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1、关于真核生物的基因调控第1页，讲稿共89张，创作于星期二一 真核细胞的基因结构 真核细胞与原核细胞在基因转录、翻译及DNA的空间结构方面存在很大的差异，主要表现在以下几个方面：1 在真核细胞中，一条成熟的mRNA链只能翻译出一条多肽链，即基因以多顺反子的形式存在。2 真核细胞DNA与组蛋白和大量非组蛋白相结合，只有一小部分DNA是裸露的。第2页，讲稿共89张，创作于星期二 3 真核细胞中有一部分由几个或几十个碱基组成的DNA序列，在整个基因组中重复几百次甚至上百万次。高等真核细胞DNA中很大部分是不转录的。大部分真核细胞的基因中存在不被翻译的内含子。4 真核生物能够有序地根据生长发育阶段的需要
2、进行DNA片断的重排，在需要时，可增加细胞内某些基因的拷贝数。第3页，讲稿共89张，创作于星期二 5 真核生物中，基因转录的调节区较大，它们可能远离启动子达几百个甚至上千个碱基对，它主要是通过改变整个所控制基因5上游区DNA构型来影响它与RNA聚合酶的结合能力。6 真核生物的RNA在细胞核中合成，只有穿过细胞膜，到达细胞质后，才能被翻译成蛋白质。7 许多真核细胞的基因需经过复杂的成熟和剪接过程（maturation and splicing）才能顺利地翻译成蛋白质。第4页，讲稿共89张，创作于星期二第5页，讲稿共89张，创作于星期二第6页，讲稿共89张，创作于星期二第7页，讲稿共89张，创作于
3、星期二二 基因家族(gene family)原核细胞中，整个体系置于一个启动子控制之下。由于真核细胞的DNA都是单顺反子，许多相关的基因常常按功能成套组合，一套基因就是一个基因家族。家族中各成员的表达水平和酶活性可以很不相同，但通常是密切相关的。通常分为简单多基因家族、复杂多基因家族和发育调控的复杂多基因家族。第8页，讲稿共89张，创作于星期二 1 简单多基因家族：指在家族中有一个或数个基因以串联方式重复排列。如编码ssrRNA的基因家族，其中每个ssrRNA基因都被规模宏大的间隔序列所分开。间隔序列的长度约为ssrRNA长度的26倍，并含有中等重复序列，每个ssrRNA基因都被单独转录，产生
4、独立于其它部分的RNA分子，经加工为成熟的ssrRNA。第9页，讲稿共89张，创作于星期二2 复杂多基因家族：一般由几个相关基因家族构成，基因家族之间由间隔序列隔开，并作为独立的转录单位。如：海胆的组Pr基因家族。第10页，讲稿共89张，创作于星期二 组蛋白 （海胆）组蛋白 （果蝇）第11页，讲稿共89张，创作于星期二3 发育调控的复杂多基因家族 在生物体发育的不同阶段，复杂多基因家族中的基因结构和数量，会发生变化的情况，基因之间存在着具有调节功能的重复序列。在每个基因家族中，基因排列的顺序就是它们在发育阶段的表达顺序。如人类的血红蛋白，在母体怀孕后的不同时期出现不同的亚基和数量变化。第12页
5、，讲稿共89张，创作于星期二第13页，讲稿共89张，创作于星期二三 真核基因的断裂结构 1 1 外显子和内含子：外显子和内含子：现已查明，大多数真核基因都是由现已查明，大多数真核基因都是由PrPr编码序列和非编码序列和非PrPr编编码序列组成。编码序列称为外显子（码序列组成。编码序列称为外显子（exonexon），非编码序），非编码序列称为内含子（列称为内含子（intronintron）。在一个结构基因中，编码某一）。在一个结构基因中，编码某一PrPr不同区域的各个外显子并不连续地排列在一起，不同区域的各个外显子并不连续地排列在一起，而常常被长度不等的内含子所隔离，形成镶嵌排列而常常被长度不等
