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1、关于常用分子生物学技术第1页，讲稿共110张，创作于星期日第一节第一节分子杂交技术分子杂交技术具有互补序列两条单链核酸分子在一具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下定条件下按碱基互补配对原则退火形成双按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。杂交的双方是待测核酸和已知链的过程。杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知核酸序列称探针。核酸序列，已知核酸序列称探针。第2页，讲稿共110张，创作于星期日在某些理化因素作用下，在某些理化因素作用下，DNA双链解双链解开成两条单链的过程。开成两条单链的过程。双链间氢键的断裂！双链间氢键的断裂！2、DNA变性的本质变性的本质1、DNA变性的概念变性的概念第3
2、页，讲稿共110张，创作于星期日核酸分子杂交核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)在在DNA复复性性过过程程中中，如如果果把把不不同同DNA单单链链分分子子放放在在同同一一溶溶液液中中，或或把把DNA与与RNA放放在在一一起起，只只要要在在DNA或或RNA的的单单链链分分子子之之间间有有一一定定的的碱碱基基配配对对关关系系，就就可可以以在在不不同同的的分分子子之之间间形形成成杂杂化化双双链链(heteroduplex)。第4页，讲稿共110张，创作于星期日变性变性复性复性DNA-DNA杂交双链分子杂交双链分子第5页，讲稿共110张，创作于星期日核酸分子杂交核酸分子杂交
3、第6页，讲稿共110张，创作于星期日探针技术探针技术探针探针(probe)一一小小段段用用同同位位素素、生生物物素素或或荧荧光光染染料料标标标标记记其其末末端端或或全全链链的的已已知知序序列列的的多多聚聚核核苷苷酸酸，与与固固定定在在NCNC膜膜上上的的核核苷苷酸酸结结合合，判判断断是否有同源的核酸分子存在。是否有同源的核酸分子存在。第7页，讲稿共110张，创作于星期日此技术由此技术由Southern1975年首先设计。年首先设计。被检测对象为被检测对象为DNA。第8页，讲稿共110张，创作于星期日带有带有带有带有DNADNA片段的凝胶片段的凝胶片段的凝胶片段的凝胶DNADNA分子分子分子分子
4、限制片段限制片段限制片段限制片段限制性酶切割限制性酶切割限制性酶切割限制性酶切割琼脂糖电泳琼脂糖电泳琼脂糖电泳琼脂糖电泳至膜（尼龙膜或硝酸至膜（尼龙膜或硝酸纤维素滤膜）上纤维素滤膜）上转膜转膜杂交、显影杂交、显影杂交、显影杂交、显影凝胶凝胶凝胶凝胶滤膜滤膜滤膜滤膜用缓冲液转移用缓冲液转移DNA吸附有吸附有DNA片段的膜片段的膜SouthernSouthern印迹杂交的技术流程印迹杂交的技术流程印迹杂交的技术流程印迹杂交的技术流程第9页，讲稿共110张，创作于星期日从凝胶上转移从凝胶上转移DNA第10页，讲稿共110张，创作于星期日应用应用DNA探针检测特异探针检测特异mRNA的一种杂交技术，主
5、要的一种杂交技术，主要用于分析用于分析mRNA的转录或的转录或mRNA分子大小。其方法类似分子大小。其方法类似于于Southern印迹杂交。印迹杂交。第11页，讲稿共110张，创作于星期日将待检测蛋白质（或酶）经将待检测蛋白质（或酶）经SDS-PAGE电电泳并染色后，转移到滤膜上固定，再用泳并染色后，转移到滤膜上固定，再用“抗抗体体-抗原抗原”免疫反应或免疫反应或“DNA-protein”结合反结合反应鉴别滤膜上的蛋白质。应鉴别滤膜上的蛋白质。第12页，讲稿共110张，创作于星期日1.DNA1.DNA印迹技术印迹技术 (Southernblotting)检测检测DNADNA2.RNA2.RNA
6、印迹技术印迹技术 (Northernblotting)检测检测RNARNA3.3.蛋白质的印迹分析蛋白质的印迹分析 (Westernblotting)检测蛋白质检测蛋白质第13页，讲稿共110张，创作于星期日三三种种印印迹迹技技术术的的比比较较第14页，讲稿共110张，创作于星期日1、定义：、定义：、定义：、定义：将标记探针与细胞或组织中核酸按碱基配对原则进行将标记探针与细胞或组织中核酸按碱基配对原则进行将标记探针与细胞或组织中核酸按碱基配对原则进行将标记探针与细胞或组织中核酸按碱基配对原则进行特异性杂交，并应用组织化学或免疫组织化学方法在显微特异性杂交，并应用组织化学或免疫组织化学方法在显微
