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1、关于真核生物基因表达的调控(2)第1页，讲稿共156张，创作于星期二 多细胞真核生物的每一个体细胞中都有相同的遗传物质，然而，只有一小部分的遗传信息在不同细胞中得以表达。正是因为在特定时间和空间，不同基因在表达水平上的精确调控，导致了各种细胞的千差万别。真核生物基因表达的调控是一个多层次的、多级的过程，涉及到染色质中基因的活化、基因的转录、转录产物的加工、蛋白质合成及其产物的剪切与修饰等，这些表达的准确性与协调性是细胞生命活动所必不可少的。因此，真核生物采取了不同于原核生物的更加复杂而精细的调控策略。真核生物基因表达的调控，是当前分子生物学中最活跃的研究领域之一。掌握真核生物基因表达的调控，对
2、于理解真核生物生命活动的规律有重要意义。同时，对于更好地控制作物的生长发育，用更好的方法治疗心血管疾病和肿瘤等非传染性疾病，更好的用真核生物表达目的基因有显而易见的促进作用。第2页，讲稿共156张，创作于星期二12.1 真核生物基因表达调控的特点真核生物基因表达调控的特点真核生物细胞结构比原核生物复杂，核膜将细胞质和细胞核分开，从而导致转录和翻译在时空上的分隔。核内进行基因的转录及其加工，胞质进行翻译，并且真核生物基因组和染色体结构复杂，基因组DNA以核小体的形式存在，蕴含大量的调控信息，因此真核生物基因表达的调控要比原核生物复杂得多。另外，真核生物基因表达可随细胞内外环境条件的改变及生长发育
3、的不同阶段而呈现精确的调节，即真核生物基因表达的调控可以发生在基因表达的任何环节，包括染色体和DNA水平、转录水平、转录后水平和翻译水平等多层次的调控。第3页，讲稿共156张，创作于星期二12.1.1 原核生物和真核生物基因表达调控的差别原核生物和真核生物基因表达调控的差别 （1）原核生物的DNA不与蛋白质形成核小体结构，也没有核膜将基因转录和翻译隔离开来，基因转录和翻译相互偶联，而且mRNA的半衰期很短，一种mRNA必须持续转录才能维持蛋白质的合成，因此原核生物基因表达的调控主要在转录水平。而真核生物形成了以核小体为单位的染色质结构，出现了染色质结构对基因表达的调控作用，尤其是核膜的存在，把
4、基因的转录和翻译分别分隔在细胞核和细胞质中进行，使它们在时空上得以分开，而且转录和翻译产物还需要经过复杂的加工与转运过程，从而形成了真核生物基因表达调控的多层次性。第4页，讲稿共156张，创作于星期二（2）无论原核生物还是真核生物，基因表达调控的机制都包括正调控和负调控，原核生物以负调控为主，而真核生物以正调控更为常见，这与它们染色质的结构有关。真核生物与组蛋白形成核小体和染色质结构，使得RNA聚合酶难以发现启动子序列，因而常态下的真核生物基因表达处于非活化状态。只有在各种激活蛋白的帮助下，使RNA聚合酶和转录因子能够接近启动子序列，才能启动基因的表达。真核生物的基因转录表现为独立模式，即一个
5、基因产生一个单顺反子mRNA（秀丽隐杆线虫是目前发现唯一的例外），而原核生物中可由一组基因产生一个多顺反子mRNA。第5页，讲稿共156张，创作于星期二（3）真核生物的基因数目比原核生物多，而且大多数基因都有内含子，还存在大量的重复序列。如人类细胞基因组约有DNA3.3109bp，约为大肠杆菌总DNA的700倍，其中约2.9109bp为常染色质，人类基因组含2.02.5万个基因，与蛋白质合成有关的外显子序列仅占1%。原核生物蛋白质的长度较真核生物小，如大肠杆菌蛋白质的平均长度是317个氨基酸，达500个氨基酸大小的蛋白质极少，而真核细胞中约1/3蛋白质具有500个氨基酸。（4）真核生物基因表达
6、调控不仅受细胞内外环境的影响，还要随发育的不同阶段表达不同的基因，前者属于短期调控或称可逆调控，后者属于长期调控或称不可逆调控，决定真核生物细胞生长分化的发育进程。第6页，讲稿共156张，创作于星期二一个典型的细菌DNA可编码约3000种多肽，其中约1/3在特定时间表达。而一个典型的哺乳动物细胞约含有2万2.5万编码蛋白的基因，由于选择性剪接，可合成5万6万种蛋白质。真核生物细胞有大量的DNA和大量的蛋白质需要组装，所以真核生物基因表达是一个复杂的过程。细胞不仅要从染色体上找出这些基因，还要调控这些基因表达的水平。由于蛋白质的合成包括许多步骤，因此需要分级进行调控（图12.1）。12.1.2