6、的内含子所隔离，形成镶嵌排列的断裂方式，所以真核基因有时称为断裂基因的断裂方式，所以真核基因有时称为断裂基因(interrupted gene)(interrupted gene)。只有真核基因具有切除基因中内含。只有真核基因具有切除基因中内含子，产生功能型子，产生功能型mRNAmRNA和和PrPr的能力，原核生物不具有的能力，原核生物不具有此种特性。此种特性。第14页，讲稿共89张，创作于星期二 观察研究外显子和内含子的方法：1.电子显微镜：将成熟mRNA分子和相应的染色体DNA进行分子杂交，形成DNA-RNA异源双链分子（heterdaplexes）,在电镜下可观察到部分单链DNA区段从异
7、源双链分子上呈环状突起，表示这序列在成熟mRNA分子上已被切除，为内含子。第15页，讲稿共89张，创作于星期二 2.用S1核酸酶处理异源双链分子：S1核酸酶能专一降解未配对的单链核苷酸，基因组DNA中只有与成熟mRNA链相对应的片断，由于形成异源杂合体而得以保留。这些保留下来的DNA片断就是外显子。根据对全序列的分析，它们的大小和在DNA链上的特定位置都能被精确地测定。第16页，讲稿共89张，创作于星期二 3限制性内切酶切图谱分析：采用几种不同的限制性内切酶，综合分析DNA的酶切图谱和成熟mRNA分子一的酶切位点的分布，就可确定内含子的大小及其在基因中与外显子的排列方式。第17页，讲稿共89张
8、，创作于星期二 2 外显子与内含子的可变性：在基因转录、加工产生成熟mRNA分子时，内含子通过剪接加工被去除，保留在成熟mRNA分子中的外显子被拼接在一起，最终被翻译成蛋白质。因此，通过反转录酶的作用，由成熟mRNA产生的cDNA分子中，只含有外显子，没有内含子。第18页，讲稿共89张，创作于星期二 外显子和内含子的关系并不是完全固定不变的，有时会出现这样的情况：在同一条DNA链上的某一段DNA序列，它作为编码茉一条多肽链基因的一部分时是外显子，但作为编码另一条多肽链基因的一部分时，则成了内含子，这是由于mRNA剪接加工的方式不同造成的。其结果是同一段DNA序列加工生成了两条或两条以上的mRN
9、A链。第19页，讲稿共89张，创作于星期二 3 外显子与内含子的连接区：真核基因断裂结构的另一个重要特点是外显子-内含子连接区（exon-intron junction）的高度保守性和特异性碱基序列。外显子-内含子连接区就是指外显子和内含子的交界，又称边界序列。有两个重要特征：第20页，讲稿共89张，创作于星期二 1.内含子的两端序列之间没有广泛的同源性，因此内含子两端序列不能互补，即上游序列和下游序列不可能通过碱基配对形成发卡式二级结构。2.外显子-内含子连接区很短，但却高度保守（consensus sequence），它是RNA剪接的信号序列。第21页，讲稿共89张，创作于星期二 序列分析
10、表明：几乎每个内含子5端起始的两个碱基都是GT，3端最后两个碱基总是AG，由于这两个碱基的高度保守性和存在的广泛性，将其称为GT-AG法则，即5GTAG 3。第22页，讲稿共89张，创作于星期二四 真核生物DNA水平的调控 1 基因丢失：某些原生动物、昆虫及甲壳纲动物细胞分化过程中发现有部分染色体丢失的现象。这种方式仅存在于进化程度较低的生物中，如马蛔虫。2 基因扩增：指某些基因的拷贝数专一性大量增加的现象，它使得细胞在短期内产生大量的基因产物以满足生长发育的需要。是基因活性调控的一种方式。第23页，讲稿共89张，创作于星期二 如：非洲爪蟾的卵母细胞中原有rRNA（rDNA）基因约500个拷贝
11、，在减数分裂的粗线期内，这个基因开始迅速复制，到双线期，其copy数达200万个，增加近4000倍，可用来合成1012个rRNA，以满足卵裂期间和胚胎期间合成大量Pr的需要。第24页，讲稿共89张，创作于星期二 3.基因重排与变换：一个基因可以通过从远离其启动子的地方移到距它很近的位点而被启动转录，这种方式称基因重排。典型的例子是小鼠免疫球Pr结构基因的表达，免疫球Pr肽链主要由可变区、恒定区及两者之间的连接区组成，在未分化的细胞中（胚胎细胞中）三者相距较远。当淋巴细胞发育分化时，能通过染色体内的重组，把三个远离的基因紧密地连接在一起，从而产生免疫球Pr。第25页，讲稿共89张，创作于星期二基