7、特异性杂交，并应用组织化学或免疫组织化学方法在显微特异性杂交，并应用组织化学或免疫组织化学方法在显微镜下进行细胞内定位或基因表达的检测技术称原位杂交镜下进行细胞内定位或基因表达的检测技术称原位杂交镜下进行细胞内定位或基因表达的检测技术称原位杂交镜下进行细胞内定位或基因表达的检测技术称原位杂交（hybridizationinsitu)。2 2、操作步骤：、操作步骤：载片的清洁与处理；组织与细胞的固定；探针；载片的清洁与处理；组织与细胞的固定；探针；湿盒湿盒第15页，讲稿共110张，创作于星期日荧光原位杂交荧光原位杂交第16页，讲稿共110张，创作于星期日生物芯片（生物芯片（biochipbioc
8、hip）是近年来在生命科学领域中迅速发展起来）是近年来在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术。的一项高新技术。是将核酸、多肽或蛋白质分子、组织切片和细胞等制成探针，是将核酸、多肽或蛋白质分子、组织切片和细胞等制成探针，以预先设计的方式有序地、高密度地排列在玻片或硅片等载体上，以预先设计的方式有序地、高密度地排列在玻片或硅片等载体上，构成二维分子阵列，然后与待测生物样品靶分子杂交，通过检测杂构成二维分子阵列，然后与待测生物样品靶分子杂交，通过检测杂交信号实现快速、高效和高通量样品检测。因该技术常用玻片或硅交信号实现快速、高效和高通量样品检测。因该技术常用玻片或硅片等材料作为固相支持物，且在制
9、备过程中模拟计算机芯片的制备片等材料作为固相支持物，且在制备过程中模拟计算机芯片的制备技术，所以称之为生物芯片。其原理也是分子杂交技术。技术，所以称之为生物芯片。其原理也是分子杂交技术。第17页，讲稿共110张，创作于星期日微型化高通量高通量提高信息量平行化平行化提高信息的可比性微量化微量化降低待检样品用量自动化自动化提高工作效率低成本低成本可迅速普及推广生物芯片技术的特点生物芯片技术的特点第18页，讲稿共110张，创作于星期日生物芯片使用步骤生物芯片使用步骤芯片制作芯片制作把探针固定于载体表面把探针固定于载体表面把探针固定于载体表面把探针固定于载体表面样品处理样品处理目标分子富集目标分子富集
10、目标分子富集目标分子富集分子间的杂交分子间的杂交分子间的杂交分子间的杂交结果检测与数据分析结果检测与数据分析第19页，讲稿共110张，创作于星期日生物芯片分类生物芯片分类（1）基因芯片）基因芯片（2）蛋白质芯片）蛋白质芯片（3）细胞芯片）细胞芯片（4）组织芯片）组织芯片第20页，讲稿共110张，创作于星期日基因芯片概念基因芯片概念：基因芯片，也叫：基因芯片，也叫DNA芯片，是芯片，是将大量特定序列的将大量特定序列的DNA片段（分子探针）有序地固片段（分子探针）有序地固定在经过处理后的尼龙膜、玻璃片、硅片等支持物定在经过处理后的尼龙膜、玻璃片、硅片等支持物上上，从而能快速、准确地对大量，从而能快
11、速、准确地对大量DNADNA分子序列进行测分子序列进行测分子序列进行测分子序列进行测定和分析的一种类似电脑的芯片。定和分析的一种类似电脑的芯片。定和分析的一种类似电脑的芯片。定和分析的一种类似电脑的芯片。原理原理：利用碱基的互补配对原则（：利用碱基的互补配对原则（：利用碱基的互补配对原则（：利用碱基的互补配对原则（DNADNA分子杂交）分子杂交）分子杂交）分子杂交）材料材料：分子探针，尼龙膜，玻璃片，硅片：分子探针，尼龙膜，玻璃片，硅片：分子探针，尼龙膜，玻璃片，硅片：分子探针，尼龙膜，玻璃片，硅片1、基因芯片、基因芯片第21页，讲稿共110张，创作于星期日制作基因芯片的大致步骤制作基因芯片的
12、大致步骤第22页，讲稿共110张，创作于星期日第23页，讲稿共110张，创作于星期日可在基因组水平进行可在基因组水平进行基因表达基因表达和发现研究、和发现研究、突变突变、序列测定序列测定等，已方泛应用于基因组研究和等，已方泛应用于基因组研究和人类疾病的诊断等多领域。人类疾病的诊断等多领域。基因芯片应用基因芯片应用第24页，讲稿共110张，创作于星期日应用基因微矩阵芯片研究宫颈癌应用基因微矩阵芯片研究宫颈癌应用基因微矩阵芯片研究宫颈癌应用基因微矩阵芯片研究宫颈癌相关基因表达相关基因表达相关基因表达相关基因表达DNADNA微点阵已广泛和流行的用于微点阵已广泛和流行的用于微点阵已广泛和流行的用于微点