7、真核生物基因表达调控的层次真核生物基因表达调控的层次第7页，讲稿共156张，创作于星期二12.2染色体水平的调控染色体水平的调控12.2.1 异染色质化对基因活性的影响异染色质化对基因活性的影响真核生物细胞在有丝分裂完成之后，大多数高度压缩的染色体要转变成间期的松散状态，这些区域构成常染色质常染色质。但是，大约有10%的染色质仍然保持压缩状态,无转录活性，称异染色质异染色质。异染色质高度压缩，所以异染色质区的基因转录处于被抑制状态，而常染色质区的基因具有转录活性。结构异染色质结构异染色质（constitutiveheterochromatin）在整个细胞周期内都处于凝集状态，即永久性的呈现固缩
8、状态，多定位于着丝粒区、端粒区，含有大量高度重复顺序的DNA，即卫星卫星DNA。兼性异染色质兼性异染色质(facultativeheterochromatin)只在一定细胞类型或一定发育阶段凝集，如雌性哺乳动物含一对X染色体，其中一条始终是常染色质，但另一条在胚胎发育的第1618天变为异染色质，只有一条X染色体具有活性，这些使得雌、雄动物之间虽X染色体的数量不同，但X染色体上基因产物的剂量是平衡的。雌性的三色猫是一个X-连锁基因杂合体，X-连锁的b基因控制橙色毛皮，其等位基因B是控制黑色的毛皮。带有b基因的X染色体若失活，B基因表达产生黑色毛斑，若带有B基因的X染色体若失活，b基因表达则产生橙
9、黄色毛斑。因此，其腹部的毛是白色的，背部和头部的皮毛由桔黄色和黑色斑组成。第8页，讲稿共156张，创作于星期二12.2.2组蛋白对基因活性的影响组蛋白对基因活性的影响12.2.2.1 组蛋白和核小体组蛋白和核小体 用微球菌核酸酶切断真核生物的DNA可获得独立完整的核小体核小体，它由核小体核心和连接区（linkerDNA）组成，通常含有200个碱基对的DNA和9个组蛋白分子。核小体核心由组蛋白H2A、H2B、H3、H4各2个分子形成八聚体，146个碱基对DNA在八聚体上缠绕近2圈，其DNA不易被核酸酶消化。核心组蛋白均由三个-螺旋和两个环组成，N端形成向外自由伸展的尾状结构（图12-2a）。连接
10、区的DNA结合组蛋白H1，封闭了核小体核心（图12-2b）。H1数量相当于核心组蛋白的一半，所以很容易从染色质中抽提出来。一连串核小体呈螺旋状排列构成直径30nm的纤丝，使DNA的长度压缩40倍（图12-2c）。纤丝再进一步压缩成为常染色质，DNA的长度压缩约1000倍（图12-2d）。有丝分裂时染色质进一步压缩为染色体，压缩包装比高达10000（图12-2e）。染色质必须转变成松散的核小体，才能进行基因转录。第9页，讲稿共156张，创作于星期二组蛋白富含精氨酸和赖氨酸，在细胞内含量丰富，是高度保守的蛋白质。最保守的是H4，它有102个氨基酸，牛与豌豆的H4只有两个氨基酸的差异。H3也比较保守
11、，而H1在各物种之间差异较大。研究发现，组蛋白修饰与去修饰包括乙酰化/去乙酰化、甲基化/去甲基化等都可以影响染色质的结构和功能。第10页，讲稿共156张，创作于星期二12.2.2.2 组蛋白对基因活性的影响组蛋白对基因活性的影响早在1984年，DonaldBrown等人发现爪蟾卵母细胞5SrRNA基因可以在卵母细胞中转录，而不能在体细胞中转录。他们通过实验证实，组蛋白在体外对基因的活性有影响，TFIIIA、TFIIIB、TFIIIC等转录因子与组蛋白竞争结合基因的调控区。卵母细胞5SrRNA基因在体细胞中与转录因子结合能力较低，而与组蛋白结合力强，从而形成稳定的核小体结构，抑制基因转录。而卵母
12、细胞5SrRNA基因在卵母细胞中与转录因子结合能力强，阻止组蛋白和DNA的交联，不形成核小体结构，则基因有转录活性。他们进一步实验发现，在无活性的染色质中，含有5种全部的组蛋白，而在有活性的染色质中没有组蛋白H1，说明在爪蟾卵母细胞中组蛋白H1比核心组蛋白（H2A、H2B、H3、H4）抑制转录的作用更强。第11页，讲稿共156张，创作于星期二对于转录因子如何作用于包装在核小体上的DNA调节序列，提出了两种假说：一种是具有ATP酶活性的染色质重塑因子染色质重塑因子（chromatinremodelingfactors），它们通过重构核小体的组蛋白核心或改变DNA链在核小体上的位置来增加启动子序列
13、与转录因子的可接触性,从而激活基因转录。另一种是组蛋白乙酰转移酶组蛋白乙酰转移酶(histoneacetyltransferases,HATs)家族,通过对核心组蛋白N-端尾部的赖氨酸残基的乙酰化来实现基因转录的调控。大量实验证明，两种假说均在真核生物的转录调节中发挥重要的作用。此外，其它形式的化学修饰,包括组蛋白末端的甲基化、磷酸化和泛素化等，对真核生物基因转录的调节也极为重要。第12页，讲稿共156张，创作于星期二（1）染色质重塑染色质重塑染色质中与转录相关的结构变化称为染色质重塑染色质重塑（chromatinremodeling），主要指转录因子进入核小体，建立起有活性的启动子结构的过程