12、因的重排与变换基因的重排与变换 一个基因可以通过从远离其启动子的地方移到距它很近的一个基因可以通过从远离其启动子的地方移到距它很近的位点而被启动转录，这种方式称为重排。通过基因重排调节基位点而被启动转录，这种方式称为重排。通过基因重排调节基因活性的典型例子是小鼠免疫球蛋白结构基因的表达。因活性的典型例子是小鼠免疫球蛋白结构基因的表达。V D J C C E 未分化细胞 V D J C C E 产生C细胞V D J C E 产生C细胞 类型转换 免疫球蛋白中连基因的组织特一行表达与基因重排 V.可变区;D.多态区;J.结合区 第26页，讲稿共89张，创作于星期二五 顺式作用元件与基因调控 1 染
13、色质结构对转录的影响：转录发生之前，染色质常常会在特定的区域被解旋或松驰，形成自由DNA。这种变化包括核小体结构的消除或改变，DNA本身局部结构的变化如双螺旋的局部超旋或松驰，DNA从B-DNA变为Z-DNA等。这些变化导致结构基因暴露，促进转录因子与启动区DNA的结合，从而导致基因的转录。第27页，讲稿共89张，创作于星期二1、染色体水平的调控、染色体水平的调控 A、染色体结构的改变、染色体结构的改变Tu1Tu2 染色质结构变化影响基因转录染色质结构变化影响基因转录染色质去超螺旋基因转录 真核基因的活跃转录是在常真核基因的活跃转录是在常染色质上进行的。转录发生之前，染色质上进行的。转录发生之
14、前，染色质常常会在特定的区域被解染色质常常会在特定的区域被解旋或松弛，形成自由旋或松弛，形成自由DNADNA。这种。这种变化可能包括核小体结构的消除变化可能包括核小体结构的消除或改变，或改变，DNADNA本身局部结构的变本身局部结构的变化，如双螺旋的局部超旋或松弛，化，如双螺旋的局部超旋或松弛，DNADNA从右旋型变为左旋型（从右旋型变为左旋型（Z-Z-DNADNA）等。这些变化可导致结构）等。这些变化可导致结构基因暴露，促进转录因子与启动基因暴露，促进转录因子与启动区区DNADNA的结合，从而导致基因转的结合，从而导致基因转录录。多线染色体多线染色体第28页，讲稿共89张，创作于星期二 活跃
15、表达的基因所在的染色质上含有对DNase的超敏感位点(hypersensitive site)，即率先降解位点。每个活跃表达基因都有一个或数个超敏感位点，大多位于基因5端启动区。每个超敏感位点是一段长约100-200bp的DNA序列。非活跃基因的5端相应位点不表现对DNase的超敏感性。第29页，讲稿共89张，创作于星期二 3 启动子及其对转录的影响：真核生物基因转录的起始位点具有“帽子”结构专一性，而且只有嘌呤（以腺嘌呤为主）才能起始转录。调控区较大，除具有结合RNA聚合酶的CAAT区之外，大多数基因还拥有GC区和增强子。第30页，讲稿共89张，创作于星期二 几乎所有真核基因3端都存在一个p
16、oly（A）位点，该位点上游15-30bp处的保守序列AATAAA对于初级转录产物的准确切割及加poly（A）是必需的，初级转录产物的终止是AATAAA和终止区之间相互作用的结果。新生RNA在poly（A）位点的准确剪切加工则通过AATAAA区和poly（A）位点周围序列的相互作用来达到。第31页，讲稿共89张，创作于星期二 真核生物的启动子：所谓启动子是指确保转录精确而有效地启始的DNA序列。真核基因启动子在由RNA聚合酶催化转录的DNA序列5上游区富含TA的保守序列，该序列前4个碱基为TATA，所以称为TATA框（TATA box，或TATA区）。TATA区的主要作用是使转录精确地起始；C