13、阵已广泛和流行的用于疾病诊断、基因组比较、以及新疾病诊断、基因组比较、以及新疾病诊断、基因组比较、以及新疾病诊断、基因组比较、以及新型癌症的分类。型癌症的分类。型癌症的分类。型癌症的分类。第25页，讲稿共110张，创作于星期日2、蛋白质芯片、蛋白质芯片蛋白质芯片蛋白质芯片（proteinchip）,又称蛋白质微阵列，是指又称蛋白质微阵列，是指以蛋白质或多肽作为配基，将其有序地固定在固相载以蛋白质或多肽作为配基，将其有序地固定在固相载体的表面形成微阵列；用标记了荧光的蛋白质或其它体的表面形成微阵列；用标记了荧光的蛋白质或其它分子与之作用，洗去未结合的成分，经荧光扫描等检分子与之作用，洗去未结合的
14、成分，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白质之测方式测定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白质之间或蛋白质与其它分子之间的相互作用关系。间或蛋白质与其它分子之间的相互作用关系。第26页，讲稿共110张，创作于星期日蛋白质芯片技术在医学中的应用蛋白质芯片技术在医学中的应用特异性抗原抗体的检测特异性抗原抗体的检测 生化反应的检测生化反应的检测 疾病诊断疾病诊断 对疾病分子机制的研究对疾病分子机制的研究 药物筛选及新药的研制开发药物筛选及新药的研制开发 第27页，讲稿共110张，创作于星期日3、细胞芯片、细胞芯片又称细胞微阵列，是以活细胞为研究对象的一种生物芯又称细胞微阵列，是以活细
15、胞为研究对象的一种生物芯片，在芯片上完成对细胞的捕获、固定、平衡、运输、片，在芯片上完成对细胞的捕获、固定、平衡、运输、刺激及培养的精确控制，并通过微型化的化学分析方法，刺激及培养的精确控制，并通过微型化的化学分析方法，实现对细胞样品的高通量、多参数、连续原位信号检测实现对细胞样品的高通量、多参数、连续原位信号检测和细胞组分的理化分析等。和细胞组分的理化分析等。第28页，讲稿共110张，创作于星期日4、组织芯片、组织芯片组织芯片组织芯片,又称组织微阵列，是将不同生物体的组织按又称组织微阵列，是将不同生物体的组织按预先设计或研究需要排列在固相载体上所形成的组织预先设计或研究需要排列在固相载体上所
16、形成的组织微阵列。微阵列。组织芯片最大的优势在于可以对大量组织标本同时进组织芯片最大的优势在于可以对大量组织标本同时进行检测，只需一次实验过程即可完成，缩短时间，减行检测，只需一次实验过程即可完成，缩短时间，减少误差，提高了可比性。少误差，提高了可比性。第29页，讲稿共110张，创作于星期日第二节第二节目的基因制备技术目的基因制备技术第30页，讲稿共110张，创作于星期日一、聚合酶链式反应（一、聚合酶链式反应（PCR）n概念概念聚聚合合酶酶链链反反应应（polymerasechainreaction，PCR）是是一一种种体体外外扩扩增增特特异异DNA片片断断的的技技术术,能能在在短时间内获得数
17、百万个特异短时间内获得数百万个特异DNA序列的拷贝。序列的拷贝。第31页，讲稿共110张，创作于星期日（一）PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长第32页，讲稿共110张，创作于星期日PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG
18、5引物酶引物酶RNA引物RNA引物第33页，讲稿共110张，创作于星期日PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA聚合酶DNA聚合酶第34页，讲稿共110张，创作于星期日PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延
19、伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了第35页，讲稿共110张，创作于星期日PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR耐热DNA聚合酶的应用，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖Kary MullisKary Mulli
