《分子荧光分析法药学讲稿.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《分子荧光分析法药学讲稿.ppt（63页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、分子荧光分析法药学第一页，讲稿共六十三页哦内容：内容：1.概述Introduction2.基本原理BasicPrinciple3.溶液的荧光强度Fluorescenceintensityinsolutions4.分子荧光分析仪器Molecularfluorescencespectrometers5.应用Applications第二页，讲稿共六十三页哦教学目标和要求1.1.了解荧光和磷光了解荧光和磷光2.2.掌握掌握 荧光分析法的基本原理：荧光分析法的基本原理：荧光的产生、定性、定量方法荧光的产生、定性、定量方法3.3.掌握影响掌握影响 F F 因素：因素：分子结构、外因（温度、溶剂、酸度、表面
2、分子结构、外因（温度、溶剂、酸度、表面活性剂、荧光熄灭剂、散射光和激发光等。活性剂、荧光熄灭剂、散射光和激发光等。4.4.了解荧光分析仪器的结构及类型：了解荧光分析仪器的结构及类型：荧光光度计和荧光分光光度计，学会分析操作荧光光度计和荧光分光光度计，学会分析操作技术。技术。第三页，讲稿共六十三页哦第四页，讲稿共六十三页哦荧光从入射光的垂直方向，即在黑背景下检测荧光荧光从入射光的垂直方向，即在黑背景下检测荧光第五页，讲稿共六十三页哦1概述Introduction 1575年，西班牙的内科医生和植物学家N.Monardes在含有木头切片的水溶液中第一次发现了极为可爱的天兰色荧光；1852年，Sto
3、kes在考察奎宁和绿色素的荧光时，提出荧光是光发射的概念，并研究了荧光强度与荧光物质浓度的关系，描述了荧光猝灭现象，成为第一个提出用荧光作为分析手段的人；1867年，Goppelsrode应用铝-桑色素配位化合物的荧光测定铝，成为历史上第一个进行荧光分析工作的人。第六页，讲稿共六十三页哦 一、荧光与磷光 光致发光现象光致发光现象 能量提供方式能量提供方式：光照、加热、化学反应、生物代谢等第七页，讲稿共六十三页哦二、荧光分析法（荧光分析法（fluorescence analysis）定义：定义：利用物质的荧光谱线位置及其强度，对物质进利用物质的荧光谱线位置及其强度，对物质进行定性和定量分析的方法
4、。行定性和定量分析的方法。定性鉴别：定性鉴别：由于不同的物质其组成与结构不同，所吸收光由于不同的物质其组成与结构不同，所吸收光的波长和发射光的波长也不同的波长和发射光的波长也不同。定量分析：定量分析：如果该物质的浓度不同，它所发射的荧光强度如果该物质的浓度不同，它所发射的荧光强度就不同。就不同。第八页，讲稿共六十三页哦三、荧光分析法特点灵敏度高、选择性好、样品用量少、操作简便。第九页，讲稿共六十三页哦四、荧光分析法分类四、荧光分析法分类1、根据发光物质分类、根据发光物质分类 分子荧光分子荧光 原子荧光原子荧光2、根据激发光的波长范围分类、根据激发光的波长范围分类 紫外紫外-可见荧光可见荧光 红
