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1、 Molecular fluorescence spectroscopy 化学系级班 03081094 杨柳概述概述分子荧光光谱法分子荧光光谱法(Molecular fluorescence spectroscopy)又称为荧光光谱法或荧光分析法是以物质所发射的荧光强度与浓度之间的线性关系为依据进行的定量分析，以荧光光谱的形状和荧光峰对应的波长进行行的定性分析光致发光（光致发光（Photoluminescence）:荧光和荧光和磷光是分子吸光成为激发态分子，在返回基态时的磷光是分子吸光成为激发态分子，在返回基态时的发光现象发光现象.荧光：荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低振受光激发的分
2、子从第一激发单重态的最低振动能级回到基态所发出的辐射。动能级回到基态所发出的辐射。磷光：磷光：从第一激发三重态的最低振动能级回到基从第一激发三重态的最低振动能级回到基态所发出的辐射。态所发出的辐射。荧光分析法的特点灵灵敏敏度度高高。检检测测限限比比吸吸收收光光谱谱法法低低13个个数数量量级级；选选择择性性比比吸吸收收光光谱谱法法好好。因因为为能能产产生生紫紫外外可可见见吸吸收收的的分分子子不不一一定定发发射射荧荧光光或或磷磷光光；试试样样用用量量少少和和方方法法简简便便能能提提供供比比;光光多多的的物物理理参参数数应应用用范范围围不不如如吸吸收收光光谱谱法法广广，因因为为有有的的分分子子不不发
3、发荧荧光光。荧光光谱法基本原理荧光光谱法基本原理分子的激发与失活分子的激发与失活1.1.分子的多重态分子的多重态单单重重态态 一一个个所所有有电电子子自自旋旋都都配配对对的的分分子子的的电电子子状状态态。大大多多数数有有机机物物分分子子的的基基态态是是单单重重态态。当当基基态态一一对对电电子子中中的的一一个个被被激激发发到到较较高高能能级级，其其自自旋旋方方向向不不会会立立刻刻改改变，分子仍处于单重态。变，分子仍处于单重态。三重态三重态 有两个电子的自旋不配有两个电子的自旋不配对而平行的状态。激发三重态能对而平行的状态。激发三重态能量较激发单重态低。量较激发单重态低。1.激发在室温下物质分子大
4、部分处于基态的最低振动能级且电子自旋配对为单重态当吸收一定频率的电磁辐射发生能级跃迁时，可上升到不同激发态的各振动能级，其中多数分子上升至第一激发单重态这一过程约需-15秒.激发2 2 去活化过程去活化过程激发态分子的失活激发态分子的失活:激发态分子不稳定，它要以辐射激发态分子不稳定，它要以辐射或无辐射跃迁的方式回到基态或无辐射跃迁的方式回到基态振动驰豫振动驰豫 (Vibrational relaxation)荧光发射荧光发射(Fluorescence)内部转换内部转换(Inter-nal Conversion)体系间跨越跃迁体系间跨越跃迁 去活化过程去活化过程1.激发2.去活化过程荧光强度及
5、影响荧光的因素荧光强度及影响荧光的因素荧光强度及影响荧光的因素荧光强度及影响荧光的因素荧光是物质吸收光子之后发出的辐射，荧光强度荧光是物质吸收光子之后发出的辐射，荧光强度（F F）与荧光物质的吸光强度与荧光物质的吸光强度I Ia a及其荧光物质的荧光效率及其荧光物质的荧光效率成正比成正比。1.1.荧光强度与浓度的关系荧光强度与浓度的关系F=F=I Ia a 其中其中 I Ia a=I I0 0I II I0 0入射光辐射功率；入射光辐射功率；I I透射光辐射功率；透射光辐射功率；荧光效率（荧光量子产率）荧光效率（荧光量子产率）荧光量子产率物质分子发射荧光的能力用荧光量子产率（）表示：与失活过程