20、s “我不大喜欢动手我不大喜欢动手,我宁肯不动手我宁肯不动手,我不喜欢做费力的事。作为一个发明家我不喜欢做费力的事。作为一个发明家,重要的一点是为解决某些问题重要的一点是为解决某些问题而尽力设计一个简捷的动手方案。而尽力设计一个简捷的动手方案。”第36页，讲稿共110张，创作于星期日1、PCR扩增扩增DNA片段的原理片段的原理 PCR是是是是在在在在模模模模板板板板DNA、引引物物和和四四中中脱脱氧氧核核苷苷酸酸等等存存在在的的情情况况下下，DNADNA聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶依依依依赖赖赖赖的的的的酶酶酶酶促促促促合合合合成成成成反反反反应应应应，整个扩增过程分三步：整个扩增过程分三步：整个
21、扩增过程分三步：整个扩增过程分三步：（二）（二）PCRPCR技术的基本原理和操作技术的基本原理和操作第37页，讲稿共110张，创作于星期日 变性：加热，模板变性：加热，模板变性：加热，模板变性：加热，模板DNADNA形成两条单链形成两条单链形成两条单链形成两条单链 退火：降温，模板单链退火：降温，模板单链退火：降温，模板单链退火：降温，模板单链DNADNA与引物配对结合与引物配对结合与引物配对结合与引物配对结合 延伸：在延伸：在延伸：在延伸：在DNADNA聚合酶及镁离子等存在的条件下，聚合酶及镁离子等存在的条件下，聚合酶及镁离子等存在的条件下，聚合酶及镁离子等存在的条件下，引物引物引物引物3-
22、3-端向前延伸，合成与模板配对的新链端向前延伸，合成与模板配对的新链端向前延伸，合成与模板配对的新链端向前延伸，合成与模板配对的新链第38页，讲稿共110张，创作于星期日 上述三步为一个循环，经过一个循环上述三步为一个循环，经过一个循环上述三步为一个循环，经过一个循环上述三步为一个循环，经过一个循环DNADNA量增加量增加量增加量增加一倍。新合成的链又可以成为新一轮循环的模板，一倍。新合成的链又可以成为新一轮循环的模板，一倍。新合成的链又可以成为新一轮循环的模板，一倍。新合成的链又可以成为新一轮循环的模板，经过经过经过经过25-30个循环后目的个循环后目的DNA就可以扩增就可以扩增就可以扩增就
23、可以扩增10106 6109倍。倍。通过循环可以提高通过循环可以提高PCR的特异性。的特异性。的特异性。的特异性。第39页，讲稿共110张，创作于星期日1）模板）模板DNA2）特异性引物）特异性引物3）耐热）耐热DNA聚合酶聚合酶4）dNTPs5）Mg2+6）缓冲液）缓冲液2 2、PCRPCR的基本成份的基本成份第40页，讲稿共110张，创作于星期日模板DNA953 3、PCRPCR的基本操作的基本操作第41页，讲稿共110张，创作于星期日PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50引物1引物2DNA引物第42页，讲稿共110张，创作于星期日PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程
24、PCR的特点引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶第43页，讲稿共110张，创作于星期日PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第1轮结束95第2轮开始第44页，讲稿共110张，创作于星期日PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点955072TaqTaqTaqTaq第45页，讲稿共110张，创作于星期日PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第2轮结束第46页，讲稿共110张，创作于星期日第47页，讲稿共110张，创作于星期日是不是循环次数越多越好？是不是循环次数越多越好？是不是循环次数越多越好？是不是循环次数越多越好？PCR扩增的平台效应扩增的
25、平台效应第48页，讲稿共110张，创作于星期日引物设计引物设计（1)1)序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。（2 2）引物长度以）引物长度以）引物长度以）引物长度以15-40bp15-40bp为宜。为宜。为宜。为宜。（3 3）碱基尽可能随机分布。碱基尽可能随机分布。碱基尽可能随机分布。碱基尽可能随机分布。（4 4）引物内部避免形成二级结构。）引物内部避免形成二级结构。）引物内部避免形成二级结构。）引物内部避免形成二级结构。（5 5）两引物间避免有互补序列。