17、AAT区和GC区主要控制转录起始的频率，不参与起始位点的确定。第32页，讲稿共89张，创作于星期二 现在认为启动子-25-35区含有TATA序列，在-70-80区有CCAAT序列（CAAT box），在-80-110区含有GCCACACCC或GGGCGGG（GC box）。习惯上将TATA区上游的保守序列称为上游启动子元件（upstream promoter element,UPF）或称上游激活序列（upstream activating sequence,UAS）。第33页，讲稿共89张，创作于星期二Sequence elements within a typical eukaryotic
18、gene1GCTATACAATGC-25-50-80-95-1301 based on the thymidine kinase gene octamer transcription elementpromoterTATA box(TATAAAA)located approximately 25-30 bp upstream of the+1 start site determines the exact start site(not in all promoters)binds the TATA binding protein(TBP)which is a subunit of TFIID
19、GC box(CCGCCC)binds Sp1(Specificity factor 1)CAAT box(GGCCAATCT)binds CTF(CAAT box transcription factor)Octamer(ATTTGCAT)binds OTF(Octamer transcription factor)+1ATTTGCAT第34页，讲稿共89张，创作于星期二RNA聚合酶II启动子 第35页，讲稿共89张，创作于星期二第36页，讲稿共89张，创作于星期二 2增强子及其对转录的影响：增强子是指能使和它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列。目前在病毒、植物、动物和人类正常细胞中都发
20、现有增强子存在，是基因表达的重要调控元件。通常具有下列性质：a 增强效应十分明显，一般能使基因转录频率增加10200倍，有的可增加上千倍。第37页，讲稿共89张，创作于星期二第38页，讲稿共89张，创作于星期二 B.增强效应与其位置和取向无关，不论增强子以什么方向排列（53或35），甚至和基因相距3000bp，或在基因的下游，均表现出增强效应。c.大多为重复序列，一般长约50bp，适合与某些蛋白因子结合。其内部常含有一个核心序列：（G）TGGA/TA/TA/T（G），该序列是在另一个基因附近产生增强效应时所必需的。第39页，讲稿共89张，创作于星期二 d.其增强效应有严密的组织和细胞特异性，说
21、明只有特定的Pr（转录因子）参与才能发挥功能。e.没有基因专一性，可在不同的基因组合上表现出增强效应。f.许多增强子还受外部信号的调控，如金属硫蛋白的基因启动区上游所带的增强子，就可以对环境中的锌、镉浓度做出反应。第40页，讲稿共89张，创作于星期二六 反式作用因子对转录的调控 反式作用因子也称转录因子，基因的所有顺式作用元件都要和相应的反式作用因子结合，并通过Pr之间的相互作用才能实现它们对基因的调控。顺式作用元件和反式作用因子结合形成转录复合体，根据各个Pr成分在转录中的作用，能将整个复合体分为3部分 第41页，讲稿共89张，创作于星期二 1.参与所有或某些转录阶段的RNA聚合酶亚基，不具
22、有基因特异性。2.与转录的起始或终止有关的辅助因子，也不具有基因特异性。3.与特异调控序列结合的转录因子，具基因特异性，如TATA区。第42页，讲稿共89张，创作于星期二 特异转录因子对基因表达的调控是大量的、广泛存在和高度有序的，主要有两种形式：1)转录起始复合物形成过程受到控制。2)通过专一因子的结合，提高RNA聚合酶起始转录活性。第43页，讲稿共89张，创作于星期二 1 CAAT区结合蛋白CTF/NF1：CTF和NF1是CAAT区的结合蛋白，是腺病毒复制所必需的。CTF/NF1是一组具双重功能的蛋白质，它们与CTTA区相结合，参与促进RNA聚合聚合酶指导的转录起始过程；当它们与其它相似于