5、外荧光红外荧光 X射线荧光射线荧光第十页，讲稿共六十三页哦2基本原理BasicPrinciple一、分子荧光一、分子荧光第十一页，讲稿共六十三页哦（一）分子荧光的产生分子荧光的产生1、分子能级与激发态、分子能级与激发态 分子中能级：分子中能级：电子能级、振动电子能级、振动能级、转动能级。转动能级。电子能级状态：电子能级状态：单重态单重态 三重态三重态区别：区别：电子自旋方向不同；能级能量不同电子自旋方向不同；能级能量不同第十二页，讲稿共六十三页哦2、荧光的产生、荧光的产生第十三页，讲稿共六十三页哦1.振动驰豫Vibrational relexation分子通过碰撞以热的分子通过碰撞以热的形式损
6、失部分能量，形式损失部分能量，从较高振动能级下降从较高振动能级下降到该电子能级的最低到该电子能级的最低振动能级上。振动能级上。第十四页，讲稿共六十三页哦2.内转换Internalconversion激激发发态态分分子子将将多多余余的的能能量量转转变变为为热热能能，从从较较高高电电子子能能级级降降至较低的电子能级。至较低的电子能级。第十五页，讲稿共六十三页哦3.荧光fluorescence分分子子回回到到第第一一电电子子激激发发单单重重态态的的最最低低振振动动能能级级后后，仍仍不不稳稳定定，停停留留较较短短时时间间后后（约约10-8 s，称称作作荧荧光光寿寿命命），以以光光辐辐射射（荧荧光光）形
7、形式式放放出出能能量量，回回到基态各振动能级到基态各振动能级。第十六页，讲稿共六十三页哦4.系间窜跃Intersystemcrossing有有些些物物质质的的激激发发态态分分子子通通过过振振动动驰驰豫豫和和内内转转换换下下降降到到第第一一电电子子激激发发态态的的最最低低振振动动能能级级后后，有有可可能能经经过过另另一一个个无无辐辐射射跃跃迁迁转转移移至至激发三重态。激发三重态。第十七页，讲稿共六十三页哦5.磷光 phosphorescence分分子子在在激激发发三三重重态态的的最最低低振振动动能能级级，停停留留一一段段时时间间（10-410 s，称称作作磷磷光光寿寿命命），然然后后以以光光辐辐
8、射射（磷磷光光）形形式式放放出出能能量量返返回回到到基基态态各各振振动动能能级，。级，。第十八页，讲稿共六十三页哦6、外部能量转换、外部能量转换 External conversion第十九页，讲稿共六十三页哦（二）荧光的激发光谱和荧光光谱（二）荧光的激发光谱和荧光光谱（1）.激发光谱激发光谱 excitation spectrum 激激发发光光谱谱表表示示不不同同激激发发波波长长的的辐辐射射引引起起物物质质发发射射某某一一波波长荧光的相对效率。长荧光的相对效率。绘制激发光谱：绘制激发光谱：保保持持荧荧光光发发射射波波长长不不变变，依依次次改改变变激激发发光光波波长长，测测定定不不同同波波长的
9、激发光激发下得到的荧光强度长的激发光激发下得到的荧光强度F，绘制，绘制F-激发激发曲线曲线。第二十页，讲稿共六十三页哦（2）.荧光光谱荧光光谱 fluorescence spectrum 荧光光谱表示在所发射的荧光中各波长的相对强度。荧光光谱表示在所发射的荧光中各波长的相对强度。绘制荧光光谱：绘制荧光光谱：保持激发光波长不变，依次改变荧光发射波长，测定样品在不保持激发光波长不变，依次改变荧光发射波长，测定样品在不同荧光波长处发射的荧光强度同荧光波长处发射的荧光强度F，绘制绘制F-发射发射 曲线。曲线。（3）激发光谱和荧光光谱的作用激发光谱和荧光光谱的作用 定性鉴别荧光物质定性鉴别荧光物质 选择