26、）两引物间避免有互补序列。）两引物间避免有互补序列。）两引物间避免有互补序列。（6 6）引物）引物）引物）引物33端为关键碱基；端为关键碱基；端为关键碱基；端为关键碱基；55端无严格限制端无严格限制端无严格限制端无严格限制第49页，讲稿共110张，创作于星期日PCRPCR技术的优点技术的优点特异性强特异性强灵敏度高灵敏度高操作简单、省时操作简单、省时对待检原始材料质量要求低对待检原始材料质量要求低高效率的基因扩增技术高效率的基因扩增技术第50页，讲稿共110张，创作于星期日引物引物引物引物33555555基因组基因组PCR技术的特点：扩增技术的特点：扩增特异的特异的DNA片段片段第51页，讲稿
27、共110张，创作于星期日1 1、目的基因的克隆、目的基因的克隆2 2、基因的体外突变、基因的体外突变3 3、DNADNA和和RNARNA的微量分析的微量分析4 4、DNADNA序列测定序列测定5 5、基因突变分析、基因突变分析（三）（三）PCRPCR的主要应用的主要应用第52页，讲稿共110张，创作于星期日实时实时PCRPCR技术原理技术原理第53页，讲稿共110张，创作于星期日逆转录逆转录PCR（RT-PCR）以细胞内总以细胞内总以细胞内总以细胞内总RNARNA或或或或mRNAmRNA为材料进行体外扩增的技术。为材料进行体外扩增的技术。为材料进行体外扩增的技术。为材料进行体外扩增的技术。主要
28、用于克隆主要用于克隆主要用于克隆主要用于克隆cDNAcDNA、合成、合成、合成、合成cDNAcDNA探针，检测探针，检测探针，检测探针，检测RNARNA病毒、分析基病毒、分析基病毒、分析基病毒、分析基因表达等因表达等因表达等因表达等逆转录生成逆转录生成逆转录生成逆转录生成cDNAcDNA方式：方式：方式：方式：以随机进行的以随机进行的以随机进行的以随机进行的PCRPCR扩增所需的下游引物作为逆转录反应的引物以扩增所需的下游引物作为逆转录反应的引物以扩增所需的下游引物作为逆转录反应的引物以扩增所需的下游引物作为逆转录反应的引物以oligo(dT)oligo(dT)作为引物，作为引物，作为引物，作
29、为引物，mRNA3mRNA3末端末端末端末端polyApolyA尾与之互补以人工合成尾与之互补以人工合成尾与之互补以人工合成尾与之互补以人工合成的随机序列六核苷酸混合物作为引物，进行扩增。的随机序列六核苷酸混合物作为引物，进行扩增。的随机序列六核苷酸混合物作为引物，进行扩增。的随机序列六核苷酸混合物作为引物，进行扩增。第54页，讲稿共110张，创作于星期日reversetranscription逆转录酶逆转录酶逆转录酶逆转录酶聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶mRNAmRNAcDNAcDNA杂化双链杂化双链杂化双链杂化双链PCRPCR扩增扩增扩增扩增第55页，讲稿共110张，创作于星期日二、二、cDNA
30、文库文库cDNAlibrary第56页，讲稿共110张，创作于星期日一个一个生物体生物体的的基因组基因组DNA用用限制性内切酶限制性内切酶部分酶切后，将酶部分酶切后，将酶切片段插入到载体切片段插入到载体DNA分子分子中，所有这些插入了基因组中，所有这些插入了基因组DNA片片段的载体分子的集合体，将包含这个生物体的整个基因组，也就段的载体分子的集合体，将包含这个生物体的整个基因组，也就是构成了这个生物体的是构成了这个生物体的基因文库基因文库(genelibrary)。第57页，讲稿共110张，创作于星期日cDNA文库是以特定的组织或细胞文库是以特定的组织或细胞mRNA为模板，逆转录形成为模板，逆
31、转录形成的互补的互补DNA（cDNA）与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连）与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌形成重组接后转化受体菌形成重组DNA克隆群，这样包含着细胞全部克隆群，这样包含着细胞全部mRNA信息的信息的cDNA克隆集合称为该组织或细胞的克隆集合称为该组织或细胞的cDNA文库。文库。cDNA文库具有组织或细胞特异性文库具有组织或细胞特异性。cDNA文库显然比文库显然比基因组基因组DNA文库文库小得多，能够比较容易从中筛小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。选克隆得到细胞特异表达的基因。第58页，讲稿共110张，创作于星期日（一）从（一）从cD