23、CAAT区的DNA序列相结合，则有利于起始DNA的复制。第44页，讲稿共89张，创作于星期二 2 TATA和GC区结合蛋白：TATA和GC区结合蛋白主要是RNA聚合酶起始一般基因转录所必需的4种Pr因子，有TFD、TFA、TFB、TFE。TFD：与TATA区相结合。TFA：参与TFD和TATA区的结合。TFB：帮助RNA聚合酶与启动区结合。TFE：帮助RNA聚合酶起始基因转录。第45页，讲稿共89张，创作于星期二表 RNA聚合酶的基本转录因子转录因子转录因子分子量分子量(kD)(kD)功能功能TBPTBP3030与与TATATATA盒结合盒结合TFTF-B-B3333介导介导RNARNA聚合酶
24、聚合酶 的结合的结合TFTF-F-F30,7430,74解旋酶解旋酶TFTF-E-E34,3734,37ATPATP酶酶TFTF-H-H62,8962,89解旋酶解旋酶TFTF-A-A12,19,3512,19,35稳定稳定TFTF-D-D的结合的结合TFTF-I-I120120促进促进TFTF-D-D的结合的结合第46页，讲稿共89张，创作于星期二第47页，讲稿共89张，创作于星期二Phosphorylation of the polymerase CTD by TFIIHFormation of a processive RNA polymerase complex and allows
25、the RNA Pol to leave the promoter region.Back第48页，讲稿共89张，创作于星期二 3 RNA聚合酶及其下游启动区结合蛋白：RNA聚合酶主要结合在转录起始位点的下游50bp以上区，有许多辅助因子参与RNA聚合酶对不同启动区的识别和结合，如转录因子TFA参与该酶对非洲爪蟾5SrRNA的转录。第49页，讲稿共89张，创作于星期二第50页，讲稿共89张，创作于星期二 TFA 具锌指结构域（锌指区Zinc finger region）:TFA蛋白有9个相似的重复单位，每个单位大约由30个AA残基组成，每个单位中有一对固定位点的半胱氨酸残基，一对固定的组AA残
26、基，它们和Zn离子络合，使中间的AA残基回折成一种手指状结构，称锌指或锌指区。第51页，讲稿共89张，创作于星期二SP1锌指结构域Zinc fingers may form-helices that insert into the major groove,associated with-sheets on the other side 第52页，讲稿共89张，创作于星期二The first finger of a steroid receptor controls specificity of DNA-binding(positions shown in red);the second fi
27、nger controls specificity of dimerization(positions shown in blue).The expanded view of the first finger shows that discrimination between GRE and ERE target sequences rests on two amino acids at the base.第53页，讲稿共89张，创作于星期二4常见的反式作用因子中的DNA识别或结合域：1螺旋-转折-螺旋（helix-turn-helix,H-T-H）结构：这一类蛋白质分子中至少有两个螺旋，中间