10、测定波长选择测定波长 第二十一页，讲稿共六十三页哦第二十二页，讲稿共六十三页哦（三）荧光光谱与激发光谱的关系1.荧光光谱形状与激发光波长无关（斯托克斯位移）2.荧光光谱波长比激发光波长长，荧光发射能量比激发光能量低。第二十三页，讲稿共六十三页哦3.镜像对称第二十四页，讲稿共六十三页哦解释：能级结构相似性 荧荧光光光光谱谱为第一电子激发单重态的最低振动能级跃迁到基态的各个振动能级而形成，即其形状与基态振动能级分布有关。激激发发光光谱谱是由基态最低振动能级跃迁到第一电子激发单重态的各个振动能级而形成，即其形状与第一电子激发单重态的振动能级分布有关。由于激发态和基态的振动能级分布具具有相似性有相似性
11、，因而呈镜像对称镜像对称。S1S0第二十五页，讲稿共六十三页哦二、荧光与分子结构、荧光与分子结构荧光物质的必要条件：荧光物质的必要条件：有强的紫外吸收有强的紫外吸收 有较高的荧光效率有较高的荧光效率(一）荧光寿命和荧光效率（一）荧光寿命和荧光效率（fluorescence efficiency）荧光寿命：荧光寿命：当除去激发光源后，分子的荧光强度降低到当除去激发光源后，分子的荧光强度降低到最大荧光强度的最大荧光强度的1/e所需时间。所需时间。荧光效率：荧光效率：第二十六页，讲稿共六十三页哦荧光素钠荧光素钠水水=0.92 荧光素荧光素水水=0.65蒽蒽 乙醇乙醇=0.30 菲菲乙醇乙醇=0.10
12、第二十七页，讲稿共六十三页哦（二）分子结构与荧光的关系1、长 *共轭结构共轭结构：大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或杂环具有共轭的杂环具有共轭的 *跃迁。其共轭程度愈大，跃迁。其共轭程度愈大，荧光效率也愈大，波长长移。荧光效率也愈大，波长长移。第二十八页，讲稿共六十三页哦苯萘蒽维生素A205nm286nm356nm327nm278nm321nm404nm510nm0.110.290.36第二十九页，讲稿共六十三页哦第三十页，讲稿共六十三页哦分子的刚性和共平面性越大，分子的刚性和共平面性越大，越大，荧光强度越强越大，荧光强度越强。1=0.18=0.92(非荧
13、光物质)2.分子的刚性第三十一页，讲稿共六十三页哦有些物质本身不发荧光或荧光较弱，但和金属离子形成配有些物质本身不发荧光或荧光较弱，但和金属离子形成配合物后，如果刚性和共平面性增加，就可以发荧光或增强合物后，如果刚性和共平面性增加，就可以发荧光或增强荧光。如荧光。如8-羟基喹啉是弱荧光物质，与羟基喹啉是弱荧光物质，与Mg2+、Al3+等金属等金属离子形成的配合物的荧光增强，利用这一特点可以间接测定离子形成的配合物的荧光增强，利用这一特点可以间接测定金属离子。金属离子。第三十二页，讲稿共六十三页哦3、取代基团对分子荧光的影响给给电电子子取取代代基基：能能增增加加分分子子的的电电子子共共轭轭程程度
14、度，使使荧荧光光效效率率提提高高。如如NH2、OH、OCH3、CN、NHR、NR2等，等，吸吸电电子子取取代代基基：可可减减弱弱分分子子电电子子共共轭轭性性，使使荧荧光光减减弱弱甚甚至至熄熄灭灭。而而-COOH、NO2、C=O、F、Cl等等还还有有一一类类取取代代基基则则对对荧荧光光的的影影响响不不明明显显，如如R、SO3H、NH3 等。等。第三十三页，讲稿共六十三页哦苯环取代基对荧光的影响第三十四页，讲稿共六十三页哦（三）荧光试剂（荧光条件）（荧光条件）1、荧光胺2、邻苯二甲醛3、1-二甲氨基-5-氯化磺酰萘4、测定无机离子的荧光试剂（表12-1）第三十五页，讲稿共六十三页哦三、影响荧光强度
