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1、仪器分析实验仪器分析实验实验实验7 分子荧光光谱法测定分子荧光光谱法测定维生素维生素B2的含量的含量一、分子荧光分析法简介一、分子荧光分析法简介(对光的吸收对光的吸收)1.1 荧光的产生荧光的产生 当被测物质受到光照后，被测物分子吸收了具当被测物质受到光照后，被测物分子吸收了具有特征频率的辐射能，分子从基态上升到激发态，有特征频率的辐射能，分子从基态上升到激发态，分子在较高能级的激发态时，它可能处于激发态分子在较高能级的激发态时，它可能处于激发态中各种振动状态的一种。然而由于分子通过与溶中各种振动状态的一种。然而由于分子通过与溶剂分子，同类分子或其他分子的碰撞，而失去振剂分子，同类分子或其他分
2、子的碰撞，而失去振动能级，降低至激发态时的最低振动能级，在此动能级，降低至激发态时的最低振动能级，在此过程中并不发光。但当分子从激发态的最低振动过程中并不发光。但当分子从激发态的最低振动能级，即第一电子激发态的最低振动能级降落至能级，即第一电子激发态的最低振动能级降落至基态的各个不同的振动能级时，则以光的形式辐基态的各个不同的振动能级时，则以光的形式辐射出能量，所辐射出的光即是荧光射出能量，所辐射出的光即是荧光。发生激发发生激发态反应态反应分子内的激发和衰变过程分子内的激发和衰变过程1.1 荧光的产生荧光的产生激发态能量的跃迁与转激发态能量的跃迁与转 化的形式和速率：化的形式和速率：A1,A2
3、 吸收吸收:10-15 sVR 振动松弛：振动松弛：10-12 sic 内转化：内转化：10-11 sisc 系间窜越：系间窜越：10-6 10-2 sF 荧光：荧光：10-9 10-6 sP 磷光：磷光：10-6 100 s1.2 荧光光谱荧光光谱 当固定激发光波长和强度不变，当固定激发光波长和强度不变，而记录荧光强度随波长变化的曲线，而记录荧光强度随波长变化的曲线，称为荧光光谱。若固定荧光最强处的称为荧光光谱。若固定荧光最强处的荧光波长不变而改变激发光波长，记荧光波长不变而改变激发光波长，记录荧光强度随激发光波长变化的曲线，录荧光强度随激发光波长变化的曲线，称为激发光谱。称为激发光谱。激发
4、光谱激发光谱发射光谱发射光谱1.2 荧光光谱荧光光谱 任何荧光化合物，都具有两种任何荧光化合物，都具有两种特征的光谱：激发光谱和发射光特征的光谱：激发光谱和发射光谱。谱。组成、结构与衍化信息组成、结构与衍化信息 物质的化学结构物质的化学结构 环境与介质条件环境与介质条件 与其它溶质的相互作用与其它溶质的相互作用 反应动力学反应动力学1.3 荧光定量荧光定量F=KI0fC I I0 0：光源强度；：光源强度；f f：荧光量子产率；：荧光量子产率；C C：荧光体浓度）：荧光体浓度）试比较荧光法与紫外试比较荧光法与紫外-可见分光光度法的分析性能。可见分光光度法的分析性能。?问题：问题：（注意：注意：
5、在一定浓度范围内适用）在一定浓度范围内适用）1.4 荧光仪的基本构造荧光仪的基本构造？问题问题：荧光光度计与紫外荧光光度计与紫外-可见分光光度计在光路设置可见分光光度计在光路设置 上有什么不同？为什么？上有什么不同？为什么？1.5 分子荧光分析法的应用简介分子荧光分析法的应用简介 常规分析应用：常规分析应用：定性分析：定性分析：f；ex；em；峰形等；峰形等 定量检测：定量检测：F=KI0fC 其它（略）其它（略）高端生化研究：高端生化研究：分子相互作用研究；分子相互作用研究；代谢动力学跟踪；代谢动力学跟踪；显微成像显微成像（物理迁移与化学衍化的原位（物理迁移与化学衍化的原位“显迹显迹”）二、
6、维生素二、维生素B2含量的荧光法测定含量的荧光法测定2.1 2.1 实验原理实验原理 维生素（核黄素）在一定波长的维生素（核黄素）在一定波长的激发光照射下会发射出绿色荧光，根据荧激发光照射下会发射出绿色荧光，根据荧光强度在一定浓度范围内与荧光物质浓度光强度在一定浓度范围内与荧光物质浓度成正比，用标准曲线法对样品进行定量分成正比，用标准曲线法对样品进行定量分析，在线性良好的情况下，也可用浓度直析，在线性良好的情况下，也可用浓度直接读出被测样品的浓度。接读出被测样品的浓度。2.2 实验流程实验流程1、VB2的荧光光谱的绘制的荧光光谱的绘制2、标准工作曲线的制作、标准工作曲线的制作3、未知液的测定、