28、由短侧链AA残基形成“转折”，近羧基端的螺旋中氨基酸残基的替换会影响该蛋白质在DNA双螺旋大沟中的结合。第54页，讲稿共89张，创作于星期二The helix-turn-helix domain第55页，讲稿共89张，创作于星期二HTH结构及其与DNA的结合 第56页，讲稿共89张，创作于星期二 2.锌指（Zinc finger）结构:锌指结构家族蛋白大体可分为锌指、锌钮（twist）和锌簇（cluster）结构，基特有的半胱氨酸和组氨酸残基之间氨基酸残基数基本恒定，有锌参与时才具备转录调控活性。这类蛋白质与DNA的结合很牢固，特异性也很高。第57页，讲稿共89张，创作于星期二蛋白质的锌指结构
29、 第58页，讲稿共89张，创作于星期二The zinc finger domain第59页，讲稿共89张，创作于星期二 back第60页，讲稿共89张，创作于星期二 3.碱性-亮氨酸拉链(basic-leucine zipper):即bZIP结构。在许多调控蛋白中发现的一段富含亮AA的序列，这个区域易形成螺旋或卷曲螺旋的构象，具有这种“拉链”形式的两个蛋白就能形成稳定的二聚体。拉链区以外的AA大都呈碱性，具的结合DNA的本领。第61页，讲稿共89张，创作于星期二Back第62页，讲稿共89张，创作于星期二The basic regions of the bZIP motif are held
30、together by the dimerization at the adjacent zipper region when the hydrophobic faces of two leucine zippers interact in parallel orientation.第63页，讲稿共89张，创作于星期二Back第64页，讲稿共89张，创作于星期二 4.碱性碱性-螺旋螺旋-环环-螺旋（螺旋（basic-helix/loop/helix）：即）：即bHLH结构。在免疫结构。在免疫球蛋白球蛋白轻链基因的增强子结合蛋白轻链基因的增强子结合蛋白E12与与E47中，羧基端中，羧基端100-
31、200个氨基酸残基可形个氨基酸残基可形成两个双性成两个双性螺旋，被非螺旋的环状结构螺旋，被非螺旋的环状结构所隔开，蛋白质的氨基端是碱性区，其所隔开，蛋白质的氨基端是碱性区，其DNA结合特性与亮结合特性与亮AA拉链类蛋白相似。肌拉链类蛋白相似。肌细胞定向分化的调控因子细胞定向分化的调控因子MyoD-1、原癌基因、原癌基因产物产物Myc及其结合蛋白及其结合蛋白Max等都属于等都属于bHLH蛋白。研究发现：蛋白。研究发现：bHLH类蛋白只有形成类蛋白只有形成同源或异源二聚体时，才具有足够的同源或异源二聚体时，才具有足够的DNA结合能力。结合能力。第65页，讲稿共89张，创作于星期二 5.同源域蛋白（
32、homeo domains）是指编码60个保守氨基酸序列的DNA片断，广泛存在于真核生物基因组内，与生物有机体的生长、发育和分化密切相关。许多含有同源转换区的基因具有转录调控的功能，同源转换区AA序列很可能参与形成了DNA结合区。第66页，讲稿共89张，创作于星期二 5 转录活化结构域：在真核核生物中，反式作用因子的功能受Pr-Pr之间相互作用的调节，完整的转录调控功能通常以复合物的方式来完成，所以并不是每个转录因子都直接与DNA结合。因此，是否具有转录活化域成为反式式作用因子中唯一的结构基础。第67页，讲稿共89张，创作于星期二 反式作用因子的功能具有多样性，其转录活化域也有多种，通常依赖于