14、。当活化转录的转录因子或称活化蛋白与DNA调节序列结合后，使核小体移位或者去组装暴露出启动子从而允许通用转录因子与启动子的结合，启动基因转录。这些活化蛋白大多是ATP依赖的染色质重塑因子，可重新定位核小体,改变核小体结构,共价修饰组蛋白。用核酸酶处理的染色质在凝胶电泳时，转录的和不转录的基因都出现了200bp间隔的DNA带，说明转录的和非转录的基因都是有核小体结构的，因此认为转录的起始过程中需要核小体的移位，即RNA酶结合部位的核小体需要暂时移开，等待RNA聚合酶作用后再重新组装。这种核小体移位的效应可能与活化蛋白的活动有关。第13页，讲稿共156张，创作于星期二染色质重建实验发现，Sp1和G
15、al4等转录活化因子可以逆转H1对基因转录的抑制。与裸露的DNA相比，纯化的DNA加入核心组蛋白温育后重建的染色质转录能力下降了75%，当再加入组蛋白H1时，转录能力可进一步下降25100倍。如果在加入H1前先加入Sp1和Gal4等活化蛋白，这种组蛋白基因转录抑制效应可被活化因子所阻止。另外，果蝇的GAGA序列被发现可以结合热休克蛋白Hsp70启动子中富含CT的位点，瓦解核小体的结构。可见，转录因子和组蛋白竞争性地与基因表达的调控区结合。若调控区结合组蛋白，基因无转录活性，若调控区结合转录因子，则基因有转录活性（图12-3）。第14页，讲稿共156张，创作于星期二关于转录活化因子调节基因表达机
16、制的假说有两种：一个转录因子独立地与核小体DNA结合,然后这个活化因子再结合一个重塑因子，导致附近核小体结构发生稳定性的变化，又导致其它转录因子的结合，这是一个串联反应的过程。由重塑因子首先独立地与核小体结合，不改变其结构，但使其松动并发生滑动，这将导致转录因子的结合，从而使新形成的无核小体的区域稳定。总结起来，转录因子与组蛋白处于动态的竞争之中，首先替换核小体中的部分的或者全部的组蛋白，导致染色质经历结构的改变，即进行染色质的重塑，才能启动基因的转录，这是一个耗能的过程。第15页，讲稿共156张，创作于星期二在转录的过程中，随着转录泡的移动，需要进行连续的染色质重塑，在此过程中，重塑因子复合
17、物的作用非常重要（图12-4）。这些复合物都具有ATP酶活性。从酵母和果蝇体内发现的重塑因子复合物包括两种SWI/SNF复合物和三种ISWI（imitationSWI）复合物。SWI/SNF复合物家族包括BRG1、hBRM和ISWI相关复合物。ISWI复合物家族包括RSF、HuCHRAC和CAF1。ISWI相关复合物只识别核小体，而SWI/SNF复合物识别核小体和裸露的DNA，亲和力高，通过与DNA作用，可移动核小体，产生更易被影响的DNA区域，且SWI/SNF的作用不受组蛋白N端或C端修饰的影响。染色质重组过程中，核小体滑动可能是一种重要机制，它不改变核小体结构，但改变核小体与DNA的结合位
18、置。第16页，讲稿共156张，创作于星期二转录因子以及染色质重塑因子与启动子上特定位点结合后，引起特定核小体位置的改变(滑动)，或核小体三维结构的改变，它们都能改变染色质对核酶的敏感性。用DNAaseI处理染色质，再用特定基因的cDNA作为探针，可以测定某个基因被DNAaseI降解的情况。研究发现，活性基因优先被降解。例如，从小鸡红细胞提取的-球蛋白基因和卵清蛋白基因分别用DNAaseI处理，-球蛋白基因很快被降解，卵清蛋白基因却很少被降解。然而，从小鸡输卵管细胞提取的这两种基因，DNAaseI处理后，优先降解的是卵清蛋白基因。由此可见，基因活化时染色质的结构发生了变化，对DNAaseI敏感性
19、的提高成为衡量活性基因区域内染色质结构变化的一个重要指标。第17页，讲稿共156张，创作于星期二（2）组蛋白的修饰组蛋白的修饰组蛋白N-末端氨基酸残基可发生乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、多聚ADP糖基化等多种共价修饰作用。第18页，讲稿共156张，创作于星期二真核细胞通过多途径的翻译后修饰实现对染色质结构和功能的精确调控，从而调控转录、DNA复制、DNA修复和基因组稳定性。组蛋白翻译后修饰所引起的染色质结构重塑在真核生物基因表达调控中发挥着重要的作用。通过组蛋白氨基末端残基的翻译后修饰对染色体结构和基因转录进行调控,是目前表观遗传表观遗传学学（epigenetics）研究领域的重要部分。组蛋