7、未知液的测定1.开机：开机：打开打开RF-5301荧光分光光度计的电源开关，打印机开荧光分光光度计的电源开关，打印机开关，开启电脑。预热仪器关，开启电脑。预热仪器20分钟。分钟。2.配制系列维生素标准溶液：配制系列维生素标准溶液：取取5个干净的个干净的50ml容量瓶，分别加入容量瓶，分别加入1.0,2.0,3.0,4.0,5.0ml浓度为浓度为10.0g/ml的维生素标准溶液用水稀释至的维生素标准溶液用水稀释至刻度，摇匀。刻度，摇匀。3.仪器自检：仪器自检：预热仪器预热仪器20分钟后，双击电脑桌面上分钟后，双击电脑桌面上“RF-530XPC”图标，仪器在计算机的引导下开始自检，约图标，仪器在计
8、算机的引导下开始自检，约3分钟完毕，此时分钟完毕，此时仪器操作软件打开。仪器操作软件打开。若此时软件为若此时软件为“光谱测定光谱测定”模式，则点击模式，则点击“Acquire Mode”主菜单，在下拉菜单中选择主菜单，在下拉菜单中选择“Quantitative”，此时，此时软件转为软件转为“定量测定定量测定”界面模式。界面模式。4.参数设定：参数设定：“定量测定定量测定”界面模式下，点击界面模式下，点击“Configure”主菜单，主菜单，在下拉菜单中选择在下拉菜单中选择“Parameters”菜单，则会自动弹出菜单，则会自动弹出“Quantitative Parameters”窗口，在此窗口
9、中，需要设窗口，在此窗口中，需要设置以下五个参数：置以下五个参数：在在“EX Wavelength”中填中填270，在在“EM Wavelength”中填中填525，在在“Slit Widthnm EX”中填中填10，在在“Slit Widthnm EM”中填中填10，在在“Sensitivity:High Low”中选中选 Low，其他参，其他参数选默认值，不要调整它们，参数设置好后，按数选默认值，不要调整它们，参数设置好后，按“OK”此时此时软件自动回到软件自动回到“定量测定定量测定”界面模式。此时仪器参数设置完界面模式。此时仪器参数设置完毕。毕。5.空白溶液测试：空白溶液测试：设置好仪器
10、的工作条件后，把装有去离子水的样品池置于试样设置好仪器的工作条件后，把装有去离子水的样品池置于试样架内，在荧光光路上插入架内，在荧光光路上插入35滤光片，合上样品室盖子，在计滤光片，合上样品室盖子，在计算机屏幕上点击算机屏幕上点击“AUTO ZERO”，观察屏幕右下脚的基线值接近零，观察屏幕右下脚的基线值接近零时，再点击时，再点击“READ”读数，得空白溶液数值。读数，得空白溶液数值。6.系列维生素标准溶液的测试：系列维生素标准溶液的测试：把各标准样品按从稀到浓的顺序置于试样架内，和空白溶液测把各标准样品按从稀到浓的顺序置于试样架内，和空白溶液测试方法相同，分别测定不同浓度标准溶液的相对荧光强
11、度。试方法相同，分别测定不同浓度标准溶液的相对荧光强度。7.未知试样的测定：未知试样的测定：将已配制处理好的未知试样装入样品池置于试样架内，用测定将已配制处理好的未知试样装入样品池置于试样架内，用测定标准溶液相同的条件，测其相对荧光强度。标准溶液相同的条件，测其相对荧光强度。8.关机：关机：先关计算机，再关仪器，打印机；清洗样品池，容量瓶等玻璃先关计算机，再关仪器，打印机；清洗样品池，容量瓶等玻璃仪器，整理好仪器。仪器，整理好仪器。2.3 注意事项：注意事项：系列标液的测定顺序系列标液的测定顺序即放即测，防光降解即放即测，防光降解荧光仪的开关机顺序荧光仪的开关机顺序2.4 数据处理数据处理1.从荧光光谱图上读出最佳激发（从荧光光谱图上读出最佳激发（ex）和发射波长（）和发射波长（em）2.用标准工作曲线法算出所配实测试液的浓度用标准工作曲线法算出所配实测试液的浓度3.计算样品中维生素计算样品中维生素B2的含量。的含量。