6、的速率常数与失活过程的速率常数k k有关有关凡是使荧光速率常数凡是使荧光速率常数k kf f增大而使其他失活过程增大而使其他失活过程（系间窜越、外转换、内转换）（系间窜越、外转换、内转换）的速率常数减小的因素都可使荧光增强的速率常数减小的因素都可使荧光增强。根据朗伯根据朗伯-比尔定律比尔定律Ia=I0-I=I0(1-10-bc)则则F=I0（1-10-bc)=I0(1-e-2.303bc)又因又因e-2.303bc=1-2.303 bc-(-2.303 bc)2/2!-(-2.303 bc)3/3!对于很稀的溶液，投射到样品溶液上的被吸收的激发光不到对于很稀的溶液，投射到样品溶液上的被吸收的激
7、发光不到2%时，时，即即bc=0.05时，上式的第二项后的各项可以忽略不计。则时，上式的第二项后的各项可以忽略不计。则F=I01-(1-2.303 bc)=2.303 I0 bc当当I0一定时一定时 并且浓度并且浓度C很小时很小时,荧光强度与荧光物质浓度成正比荧光强度与荧光物质浓度成正比 F=KC (K=2.303 I0 b)荧光强度和溶液浓度呈线性关系只限于极稀的溶液，对于较浓的溶液，其荧光强度和溶液浓度呈线性关系只限于极稀的溶液，对于较浓的溶液，其吸光度超过吸光度超过0.05时荧光强度与浓度的线性关系将发生偏离时荧光强度与浓度的线性关系将发生偏离.荧光与环境因素的关系荧光与环境因素的关系荧
8、光与环境因素的关系荧光与环境因素的关系温度温度降低会使荧光强度增大；降低会使荧光强度增大；PH PH 带有酸性或碱性取代基的芳带有酸性或碱性取代基的芳香化合物的荧光与香化合物的荧光与pHpH有关；有关；溶剂溶剂 溶剂极性增加有时溶剂极性增加有时会使荧光强度增加，荧光波长红移；会使荧光强度增加，荧光波长红移；若溶剂和荧光物质形成氢键或使荧若溶剂和荧光物质形成氢键或使荧光物质电离状态改变，会使荧光强度光物质电离状态改变，会使荧光强度、荧光波长改变；含重原子的溶剂、荧光波长改变；含重原子的溶剂（碘乙烷、四溴化碳）使荧光减弱。（碘乙烷、四溴化碳）使荧光减弱。溶解氧溶解氧的存在往往使荧光强度的存在往往使
9、荧光强度降低。降低。激发光的照射激发光的照射化合物 相对荧光强度 C6H5OH 18 C6H5O 10C6H5NH2 20+C6H5NH3 0荧光分光光度计荧光分光光度计荧光分光光度计荧光分光光度计荧光分光光度计既可用于定量分析，荧光分光光度计既可用于定量分析，也可用于测绘激发光谱和荧光光谱也可用于测绘激发光谱和荧光光谱。荧光分光光度计既可用于定荧光分光光度计既可用于定量分析，也可用于测绘激发光谱量分析，也可用于测绘激发光谱和荧光光谱。第一单色器选择激和荧光光谱。第一单色器选择激发光波长（发光波长（250250nmnm的的紫外光）故称为激发单色器紫外光）故称为激发单色器第二单色器（荧光单色器）
10、第二单色器（荧光单色器）与激发光入射方向垂直，与激发光入射方向垂直，并选择荧光波长，可提高方法的选择性和准确度。并选择荧光波长，可提高方法的选择性和准确度。荧光分析法的应用荧光分析法的应用无机物分析无机物分析 无机离子中除少数例外一般不发荧光无机离子中除少数例外一般不发荧光.但很多但很多无机离子能怀一些有机试剂形成荧光络合物无机离子能怀一些有机试剂形成荧光络合物,而进行定量而进行定量测定测定.生物化学及生理医学方面的应用生物化学及生理医学方面的应用 荧光法对于生物中许多荧光法对于生物中许多重要的化合物具有很多的灵敏度和较好的物效性重要的化合物具有很多的灵敏度和较好的物效性,故广用故广用于生物化学分析于生物化学分析,生理医学和临床分析生理医学和临床分析.药物分析药物分析目前还采用荧光分光光度计作为高效液相色谱目前还采用荧光分光光度计作为高效液相色谱,薄层色谱薄层色谱和高效毛细管电泳等的检测器和高效毛细管电泳等的检测器,使有效的分离手段与高灵使有效的分离手段与高灵敏度敏度,高选择性的测定方法结合起来高选择性的测定方法结合起来,可用于测定复杂的混可用于测定复杂的混合物合物.荧光团杂化纳米二氧化硅微球