20、白的修饰可通过影响组蛋白与DNA双链的亲和性，从而改变染色质的疏松或凝集状态，或通过影响其它转录因子与结构基因启动子的亲和性来发挥基因调控作用。单一组蛋白的修饰往往不能独立地发挥作用，一种修饰的存在可以指导或抑制同一组蛋白上另一修饰的存在，形成一个修饰的级联。这些修饰可作为一种标志或语言,也被称为“组蛋白密码组蛋白密码”（histonecode），组蛋白密码大大丰富了传统遗传密码的信息含量。第19页，讲稿共156张，创作于星期二早在1964年，VincentAllfrey就发现组蛋白既有乙酰化形式，也有非乙酰化形式，乙酰化主要发生在赖氨酸的-氨基上。组蛋白乙酰化可以激活转录，其机理可能是：将乙
21、酰辅酶A的乙酰基转移到Lys的-NH3+，消除其正电荷，这样可减弱DNA与组蛋白的相互作用，松散染色质结构，以便转录因子和RNA聚合酶与DNA的结合，促进转录起始复合物的装配，从而激活转录。研究发现，8聚体的核心蛋白有32个潜在的乙酰化位点，H3和H4乙酰化的程度大于H2A和H2B。果蝇活性染色质的H4乙酰化可发生在Lys-5、Lys-16和Lys-78位点，表明组蛋白的乙酰化有位点特异性。第20页，讲稿共156张，创作于星期二染色质特定部位的组蛋白乙酰化状态主要由组蛋组蛋白乙酰化酶白乙酰化酶(histoneacetylases,HAT)和组蛋白去乙酰化组蛋白去乙酰化酶酶(histonedea
22、cetylases,HDAC)催化完成的。HAT通过在组蛋白赖氨酸残基乙酰化，激活基因转录，而HDAC使组蛋白去乙酰化，抑制基因转录。Kleff等在温度敏感性酵母突变株细胞提取物中发现至少有两种HAT，可使H4第128个氨基酸残基中的Lys乙酰化。转录共激活因子CBP、P300、Gcn5P、TAFII-250和PCAF都被发现实质上是体内的组蛋白乙酰基转移酶。真核细胞HAT分为两型：A型主要存在于胞核中，与染色质结合，乙酰化染色质组蛋白。B型主要存在于胞浆中，乙酰化游离的组蛋白。第21页，讲稿共156张，创作于星期二当不需要转录某种基因时，组蛋白去乙酰化酶可以催化组蛋白的去乙酰化，降低组蛋白的
23、乙酰化程度，使染色质回复到转录抑制状态。HDAC最早是在鸡红细胞的核基质中发现的，目前大约有5种去乙酰化酶已被识别。组蛋白去乙酰化常伴随基因沉默。生化测定发现，在基因抑制的区域有低乙酰化的组蛋白积聚，HDAC抑制剂能够诱导某些基因的转录，说明HDAC确实与基因的抑制有关。根据与酵母HDACs的同源性，去乙酰化酶被分为三类：第一类与酵母的Rpd3相似，主要在细胞核内与转录辅助因子结合。第二类与酵母的Hda1相似，相对分子质量较大，在胞核与胞浆中相互转运。第一与第二类HDACs均对去乙酰化酶抑制剂trichostatinA（TSA）敏感。第三类与酵母的Sir2相似，需要NAD+作为辅酶，但对TSA
24、不敏感。第22页，讲稿共156张，创作于星期二组蛋白乙酰化和去乙酰化与基因表达调控密切相关，HAT和HDAC之间的动态平衡控制着染色质的结构和基因的表达。组蛋白乙酰化状态的失衡与肿瘤发生密切相关。最近有研究发现，肿瘤细胞的组蛋白大部分呈低乙酰化状态，因此基于细胞内组蛋白乙酰化调控机制来设计开发抗肿瘤药物成为研究热点。组蛋白去乙酰化酶抑制剂可以增强细胞内组蛋白乙酰化状态，从而改变肿瘤的生物学特性，而且去乙酰化酶抑制剂作用靶点是整个基因组而不是单个基因，所以去乙酰化酶抑制剂在肿瘤治疗中具有较好的应用前景。第23页，讲稿共156张，创作于星期二组蛋白甲基化是指发生在H3和H4组蛋白N-端赖氨酸或者精
25、氨酸残基上的甲基化，由组蛋白甲基转移酶催化。赖氨酸可以分别被一、二、三甲基化，精氨酸只能被一、二甲基化。组蛋白H3的K4、K9、K27、K36、K79和H4的K20均可被甲基化。组蛋白甲基化的功能主要体现在异染色质形成、基因印记、X染色体失活和转录调控方面。在组蛋白H3上，共有5个赖氨酸位点可以被甲基化修饰。Su(var)3-9蛋白是在果蝇中发现的第一个组蛋白赖氨酸甲基转移酶赖氨酸甲基转移酶，到目前为止，已发现了数十种赖氨酸甲基转移酶和两大类组蛋白精氨酸甲基转移酶精氨酸甲基转移酶(proteinargininemethyltransferase，PRMT)。第24页，讲稿共156张，创作于星期