15、的外部因素影响荧光强度的外部因素1、温度当温度升高时，介质粘度减小，分子运当温度升高时，介质粘度减小，分子运动加快，分子间碰撞几率增加，从而使分子动加快，分子间碰撞几率增加，从而使分子无辐射跃迁增加，荧光效率降低。无辐射跃迁增加，荧光效率降低。第三十六页，讲稿共六十三页哦2、溶剂（1）荧光强度在一定范围内可随溶剂黏度的）荧光强度在一定范围内可随溶剂黏度的 减小而减小；减小而减小；（2）溶剂和荧光物质形成化合物，改变物质）溶剂和荧光物质形成化合物，改变物质 的性质；的性质；（3）荧光波长随溶剂极性增大而长移。）荧光波长随溶剂极性增大而长移。第三十七页，讲稿共六十三页哦3 3、表面活性剂、表面活性
16、剂增溶、增敏、增稳作用。增溶、增敏、增稳作用。优点：优点：1 1）增加荧光物质的溶解度；）增加荧光物质的溶解度；2 2）增加摩尔吸光系数；）增加摩尔吸光系数；3 3）增加荧光物质的稳定性。）增加荧光物质的稳定性。第三十八页，讲稿共六十三页哦4、pH值（1）溶液pH值改变，物质分子和其离子间的平衡也随之发生变化，而不同形体具有其各自特定的荧光光谱和荧光效率。例如苯胺：第三十九页，讲稿共六十三页哦（2）溶液pH值的改变会影响配合物的组成，从而影响它们的荧光性质。GaGa3+3+邻邻-二羟基偶氮苯二羟基偶氮苯pH3pH34 41:11:1配合物（荧光）配合物（荧光）GaGa3+3+邻邻-二羟基偶氮苯
17、二羟基偶氮苯pH6pH67 71 1 2 2的配合物的配合物（无荧光）。（无荧光）。第四十页，讲稿共六十三页哦5、荧光熄灭 定义：定义：由于荧光物质分子间或与其它物质相互作由于荧光物质分子间或与其它物质相互作 用，引起荧光强度显著下降的现象叫做荧用，引起荧光强度显著下降的现象叫做荧 光熄灭或猝灭。光熄灭或猝灭。荧光熄灭剂：荧光熄灭剂：卤素离子、重金属离子、氧分子、卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基硝基 化合物、重氮化合物和羧基化合物、重氮化合物和羧基 化合物等。化合物等。第四十一页，讲稿共六十三页哦荧光熄灭机制：荧光熄灭机制：激激发发态态荧荧光光分分子子和和熄熄灭灭剂剂分分子子碰碰撞撞，将将能
18、能 量量转移到熄灭剂而使荧光熄灭；转移到熄灭剂而使荧光熄灭；荧荧光光分分子子与与熄熄灭灭剂剂分分子子作作用用生生成成了了本本身身不不发发光光的的配合物；配合物；荧荧光光物物质质分分子子中中引引入入重重原原子子（溴溴或或碘碘）后后，易易发发生系间窜越而转变为三重态；生系间窜越而转变为三重态；第四十二页，讲稿共六十三页哦当当荧荧光光物物质质浓浓度度较较大大时时，激激发发态态分分子子和和基基态态分分子子发生碰撞。溶液浓度越高，自熄灭现象越严重；发生碰撞。溶液浓度越高，自熄灭现象越严重；溶溶液液中中溶溶解解的的氧氧分分子子能能引引起起几几乎乎所所有有的的荧荧光光物物质质产生不同程度的荧光熄灭。产生不同