33、DNA结合结构域以外的30-100个氨基酸残基。不同的转录活化域有下列几个特征性结构：1)带负电荷的螺旋结构：哺乳动物细胞中糖皮质激素受体的两个转录活化域都有酸性的螺旋结构，能特异性诱导转录起始的活性并不是很强，它们可能与TFD复合物中某个通用因子或RNA polymerase本身结合，并有稳定转录起始复合物的作用。第68页，讲稿共89张，创作于星期二 2)富含谷氨酰胺的结构：如SP1是启动子GC box的结合蛋白，除结合DNA的锌指结构以外，SP1共有4个参与转录活化的区域，其中最强的转录活化域富含谷氨酰胺占该区AA总数的25%左右。3)富含脯AA的结构：第69页，讲稿共89张，创作于星期二
34、七 激素及其影响 许多类固醇激素（如雌性激素、孕激素、醛固酮、糖皮质激素和雄激素）以及一般的代谢性激素（胰岛素），它们的调控作用是通过启始转录而实现的。固醇类激素是疏水性分子，可以自由出入细胞膜。靶细胞具有专一的细胞质受体，可与激素形成复合物，三维结构甚至化学性质变化。第70页，讲稿共89张，创作于星期二类固醇类固醇第71页，讲稿共89张，创作于星期二 激素至少以激素至少以5 5种方式启动基因的转录：种方式启动基因的转录：1 1激素直接与激素直接与DNADNA结合，促进结合，促进RNARNA聚合酶或其它蛋聚合酶或其它蛋白因子与转录起始区的相互作用。白因子与转录起始区的相互作用。2 2激素与效应
35、物相结合，改变其构象，并使之易于结激素与效应物相结合，改变其构象，并使之易于结合到合到DNADNA上，促进上，促进RNARNA聚合酶与启动区的结合。聚合酶与启动区的结合。3 3由于激素的存在，已经与由于激素的存在，已经与DNADNA结合的某个蛋白质被结合的某个蛋白质被激活，并且该激活，并且该PrPr的这种形式是的这种形式是RNARNA聚合酶结合时所必聚合酶结合时所必须的。须的。4 4激素是诱导物，它可以使阻碍物失活。激素是诱导物，它可以使阻碍物失活。5 5激素引起染色质的结构改变，暴露激素引起染色质的结构改变，暴露DNADNA，以促进，以促进RNARNA聚合酶的结合。聚合酶的结合。第72页，讲
36、稿共89张，创作于星期二八 其它水平上的基因调控 1 RNA的加工成熟：rRNA：分子内切割、化学修饰甲基化（原核：碱基甲基化；真核：核糖甲基化）tRNA：先生成tRNA前体，再加工成熟。mRNA：先生成核不均一RNA（hnRNA），再加工剪辑，即切掉内含子，连接外显子。第73页，讲稿共89张，创作于星期二 2 翻译水平的调控：主要表现在三个方面：1)Pr合成起始速率的调节。2)mRNA的识别：与5帽子结构密切相关。3)激素的影响。第74页，讲稿共89张，创作于星期二 3 Pr3 Pr的加工成熟的加工成熟 1 1多肽的切割加工多肽的切割加工 与与PrPr分泌有关的切割。分泌有关的切割。与与Pr
37、Pr活化有关的切割。活化有关的切割。上述两种均在高尔基体内进行信号肽的切除。上述两种均在高尔基体内进行信号肽的切除。2 2多肽的有限水解：多肽的有限水解：初生的初生的PrPr以以PrPr原或酶原形式存在，无生物活原或酶原形式存在，无生物活性，经过有限的酶解或化学水解成为有活性的性，经过有限的酶解或化学水解成为有活性的物质。物质。3 3多肽的化学修饰：多肽的化学修饰：PrPr的磷酸化。的磷酸化。PrPr的糖基化。的糖基化。第75页，讲稿共89张，创作于星期二九 真核基因在原核中的表达：（一）真核基因在原核中表达有下述特点：1 细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子。2 真核基因转录的mRNA缺
38、乏SD序列，不能结合到原核细胞的核糖体上，不能启动翻译过程。3 真核基因含有内含子（intron），原核细胞缺乏真核细胞转录的外加工体系，不能切除内含子，无法表达出真核蛋白。第76页，讲稿共89张，创作于星期二 4 表达的真核蛋白在原核细胞中不稳定，易被细菌蛋白酶破坏。5 用于表达的真核基因，必须删除信号肽编码序列，才能表达出成熟的蛋白质。因大肠杆菌缺乏真核表达系统的加工后处理功能，连同信号肽一并表达出的真核蛋白前体是无生物活性的。第77页，讲稿共89张，创作于星期二 6 对于必须糖基化修饰的真核蛋白，由于原核细胞缺乏真核细胞特有的糖基化修饰作用，故无法得到具有生物功能的真核糖基化修饰蛋白。7