26、二一般来说,组蛋白H3K4位点的甲基化主要聚集在活跃转录的启动子区域。H3K9、H3K27、H3K79、H4K20位点的甲基化发挥转录抑制作用。最早被发现的组蛋白赖氨酸甲基转移酶Suv3-9可直接作用于组蛋白H3的Lys9使之甲基化，其催化结构域位于一个高度保守的SET结构域，该结构域名称来源于果蝇参与表型遗传的3个基因Su(var)3-9、E(z)和Trithorax。H3K9甲基化后与招募来的HP1蛋白结合，RB蛋白招募Suv39/HP1复合体，共同控制cyclinE启动子，从而实现转录抑制功能。缺失RB蛋白时，H3K9是不甲基化的，而且HP1和cyclinE启动子也是不相关的。所以认为必
27、须要有RB蛋白才能发挥H3K9甲基化的转录抑制功能。值得注意的是，RB蛋白调控的赖氨酸甲基化都发生在该位点去乙酰化后，现在还不清楚是不是RB蛋白本身在募集去乙酰化酶和甲基转移酶过程中本身就有顺序性。目前从酵母到人，多个物种中已经分离到十几个组蛋白H3赖氨酸甲基转移酶。它们的共同特点是除了组蛋白H3-K79甲基转移酶Dot1，其它都含有SET结构域，可以特异性地修饰组蛋白的不同位点。第25页，讲稿共156张，创作于星期二组蛋白的甲基化曾被认为是不可逆的过程。但组蛋白去甲基化酶的发现，使这一观点面临巨大挑战。最早发现的是一种可以将甲基化的精氨酸转变为瓜氨酸同时释放甲胺的蛋白PAD4(peptidy
28、largininedeiminase4)，PAD4可以作用于H3、H4的多个精氨酸位点。随后，又发现一种具有去甲基化和转录阻遏功能的蛋白LSD1（Lysinespecificdemethylase1）。在FAD的参与下，LSD1在体外可以特异性去掉H3K4的二甲基和一甲基修饰，在体内则可以去掉H3K9的二甲基和一甲基修饰。最新的研究发现，JHDM1(JmjCdomain-containing去甲基酶1)在二价铁离子和酮戊二酸盐的存在下，特异地使甲基化的H3-K36去甲基化，并产生甲醛和琥珀酸盐。在生物体内，JHDM1的过表达可以降低二甲基化的H3-K36的水平，并可以去掉赖氨酸的三甲基化修饰。
29、在S.cerevisiae中，JHDM1的同源物同样具有去甲基化酶的活性。从某种角度上来讲，PAD4将甲基化的精氨酸转变为瓜氨酸，改变了一个氨基酸残基，并不是严格意义上的去甲基化反应，而JHDM1则可以认为是一种去甲基化酶。首先，两者的反应机制不同。其次，LSD1蛋白家族中只有一少部分蛋白与去甲基化相关，而JHDM1 拥有一个巨大的家族，具有潜在的能力来调节和抑制不同的组蛋白甲基化。最后，LSD1的去甲基化反应需要质子化的氮，因而限制了它对三甲基化的组蛋白去甲基化的能力。第26页，讲稿共156张，创作于星期二12.2.3 非组蛋白对基因活性的影响非组蛋白对基因活性的影响 真核生物染色体DNA除
30、了与组蛋白结合，还与大量的非组蛋白结合。非组蛋白非组蛋白是指细胞核染色体中除组蛋白以外的所有蛋白质，包括高迁移率族高迁移率族HMG蛋白蛋白，以DNA作为底物的酶，如RNA聚合酶，以及作用于组蛋白的一些酶，如组蛋白甲基化酶，具有相对分子质量小、富含带电荷氨基酸的特点。大量的实验证实，非组蛋白在间期细胞核中与DNA相连能解除组蛋白对DNA转录的抑制，促进DNA转录，而且非组蛋白还能决定转录出的mRNA的性质。这表明非组蛋白是重要的基因调控成分。小鼠染色质重建实验可以很好的说明非组蛋白对转录起着重要的作用（图12-6）。第27页，讲稿共156张，创作于星期二第28页，讲稿共156张，创作于星期二非组
31、蛋白调节基因表达的机制可能与它的磷酸化有关。非组蛋白结合在DNA的某一特定位置上，非组蛋白磷酸化以后，磷酸基带负电荷，与带负电荷的DNA相斥，并与带正电荷的组蛋白结合。结合的组蛋白与非组蛋白复合体从DNA上脱离，于是解除组蛋白对DNA的抑制作用，DNA裸露出来并开始转录。如果非组蛋白去磷酸化，即与组蛋白分开，组蛋白重新结合DNA，使活化的DNA抑制，转录停止。细胞内的cAMP通过激活蛋白激酶使非组蛋白磷酸化，磷酸化后的非组蛋白与组蛋白结合，解除其对DNA的抑制作用。目前研究的比较清楚的非组蛋白当属HMG蛋白，这类蛋白质相对分子质量比较小，在聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移速率很高，因此把它们称为高迁移