19、程度的荧光熄灭。荧光熄灭法：荧光熄灭法：利用荧光强度的减小与熄灭剂的浓度呈线性关系建立的利用荧光强度的减小与熄灭剂的浓度呈线性关系建立的对荧光熄灭剂的定量分析法。对荧光熄灭剂的定量分析法。例如：例如：铝铝-桑色素的配合物与熄灭剂氟浓度成反比桑色素的配合物与熄灭剂氟浓度成反比第四十三页，讲稿共六十三页哦6、散射光（scatteringlight）（1）.瑞利散射光瑞利散射光光光子子和和物物质质分分子子发发生生弹弹性性碰碰撞撞，光光子子运运动动方方向向发发生改变，其波长和激发光相同。生改变，其波长和激发光相同。消除：消除：选择适当的荧光测定波长或选用滤选择适当的荧光测定波长或选用滤 光片即可消除其
20、影响。光片即可消除其影响。第四十四页，讲稿共六十三页哦（2）.拉曼散射光拉曼散射光光光子子和和溶溶剂剂分分子子发发生生非非弹弹性性碰碰撞撞，使使光光子子能能量量减减小小或或者者增增加加，光光的的波波长长增增长长或或变变短短，这这两两种种散散射射光光均均称称为为拉拉曼曼（散散射射）光光。其其中中波波长长较较长长的的拉拉曼曼光光因因其其波波长长与与物物质质的的荧荧光光波波长长相相接接近近,故故对测定的干扰较大。对测定的干扰较大。区别：区别：v瑞利散射光波长与激发光波长相同；瑞利散射光波长与激发光波长相同；v拉曼光波长随激发光波长的改变而改变，长波拉曼光拉曼光波长随激发光波长的改变而改变，长波拉曼光
21、 可干扰荧光测定；可干扰荧光测定；v 荧光波长与激发光波长无关。荧光波长与激发光波长无关。第四十五页，讲稿共六十三页哦320nm320nm448nm350nm448nm350nm400nm360nm激发320nm硫酸奎宁激发350nm硫酸奎宁散射光谱散射光谱第四十六页，讲稿共六十三页哦第三节荧光定量分析一、荧光强度与溶液浓度的关系第四十七页，讲稿共六十三页哦根据Beer定律所以第四十八页，讲稿共六十三页哦由于溶液的荧光强度与溶液对光的吸收程度及荧光效率成正比，即第四十九页，讲稿共六十三页哦第五十页，讲稿共六十三页哦当abc0.05（即溶液很稀）时，对于一定的荧光物质，当测定条件固定时，第五十一
22、页，讲稿共六十三页哦二、定性分析利用荧光物质的特征光谱（激发光谱和荧光光谱）鉴定物质。第五十二页，讲稿共六十三页哦三、定量分析1.标准曲线法标准曲线法（高浓度溶液调节荧光强度约（高浓度溶液调节荧光强度约100%）第五十三页，讲稿共六十三页哦FcFxcx第五十四页，讲稿共六十三页哦2.比例法（直接比较法）3、联立方程式法、联立方程式法第五十五页，讲稿共六十三页哦第四节仪器一、仪器的构造及原理第五十六页，讲稿共六十三页哦仪器一般包括五部分：激发光源、单色器激发光源、单色器1、单色器、单色器2、样品池、检测器、样品池、检测器 1.光源：溴钨灯溴钨灯 高压汞灯高压汞灯氙灯氙灯要求：要求：发射紫外到可见
23、区发射紫外到可见区波长的光、强度大、稳定。波长的光、强度大、稳定。第五十七页，讲稿共六十三页哦2.单色器两个单色器3.样品池通常用石英制成4.检测器光电倍增管第五十八页，讲稿共六十三页哦二、仪器类型1.光电荧光计光源：溴钨灯或高压汞灯单色器：滤光片（激发滤光片和荧光滤光片）检测器：光电管2.荧光分光光度计光源：氙灯、单色器：光栅（可连续扫描激发光谱和荧光光谱）检测器：光电倍增管第五十九页，讲稿共六十三页哦三、荧光分析新技术简介三、荧光分析新技术简介激光荧光分析激光荧光分析（激光光源：单色性好、光强度大）（激光光源：单色性好、光强度大）时间分辨荧光分析时间分辨荧光分析（利用物质的荧光寿命不同达到