32、NA文库建立文库建立第59页，讲稿共110张，创作于星期日基因组基因组DNADNA文库文库第60页，讲稿共110张，创作于星期日1）制备靶基因的核酸探针）制备靶基因的核酸探针2）若靶基因表达蛋白已知，可反推部分基因序列，制备寡核苷酸探针）若靶基因表达蛋白已知，可反推部分基因序列，制备寡核苷酸探针3）差异显示杂交）差异显示杂交（二）（二）（二）（二）cDNAcDNA文库目的基因的筛选文库目的基因的筛选文库目的基因的筛选文库目的基因的筛选利用核酸分子杂交分离目的基因：利用核酸分子杂交分离目的基因：第61页，讲稿共110张，创作于星期日差异显示杂交不需要核苷酸序列信息，而耍拥有两种不同的细胞群体：目
33、的基因正常表达细胞群和在基因不表达细胞群。制备两种不同mRNA提取物，一是含有目的基因mRNA的总mRNA群体，一是不含有目的基因mRNA种的总mRNA群体。因此，可以通过这两种总mRNA(或是它们的cDNA拷贝)为探针的平行杂交，对由表达目的基因的细胞总mRNA构建的克隆库进行筛选。当使用存在目的基因的mRNA探针时，所有包含着重组体的菌落都呈阳性反应，在x光底片上呈现黑色斑点，而使用不存在目的基因的mRNA探针时，除了含有目的基因的菌落外，其余的所有菌落都呈阳性反应，在x光底片上呈现黑色斑点。比较这两种底片井对照原平板，便可以挑选出含目的基因的菌落。第62页，讲稿共110张，创作于星期日1
34、）在基因组水平上研究某基因对器官、组织和细胞在个体）在基因组水平上研究某基因对器官、组织和细胞在个体发育中的影响发育中的影响2）cDNA文库的筛选比较简单易行，尤其适用于某些特殊组文库的筛选比较简单易行，尤其适用于某些特殊组织基因的制备织基因的制备3）由于每一个）由于每一个cDNA克隆都包含一种克隆都包含一种mRNA序列，这样在筛选序列，这样在筛选中出现假阳性的概率就会很低中出现假阳性的概率就会很低4）为了测定）为了测定mRNA序列，利用它的序列，利用它的cDNA拷贝序列就可以有拷贝序列就可以有效分析外显子的基因结构效分析外显子的基因结构（三）（三）cDNAcDNA文库的优越性文库的优越性文库
35、的优越性文库的优越性第63页，讲稿共110张，创作于星期日由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。序列。三、化学合成三、化学合成第64页，讲稿共110张，创作于星期日化学合成法主要应用1.作为核酸分子杂交探针作为核酸分子杂交探针2.作为引物，用于测序和作为引物，用于测序和PCR3.用于制备小的基因、不易获得基因或用于改造天然用于制备小的基因、不易获得基因或用于改造天然基因基因4.作为作为DNA末端改造中的接头末端改造中的接头5.用于制备用于制备cDNA，筛选克隆基因，或基因定位或基因的定，筛选克隆基因，或基因定位或基因的定点突变点突变第65页，讲稿共110张，创作于星期
36、日第三节第三节 基因敲除技术基因敲除技术 基因敲除（基因敲除（基因敲除（基因敲除（geneknockout）又称基因剔除，）又称基因剔除，或基因打靶或基因打靶（genetargetinggenetargeting）是指通过）是指通过DNA定点定点定点定点同源重组同源重组，定向改变定向改变定向改变定向改变基因组中的某一基因组中的某一特定基因特定基因特定基因特定基因，使，使机体特定基因失活或缺失，从而研究此基因的功机体特定基因失活或缺失，从而研究此基因的功能的一种分子生物学技术。能的一种分子生物学技术。第66页，讲稿共110张，创作于星期日由于胚胎干细胞的这种特殊性，由于胚胎干细胞的这种特殊性，由
37、于胚胎干细胞的这种特殊性，由于胚胎干细胞的这种特殊性，ESES细胞基因打靶细胞基因打靶技术已被广泛地应用于建立转基因动物之中。从技术已被广泛地应用于建立转基因动物之中。从80年年年年代到代到代到代到90年代初，小鼠年代初，小鼠年代初，小鼠年代初，小鼠ESES细胞基因打靶技术已发展到细胞基因打靶技术已发展到细胞基因打靶技术已发展到细胞基因打靶技术已发展到成熟阶成熟阶段段。1984年，年，BradlyBradly等成功地用显微注射法将等成功地用显微注射法将ES细胞细胞细胞细胞移入囊胚腔，并移植回假孕母鼠，获得生殖系嵌合体，移入囊胚腔，并移植回假孕母鼠，获得生殖系嵌合体，移入囊胚腔，并移植回假孕母鼠
38、，获得生殖系嵌合体，移入囊胚腔，并移植回假孕母鼠，获得生殖系嵌合体，再适当交配，再适当交配，再适当交配，再适当交配，获得源于获得源于获得源于获得源于ES细胞系纯系小鼠。细胞系纯系小鼠。细胞系纯系小鼠。细胞系纯系小鼠。基因敲除的发展历程基因敲除的发展历程第67页，讲稿共110张，创作于星期日此实验首次证实体外培养的此实验首次证实体外培养的此实验首次证实体外培养的此实验首次证实体外培养的ESES细胞能在体内分化发育细胞能在体内分化发育细胞能在体内分化发育细胞能在体内分化发育成生殖系嵌合体并可获得小鼠纯合体子代。成生殖系嵌合体并可获得小鼠纯合体子代。成生殖系嵌合体并可获得小鼠纯合体子代。成生殖系嵌合