32、率蛋白或HMG蛋白。HMG蛋白共有三个家族：HMG1/2、HMG14/17、HMGI（y）。研究发现，HMGI（y）可以结合到DNA小沟中富含AT的结构，借助其羧基端酸性氨基酸的结构域和转录因子相互作用，参与病毒诱导的人干扰素基因的表达调控。第29页，讲稿共156张，创作于星期二另外，HMG蛋白还和染色质DNA对DNaseI敏感性有关。用DNA酶I处理鸡红细胞染色质时，优先释放出HMG14和HMG17两种非组蛋白。缺乏HMG14和HMG17时，染色质中正在转录着的基因组序列便失去了对DNA酶I的优先敏感性。一旦把HMG14和HMG17重组到缺乏HMG的染色质中之后，这种敏感性就可以恢复。通过这
33、种染色质重建研究，和固相化HMG14和HMG17的亲和层析分析，可知HMG14和HMG17选择性地与转录活跃序列的核小体相结合，一分子的HMG使大约1020个核小体染色质具有对DNA酶I的优先敏感。新近的研究发现在爪蟾卵提取物中HMG17掺入到DNA复制后新组装的染色质中会促进RNA聚合酶III的基因转录。而HMG14则可直接参与RNA聚合酶II对染色质中基因的转录。说明HMG与DNA的结合会使染色质结构松散，使得染色质对DNaseI敏感。可能的机制是，HMG蛋白羧基端的酸性氨基酸结合核心组蛋白的碱性氨基酸，竞争性的取代核小体上的H1，使染色质结构变得松散，从而导致了染色质的活化。第30页，讲
34、稿共156张，创作于星期二12.2.4 核基质对基因活性的影响核基质对基因活性的影响 核基质核基质（nuclearmatrix）亦称核骨架，是指真核细胞核内除去核膜、核纤层、染色质、核仁以外的一个由纤维蛋白构成的网架体系。呈网络状的核基质纤维充满核空间，与核纤层和核孔复合体相连，核仁被网络在核基质纤维的网架中。核基质、核纤层和中等纤维形成一个贯穿于核质间的统一网架结构体系。核基质纤维的直径为330nm，主要成分是纤维蛋白，其中相当部分是含硫蛋白，并含有少量RNA，是以蛋白质为主并含有少量RNA的复合物。核基质具有广泛生物学效应，它可能参与染色体DNA有序包装和构建，对于间期核内DNA有规律的空
35、间构型起着维系和支架作用，可能是DNA复制的基本位点，与基因表达密切有关，可能是细胞核中RNA转录位点和hnRNA的加工场所。第31页，讲稿共156张，创作于星期二核基质的作用方式主要是提供结合位点，核基质结合区核基质结合区(matrixattachmentregion，MAR)是一段在体外能与核基质结合的富含AT的DNA序列。研究发现，MAR能使染色质形成环状结构。将MAR构建到目的基因两侧并以此载体转化至生物体中，发现它能增强基因转录表达水平及稳定性，在一定程度上降低转基因个体或细胞系之间转基因的表达水平的差异，这很可能是降低了基因沉默所致。另外，核基质还可以使染色体开放。当HMGI（y）
36、大量存在时，MAR可以和染色质中的HMG相互作用而取代组蛋白H1，促使染色质处于松散状态，这样RNA聚合酶就容易接近染色质，从而提高基因表达水平。核基质的功能不仅仅依靠核基质本身的蛋白质完成，更重要的是要通过多种核基质结合蛋白的共同参与，完成核基质复杂多样的生物学功能。长期以来人们对此进行了大量的研究，并证实细胞信号识别和细胞周期的调控因子以及病毒特异的调控蛋白等能够紧密结合在核骨架结构上。第32页，讲稿共156张，创作于星期二12.2.5 基因的丢失基因的丢失研究发现，有的生物在个体发育过程中，体细胞中RNA合成的DNA模板也会发生规律性的变化，如基因本身或其拷贝数发生了永久性的改变，来控制
37、基因表达和生物体的发育。基因丢失基因丢失（geneloss）是指真核生物随着细胞的分化丢失染色体中部分DNA片段的现象。随着染色体上部分DNA片段的丢失，最终造成基因的丢失。然而，在生殖细胞中保持着全部的基因组，被丢失的染色体上的遗传信息对体细胞来说可能没有意义，但对生殖细胞或许是不可缺少的。马蛔虫受精卵染色体的丢失是一个很好的例子。马蛔虫受精卵细胞内只有一对染色体，但染色体上有多个着丝粒。在发育的早期，只有一个着丝粒起作用，使有丝分裂顺利进行。但到发育后期，在纵裂的细胞中染色体分成很多的小片段，有的含有着丝粒，有的不含着丝粒，其中不含着丝粒的染色体片段丢失。然而，横裂的细胞中染色体并不丢失。
38、第一次有丝分裂是横裂，产生上下两个子细胞。上面的子细胞在第二次卵裂时发生纵裂，丢失部分染色体，而下面的子细胞仍然发生横裂，最终发育成生殖细胞。最近研究发现，基因丢失可能还参与肿瘤的发生。实验证实，某些肿瘤细胞中含Rb和p53等抑癌基因的染色体位点上有特异性的基因缺失，造成它们功能的部分或者全部丧失，导致肿瘤的发生。第33页，讲稿共156张，创作于星期二12.2.6 基因的扩增基因的扩增 基因扩增基因扩增（geneamplification）指基因组中某些基因的拷贝数大量增加，使细胞在短期内产生大量的基因产物来满足生长发育需要的现象。例如，爪蟾的卵母细胞利用基因扩增方式，转录生成大量的rRNA，