39、 外源基因在原核细胞表达后，常以不溶性的包含体（including body）形式存在，它需经变性-复性(refolding)处理后，才能得到具有生物活性的蛋白质。第78页，讲稿共89张，创作于星期二（二）真核基因在大肠杆菌中的几种表达方式 1 融合蛋白：指蛋白的N末端由原核DNA序列或其它DNA序列编码，C端由真核DNA的完整序列编码。这样的Pr由一条短的原核多肽或具有其它功能的多肽和真核Pr结合在一起，故称为融合蛋白。第79页，讲稿共89张，创作于星期二 融合蛋白的特点：1在细菌内比较稳定，容易高效表达。2基因操作比较简单。3表达的融合蛋白经化学处理（CNBr），或特异Pr酶（如凝血因子，
40、胶原酶、凝血酶、肠激肽酶等）水解可以切除融合Pr氨基端的原核多肽，从而获得有生物活性的真核目的蛋白。第80页，讲稿共89张，创作于星期二 2 非融合蛋白：表达的目的蛋白的氨基端不含任何原核多肽序列，而以该蛋白RNA的AUG为起始。为此，表达非融合蛋白的操纵子必须改建成细菌或噬菌体的启动子细菌的核糖体结合位点（SD序列）真核基因的起始密码子结构基因终止密码子。其中SD序列与AUG之间的距离要适当，一般3-12个核苷酸为宜。第81页，讲稿共89张，创作于星期二 优点：具有非常近似于真核生物体内蛋白的结构，因此表达产物的生物学功能也就更接近于真核生物体内天然蛋白质。缺点：容易被细菌蛋白酶破坏。第82
41、页，讲稿共89张，创作于星期二 3 分泌型蛋白：将外源目的基因融合到编码原核蛋白信号肽序列的下游而实现分泌型表达。当蛋白质分泌到位于大肠杆菌细胞内膜与细胞外膜之间的周质时，信号肽可被信号肽酶切除。优点：1)一些可被宿主细胞内蛋白酶降解的外源表达蛋白在外周质中是稳定的。第83页，讲稿共89张，创作于星期二 2)有些在细胞内表达无活性的外源蛋白质，当其被分泌表达时则有活性，这是由于它们分泌后能按适当的正确方式折叠。3)由于Pr信号肽基因和编码序列之间被切割因而分泌后的Pr产物不含氨基端起始密码子ATG所编码的甲硫氨酸等。缺点：1)产量不高。2)信号肽不被切割。3)不在特异位置上切割。第84页，讲稿
42、共89张，创作于星期二 4 包含体（inclusion body）外源基因在原核细胞，尤其是在大肠杆菌中高效表达时，表达Pr往往在细胞质内聚集，称包含体。优点：它的形成有利于防止Pr酶对表达蛋白的降解，有利于分离表达产物。缺点：1表达蛋白不具生物活性，因此，必须溶解包含体并对表达蛋白进行复性。第85页，讲稿共89张，创作于星期二 2.负责水解起始密码子编码的甲硫氨酸水解酶，不能对所有表达蛋白都起作用，这就可能产生N末端带有甲硫氨酸的目的蛋白衍生物，从而影响蛋白质的性质。包含体形成的原因：1)表达蛋白生成速率高，无足够的时间使肽链折叠。2)表达蛋白浓度高，无足够空间折叠。3)与宿主菌培养温度、p
43、H、及某些金属离子不足等因素有关。第86页，讲稿共89张，创作于星期二 包含体的主要成分：在大肠杆菌中形成的包含体大小可达0.5-1.0um,比重1.2左右。主要成分为表达产物；RNA聚合酶的四个亚基、外膜蛋白、16S或23SrRNA、环状和缺口质粒DNA及脂质、肽聚糖和脂多糖。第87页，讲稿共89张，创作于星期二 从包含体分离表达蛋白的常用方法：1)破碎菌体（超声或匀浆），离心取得包含体。2)用蛋白变性剂（6-8mol/L脲或pH2.0-4.5的酸性溶液溶解包含体。3)复性：使被溶解的表达蛋白恢复活性的过程。逐渐降低变性剂浓度、使表达蛋白恢复其天然构型。同时控制蛋白浓度、纯度、pH、离子强度及温度等。第88页，讲稿共89张，创作于星期二感谢大家观看第89页，讲稿共89张，创作于星期二