39、体并可获得小鼠纯合体子代。19871987年，人们年，人们年，人们年，人们利用利用利用利用ESES细胞技术建立了次黄嘌呤磷酸核糖转移酶细胞技术建立了次黄嘌呤磷酸核糖转移酶细胞技术建立了次黄嘌呤磷酸核糖转移酶细胞技术建立了次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(hprt)(hprt)基因基因基因基因敲除敲除敲除敲除(Geneknockout)(Geneknockout)的动物模型。的动物模型。的动物模型。的动物模型。第68页，讲稿共110张，创作于星期日转转转转抗凝血酶素抗凝血酶素抗凝血酶素抗凝血酶素V V基因基因、转、转、转、转-干扰素基因干扰素基因干扰素基因干扰素基因羊。羊。羊。羊。第69页，讲稿共110张
40、，创作于星期日如何敲除其胰岛素基因，成为糖病模型？如何敲除其胰岛素基因，成为糖病模型？猴的基因编码与人类猴的基因编码与人类猴的基因编码与人类猴的基因编码与人类只有只有只有只有1%1%的差别，通过转基的差别，通过转基的差别，通过转基的差别，通过转基因猴，可以研究各种疾病因猴，可以研究各种疾病因猴，可以研究各种疾病因猴，可以研究各种疾病对人的影响，并开发出相对人的影响，并开发出相对人的影响，并开发出相对人的影响，并开发出相应的治疗方法。如引进应的治疗方法。如引进应的治疗方法。如引进应的治疗方法。如引进老老老老年性痴呆病年性痴呆病年性痴呆病年性痴呆病的基因，加的基因，加快针对这种疾病疫苗快针对这种疾
41、病疫苗的开发研究。还可引的开发研究。还可引进糖尿病、乳腺癌、进糖尿病、乳腺癌、帕金森氏症等基因，帕金森氏症等基因，为人类最终战胜社些为人类最终战胜社些疾病提供帮助。疾病提供帮助。第70页，讲稿共110张，创作于星期日一、基因敲除的一般原理一、基因敲除的一般原理利用胚胎干细胞进行基因敲除。利用胚胎干细胞进行基因敲除。1）构建常规基因敲除载）构建常规基因敲除载体，载体中的外源基因与靶基因高度同源，且被修饰和改造；体，载体中的外源基因与靶基因高度同源，且被修饰和改造；2）敲除载体质粒导入胚胎干细胞；）敲除载体质粒导入胚胎干细胞；3）筛选发生）筛选发生同源重组同源重组的阳性胚的阳性胚胎干细胞；胎干细胞
42、；4）通过显微注射将阳性胚胎干细胞导入胚囊；）通过显微注射将阳性胚胎干细胞导入胚囊；5）转入）转入假孕雌鼠子宫；假孕雌鼠子宫；6）获得嵌合体小鼠。）获得嵌合体小鼠。第71页，讲稿共110张，创作于星期日发发生生在在同同源源序序列列间间的的重重组组称称为为同同同同源源源源重重重重组组组组(homologous(homologousrecombination)recombination)，又又又又 称称称称 基基基基 本本本本 重重重重 组组组组（generalgeneralrecombinationrecombination）。通通通通过过过过链链链链的的的的断断断断裂裂裂裂和和和和再再再再连连
43、连连接接接接，在在在在两两两两个个个个DNADNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。同源重组是最基本的同源重组是最基本的DNA重组方式重组方式第72页，讲稿共110张，创作于星期日Holliday模型的模型的4个关键步骤：个关键步骤：两个同源染色体两个同源染色体DNA排列整齐；排列整齐；一个一个一个一个DNADNA的一条链断裂、并与另一个的一条链断裂、并与另一个DNADNA对应的链连对应的链连对应的链连对应的链连接，形成接，形成接，形成接，形成Holliday中间体中间
44、体；通过分支移动产生异源双链通过分支移动产生异源双链通过分支移动产生异源双链通过分支移动产生异源双链DNA；HollidayHolliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体中间体切开并修复，形成两个双链重组体中间体切开并修复，形成两个双链重组体中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：，分别为：，分别为：，分别为：第73页，讲稿共110张，创作于星期日内切酶内切酶(recBCD)DNA侵扰侵扰(recA)分支迁移分支迁移(recA)内切酶内切酶(recBCD)DNA连接酶连接酶535353535353535353535353535333535335535353Holiday中间体