39、为胚胎发育准备大量的合成场所，满足胚胎快速发展的需要。爪蟾卵母细胞染色体上有约450拷贝的18S、5.8S和28S的rRNA基因，它们是环状的DNA，以滚环的方式进行复制扩增，复制两次可使基因的拷贝数扩大1000倍以上。通过这种方式，非洲爪蟾卵母细胞中rDNA的拷贝数可由平时的500份急剧增加到200万份，以适应胚胎发育对核糖体的需求。基因扩增也可经诱导产生。氨甲喋呤是二氢叶酸还原酶（DHFR）的竞争性抑制剂，可阻断叶酸的代谢。研究发现，用氨甲喋呤处理培养的细胞，可以筛选出耐氨甲喋呤的细胞，对这种细胞的DNA进行分析，检测到二氢叶酸还原酶基因发生了突变，因此才对氨甲喋呤产生了抗性。在经过几轮筛
40、选后，这个抗性基因可扩增上千倍。这些抗性基因扩增的细胞中，含有许多染色体外的成分，称作微小染色体，它们可能是通过DHFR拷贝之间或者等位基因之间的非同源重组而产生的。另外，在癌细胞中也经常可以检查出癌基因的扩增。例如，在胃癌、肠癌和白血病患者中，原癌基因c-myc都增加了数十倍第34页，讲稿共156张，创作于星期二12.3染色体基因的重排染色体基因的重排染色体重排染色体重排（chromosomalrearrangement）是指染色体发生断裂与别的染色体相连，或者通过基因的转座、DNA的断裂错接而使正常基因顺序发生改变。染色体重排可以产生新的基因，表达新的基因产物。染色体基因重排是原核和真核生
41、物中广泛存在的基因表达调控机制。12.3.1免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白免疫球蛋白（Immunoglobulin,Ig）是有抗体活性的糖蛋白，主要存在于血浆，也见于其它体液、组织和一些分泌液中。人血浆内的免疫球蛋白大多数为-球蛋白，可分为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE五类。其中IgG是最主要的免疫球蛋白，约占人血浆丙种球蛋白的70%，Mr约15万，含糖23%，由2条肽链Mr为2.5万的轻链，和2条Mr为5万的重链组成，轻链与重链之间通过二硫键相连接（图12-7a）。免疫球蛋白是机体受抗原（如病原体）刺激后产生的，其主要作用是生成抗原-抗体复合物，使病原体失去致病作
42、用（图12-7b）。第35页，讲稿共156张，创作于星期二自然界的抗原种类极多，每种抗原有不同的抗原决定簇，因此具有多种特异性的免疫球蛋白分子必定有极多的种类，估计一个哺乳动物体内可产生106108种不同的抗体。可是，脊椎动物基因组内所有的基因总共不过几万个左右。因此，决不可能有那么多的免疫球蛋白基因去编码每一种特定的免疫球蛋白分子。研究证明，免疫球蛋白的多样性是通过基因重排形成的。第36页，讲稿共156张，创作于星期二免疫球蛋白的两条重链和两条轻链分别是由三个独立的基因簇所编码，其中两个编码轻链和，一个编码重链，他们分别位于6、16和12号染色体上。决定轻链的基因组上分别有L、V、J和C四类
43、基因片段，决定重链的基因组上共有L、V、D、J和C五种基因片段。L代表前导片段前导片段（leadersegment），V代表可变片段可变片段（variablesegment），J代表连接片段连接片段（joiningsegment），C代表恒定片段恒定片段（constantsegment），D代表多样性片段多样性片段（diversitysegment）。在胚胎细胞中，V、J、(D)和C基因是分散排列的，相隔较远。在B细胞发育成熟过程中，组成免疫球蛋白分子的各个基因片段进行体体细胞重组细胞重组（somaticrecombination），V区发生D-J或V-D-J重排，与C基因连接，转录产生mRN
44、A。随机重排的结果可以产生1081010种免疫球蛋白分子。第37页，讲稿共156张，创作于星期二12.3.1.1 重链的重排重链的重排在B淋巴细胞发育分化时，形成有功能的重链基因需要经过两次在DNA水平的重排（图12-8）。第一次是D基因片段移位到J基因片段处，删除二者之间的序列，形成D-J连接。第二次是V与D-J的重排形成V-D-J连接。从数百个V基因中随机选择一个，形成有转录功能的V-D-J复合物，这是Ig基因表达的一个关键控制点。这样，就形成一个完整的转录单位，转录形成的mRNA前体还需要切除V-D-J与C之间的内含子，才能成为成熟的mRNA分子，指导免疫球蛋白的翻译合成。目前所知，一个