24、分别检测的目的）（利用物质的荧光寿命不同达到分别检测的目的）同步荧光分析同步荧光分析（同时扫描激发光谱和发射光谱，得到同步荧光光谱，进行测定。（同时扫描激发光谱和发射光谱，得到同步荧光光谱，进行测定。灵敏度高）灵敏度高）胶束增敏荧光分析胶束增敏荧光分析（胶束溶液对荧光物质的增溶、增敏和增稳作用）（胶束溶液对荧光物质的增溶、增敏和增稳作用）第六十页，讲稿共六十三页哦四、荧光分析法应用四、荧光分析法应用（一）有机化合物的荧光分析（一）有机化合物的荧光分析维生素、氨基酸和蛋白质、胺类和甾族化合物、维生素、氨基酸和蛋白质、胺类和甾族化合物、酶和辅酶以及各种药物、毒物和农药等，许多均酶和辅酶以及各种药物
25、、毒物和农药等，许多均能发射荧光，可以用荧光分析法进行测定或研究能发射荧光，可以用荧光分析法进行测定或研究其结构或生理作用机制。其结构或生理作用机制。（二）无机化合物的荧光分析（二）无机化合物的荧光分析利用待测元素与有机试剂组成的能发荧光的配利用待测元素与有机试剂组成的能发荧光的配合物进行荧光法分析的无机元素已近合物进行荧光法分析的无机元素已近7070种。种。第六十一页，讲稿共六十三页哦 小小 结结一、基本概念一、基本概念荧光、振动驰豫、内部能量转换、外部能量转换、体系间跨荧光、振动驰豫、内部能量转换、外部能量转换、体系间跨越、磷光、激发光谱、发射光谱、瑞利散射光、拉曼散射光。越、磷光、激发光
26、谱、发射光谱、瑞利散射光、拉曼散射光。二、基本理论二、基本理论荧光效率荧光效率荧光光谱的特征荧光光谱的特征有机化合物分子结构与荧光的关系有机化合物分子结构与荧光的关系影响荧光强度的外部因素（温度、溶剂、酸度、散射光）影响荧光强度的外部因素（温度、溶剂、酸度、散射光）荧光定量分析法（校正曲线法、比例法、联立方程式法）荧光定量分析法（校正曲线法、比例法、联立方程式法）荧光分析仪器荧光分析仪器第六十二页，讲稿共六十三页哦光学分析法小结：光学分析法小结：UV-Vis,AAS,MFA对比对比方法方法 UV-Vis AAS MFA光谱光谱 特征特征 带状吸收光谱带状吸收光谱 锐线光谱锐线光谱 带状发射光谱
27、带状发射光谱 A-K0-F-ex 激发光谱激发光谱 F-F 荧光光谱荧光光谱 定性依据定性依据 -定性依据定性依据定量分析定量分析 A=b c A=KC F=k I0.2.3 abc(abc0.05)单色光单色光 锐线光源锐线光源 强光源强光源 峰值吸收峰值吸收 稀溶液（稀溶液（A0.05)定量方法定量方法 标准曲线法标准曲线法 标准曲线法标准曲线法 标准曲线法标准曲线法 比较法，示差法比较法，示差法 比较法比较法 比较法比较法 解联立方程法等解联立方程法等 标准加入法标准加入法 解联立方程法解联立方程法仪器仪器 紫外可见分光光度计紫外可见分光光度计 原子吸收分光光度计原子吸收分光光度计 荧光光度计荧光光度计（结构框图）（结构框图）单波长，双波长单波长，双波长 单光束，双光束单光束，双光束 荧光分光光度计荧光分光光度计 单光束，双光束单光束，双光束 （垂直方向检测）（垂直方向检测）干扰干扰 非单色光，光度误差非单色光，光度误差 光谱干扰，光谱干扰，溶剂，温度溶剂，温度.酸度酸度 物理化学因素物理化学因素 物理、化学干扰，物理、化学干扰，散色光散色光 影响显色反应的因素影响显色反应的因素 电离干扰，背景吸收电离干扰，背景吸收 荧光熄灭剂。激发光荧光熄灭剂。激发光第六十三页，讲稿共六十三页哦