45、中间体53535353第74页，讲稿共110张，创作于星期日HolidayHoliday中间体中间体中间体中间体553355335533553355553355553333333355555555333333335555555533333355555555333333335555555533333333内切酶内切酶内切酶内切酶(ruvC)(ruvC)内切酶内切酶内切酶内切酶(ruvC)(ruvC)DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶片片片片段段段段重重重重组组组组体体体体拼拼拼拼接接接接重重重重组组组组体体体体第75页，讲稿共110张，创作于星期日knock
46、-out：thegeneofinterestisdisrupted同源重组同源重组抗性选择抗性选择第76页，讲稿共110张，创作于星期日RBRBRBRBDT-ADT-ADT-ADT-ADT-ADT-AhpthptEnEnEnEnLBLBLBLBWaxyWaxy重组重组重组重组整合整合整合整合WaxyWaxyhpthpthpthptEnEnEnEnWaxyWaxy重组重组intron1intron1intron1intron1表达载体受体基因组打靶结果基因打靶（基因打靶（genetargeting）第77页，讲稿共110张，创作于星期日二、基因敲除载体构建二、基因敲除载体构建第78页，讲稿共11
47、0张，创作于星期日获得目的基因的获得目的基因的同源片段，即同源片段，即同源片段，即同源片段，即5-5-臂和臂和臂和臂和3-3-臂臂。第79页，讲稿共110张，创作于星期日打靶载体的选择性标记基因打靶载体的选择性标记基因质粒筛选抗性基因质粒筛选抗性基因：AmpR，KanR阳性筛选基因表达阳性筛选基因表达：转染后的细胞存活，最多见Neo阴性筛选基因表达阴性筛选基因表达：转染后的细胞死亡，DTA，HSV-TK第80页，讲稿共110张，创作于星期日1、插入性载体、插入性载体(gene-insertionvector)：插入型载体中与靶基因同源的区段中含有插入型载体中与靶基因同源的区段中含有特异的酶切位
48、点，线性化后，同源重组导致特异的酶切位点，线性化后，同源重组导致基因组序列的重复，从而干扰了目标基因的基因组序列的重复，从而干扰了目标基因的功能。功能。基因敲除载体类型基因敲除载体类型基因敲除载体类型基因敲除载体类型第81页，讲稿共110张，创作于星期日获得目的基因的获得目的基因的获得目的基因的获得目的基因的同源片段，即同源片段，即同源片段，即同源片段，即5-5-臂和臂和3-3-臂臂臂臂。第82页，讲稿共110张，创作于星期日2、置换型载体、置换型载体(gene-replacementvectorgene-replacementvector)：断裂位点位于同源序列区域的外侧或两侧断裂位点位于同
49、源序列区域的外侧或两侧，选择基因位于同源目的序列内部或外侧。基因选择基因位于同源目的序列内部或外侧。基因重组时以载体的同源序列取代染色体靶位序列，重组时以载体的同源序列取代染色体靶位序列，载体载体DNA同源目的序列与染色体靶位点进行同源目的序列与染色体靶位点进行两次同源重组。目前，大多数基因敲除都采用两次同源重组。目前，大多数基因敲除都采用置换型载体。置换型载体。第83页，讲稿共110张，创作于星期日取代型（取代型（a）或插入型（）或插入型（b）载体）载体第84页，讲稿共110张，创作于星期日三、基因敲除载体导入三、基因敲除载体导入ES细胞细胞1、ES细胞的获得细胞的获得现在基因敲除一般采用是
50、现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞胚胎干细胞胚胎干细胞胚胎干细胞，最常用的，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。常用是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。常用的鼠的种系是的鼠的种系是129及其杂合体，因为这类小鼠具有自及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。而其他遗传背景的胚胎干细胞系的理想实验动物。而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。也逐渐被发展应用。ESES能在体外培养，保留发育的全能性！能在体外培养，保留发育的全能性！能在体外培养，保留发育的全能性！能在体外培养，保留发