45、重链区可以通过300个V基因，20个D基因，和4个J片段的重组而产生数千种肽链。第38页，讲稿共156张，创作于星期二第39页，讲稿共156张，创作于星期二12.3.1.2 轻链的重排轻链的重排轻链重排的机制与重链基本相同，但L链只进行一次DNA水平的重排。首先V与J基因片段连接形成V-J，然后V-J与C基因相连形成L链的mRNA。两个编码轻链的基因簇和哪一个发生重排是随机的，但一个发生重排，另一个的重排就会受到抑制，这就是轻链的类型排斥。在淋巴B细胞发育中，只有链重排失败，才会发生的重排。轻链基因可以通过300个V基因和4个J片段重组而产生数百种肽链。免疫球蛋白基因的重组发生在高度保守的回文
46、结构的七聚体碱基序列，其间由12或23个碱基对将其与一个富含A/T的九聚体碱基序列相隔。重组以双链断裂（double-strandbreaks）机制，经重组激活基因编码的RAG1/2蛋白识别、催化、切除与连接来完成(见图6-15)。重链和轻链通过基因重排，产生在DNA水平上的多样性。轻链和重链之间的随机组合，又增加了免疫球蛋白的多样性，这就是免疫球蛋白多样性产生的机制。第40页，讲稿共156张，创作于星期二12.3.2 酵母交配型染色体的重排酵母交配型染色体的重排酿酒酵母细胞有两个不同交配型交配型（matingtype）的单倍体单倍体（haploid），可结合而形成二倍体二倍体(diploid
47、)。二倍体细胞（酵母的优势形态）通过简单的有丝分裂繁殖，但在外界条件不佳时进入减数分裂，生成一系列单倍体孢子。以上两种生活形态由菌体的交配型a和决定，这两种交配型是一种原始的性别分化，由位于第三染色体上的MAT（matingtypelocus）基因所控制。带有MATa等位基因的细胞叫做a细胞，带有MAT等位基因的细胞叫做细胞。如果两个单倍体相同，则不能接合成二倍体。研究发现，细胞分泌的信息素信息素（pheromones）可以识别相反交配型的细胞。a细胞分泌的a因子，是12个氨基酸构成的短肽。细胞分泌的因子，是13个氨基酸构成的短肽。这两个短肽经剪接、修饰加工后分泌到细胞外发挥识别功能。巧妙的是
48、，每一种细胞携带有另一类型细胞外信息素的受体，所以才导致不同类型细胞的相互识别。第41页，讲稿共156张，创作于星期二随后发现，a和细胞可以发生交配型转变，交配型转变与MAT座位两侧的HML和HMR位点有关。目前流行的盒式模型盒式模型（cassettemodel）认为，MAT位置上有a型或型活性盒(activecassette)，而HML有型沉默盒（silentcassette），HMR有a型沉默盒。如果HML转移到MATa上，MAT从HML接受盒，细胞便从a型转变成型。如果HMR转移到MAT位置上，MAT从HMR接受盒，细胞便从型转变成a型（图12-9）。这实际上也是一个转座的过程，MAT作
49、为转座的受体，接受供体HML和HMRa的遗传信息，发生基因重排，导致了交配型的转变。第42页，讲稿共156张，创作于星期二12.4DNA水平的调控水平的调控12.4.1DNA的甲基化的甲基化DNA甲基化是最早发现的一种真核生物基因表达调控的重要方式，通常是指胞嘧啶5-位碳原子的甲基化(m5C),是一种DNA复制后的酶促反应过程。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。高等真核生物细胞的DNA有2%7%的胞嘧啶是被甲基化修饰的，主要集中在基因5-端的非编码区，并成簇存在。DNA甲基化主要形成m5C，少量的N6-甲基嘌呤（N6-m
50、A）及7-甲基鸟嘌呤（m7G）。在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地修饰为m5C。如果只有一条DNA链的C发生甲基化，称半甲基化半甲基化。如果两条链的C都发生甲基化，则称完全甲基化完全甲基化，且两个甲基基团在DNA双链大沟中呈特定三维结构。发生甲基化的DNA序列主要集中在CpG岛上（CpG=5-CG-3），CpG岛存在于所有管家基因和少量组织特异性基因的5端调控区。人类DNA中约3%的胞嘧啶核苷酸被甲基化，其中大部分存在于CpG岛中。人类基因组中约有45000个CpG岛，而小鼠基因组中只约有15500个CpG岛。所有持续表达的管家基因均含有CpG岛，占基因组中CpG岛