扩增DNA非常有效，但目的非常
16、有效，但目的DNA序列的指数扩增序列的指数扩增并不是一个无限制的过程。并不是一个无限制的过程。在正常的反应条件下，经在正常的反应条件下，经30次循环之后，酶的催化反应趋于次循环之后，酶的催化反应趋于饱和，就会出现饱和，就会出现平台效应平台效应(Plateau)，产物的量不再增加。，产物的量不再增加。“平台效应平台效应”出现的迟早还取决于酶的性能、模板出现的迟早还取决于酶的性能、模板DNA的拷的拷贝数、贝数、dNTP浓度等多种因素。浓度等多种因素。RTPCR以mRNA为原始模板的PCR，亦称逆转录PCR。逆转录反应在42 进行，随后将反应混合物加热至95 5min，灭活逆转录酶，取2ul反应产物
17、，按DNA为模板的PCR反应步骤，进行扩增反应。三、三、PCRPCR在医学中的应用在医学中的应用 对人类遗传信息的认识和研究对人类遗传信息的认识和研究 基因工程药物与疫苗生产基因工程药物与疫苗生产 转基因动物和植物制造转基因动物和植物制造 基因诊断与基因治疗基因诊断与基因治疗镰刀型红细胞贫血镰刀型红细胞贫血 ChehabChehab等等设设计计一一对对引引物物把把含含有有突突变变的的DNADNA片片段段（共共294bp294bp）扩扩增增，扩扩增增产产物物用用限限制制性性内内切切酶酶 O OxaxaN N I I消消化化，琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳后染色观察：泳后染色观察：正常人有正常人有2
18、2个片段，个片段，191 191 和和 103bp103bp，镰刀状红细胞贫血的镰刀状红细胞贫血的 纯合子纯合子，仅有一个片段，仅有一个片段294bp 294bp 杂合子杂合子有有191191、103103和和294bp 3294bp 3个片段个片段综合了分子生物学、微电子学、微加工和计算机等学科知识本质：在固定的玻片等载体上的微型生物化学分析系统，芯片上每平方厘米可排列成千上万生物分子，能快速准确地检测核酸，并获取样品中的有关信息。分子生物学常用技术及其应用一、一、DNA芯片技术的概念和主要类型芯片技术的概念和主要类型DNA芯片技术芯片技术指将大量已知寡核苷指将大量已知寡核苷酸或酸或DNA探
19、针（不标记）按特定的排列探针（不标记）按特定的排列方式固化在固相支持物（多用计算机硅方式固化在固相支持物（多用计算机硅芯片）表面，按碱基互补配对的原则，芯片）表面，按碱基互补配对的原则，与标记的特异的单链与标记的特异的单链DNA或或RNA（待测（待测样品）分子杂交形成双链，通过对杂交样品）分子杂交形成双链，通过对杂交信号的检测分析，得出样品分子的数量信号的检测分析，得出样品分子的数量和序列信息。和序列信息。DNA芯片主要类型原位合成芯片 才用光介导和压电打印等技术在芯片的特定部位原位合成寡核苷酸而制成的芯片DNA微集阵列 将预先制备的DNA片段以显微打印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片
20、二、DNA芯片技术的基本原理与方法DNA芯片技术工作流程主要包括：芯片制备关键样品的准备与标记杂交信号检测和数据分析处理（一）、芯片的制备1、支持物的预处理支持物包括实性材料和膜性材料实性材料包括硅芯片、玻片和瓷片等 实性材料需要进行预处理，使其表面衍生出羟基、氨基等活性基团，并在表面用光敏材料保护。膜性材料包括聚丙烯膜、尼龙膜、硝酸纤维素膜等 膜性材料则要包被氨基硅烷或多聚赖氨酸。2、原位合成芯片的制备两种方法：光介导原位合成法、压电打印合成法利用排列组合的原理，在一块载体的不同位置合成不同的寡核苷酸片段3、DNA微集阵列的制备包括制备探针、打印、探针固化三个步骤（二）样品的准备包括分离纯化
21、、扩增和标记（三）分子杂交一般30分钟内完成（四）检测分析根据产生的荧光强度分析样品含量及样品结合的探针类型，最后分析样品核苷酸序列。三、DNA芯片技术的应用（自学）DNA序列测定突变及多态性分析基因表达分析基因组研究基因诊断药物研究与开发基因诊断以DAN或RNA为诊断材料，DNA反映基因的存在状态、RNA反映基因的表达状态，通过检查基因的存在、缺陷或表达异常。常用的方法：包括核酸分子杂交、PCR、单链构象多态性检测、限制性内切酶酶谱分析、DNA序列测定、DNA芯片技术分子生物学常用技术及其应用基因治疗指以正常基因矫正、替代缺陷基因，或从基因水平调控细胞中缺陷基因的表达的一种治疗疾病的方法。基本过程：1、选择制备目的基因2、选择基因转运载体3、选择靶细胞4、转移基因5、外源基因表达的筛选6、回输细胞到体内