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1、关于动植物细胞培养产酶第一页，讲稿共四十五页哦本章主要内容n第一节 动植物细胞中酶生物合成的调节n第二节 植物细胞培养产酶n第三节 动物细胞培养产酶第二页，讲稿共四十五页哦概述n动植物细胞培养定义：动植物细胞培养定义：n是通过特定技术获得优良的动物和植物细胞，然后在人工控制条件的反应器中进行细胞培养，以获得所需产物的技术过程。第三页，讲稿共四十五页哦概述获取方法培养方式培养目的动物细胞离心分离、杂交瘤技术、胰蛋白酶消化悬浮培养、贴壁培养、微载体培养获得功能蛋白质植物细胞机械捣碎、酶解、诱导愈伤组织、分离原生质体固体培养、液体浅层培养、液体悬浮培养获得次生代谢产物第四页，讲稿共四十五页哦第一节
2、动植物细胞中酶生物合成的调节n动植物细胞更复杂，调节层次更多。n细胞水平n个体水平（激素、神经水平）下面着重从细胞水平讨论。第五页，讲稿共四十五页哦第一节 动植物细胞中酶生物合成的调节n一、细胞分化改变酶的生物合成n原因：基因表达具有时空性n如：q胰蛋白酶主要在胰细胞中合成q木瓜蛋白酶主要在果皮细胞中合成q端粒酶在胚胎细胞、生殖细胞、干细胞、分化程度低的癌细胞中具活性。第六页，讲稿共四十五页哦第一节 动植物细胞中酶生物合成的调节n2、基因扩增加速酶的生物合成n即通过增加基因的数量来调节基因表达的一种方式。如：对药物的抗性。n3、增强子促进酶的生物合成n增强子能促进同源或异源启动基因的转录活性。
3、n4、抗原诱导抗体酶的生物合成q半抗原诱导法q酶蛋白诱导法第七页，讲稿共四十五页哦第二节 植物细胞培养产酶近年来通过植物细胞培养产酶的研究已经取得可喜进展近年来通过植物细胞培养产酶的研究已经取得可喜进展第八页，讲稿共四十五页哦含酶制品嫩肉粉第九页，讲稿共四十五页哦第二节 植物细胞培养产酶n一、植物细胞的特性一、植物细胞的特性n大n生长及代谢率低n营养要求简单n需光n对剪切力敏感n生产次级代谢产物第十页，讲稿共四十五页哦第二节 植物细胞培养产酶n二、植物细胞培养的特点二、植物细胞培养的特点n提高产率n缩短周期n易于管理，减轻劳动强度n提高产品质量n其他：需光照等第十一页，讲稿共四十五页哦第二节
4、植物细胞培养产酶外植体的选择和处理愈伤组织的诱导细胞的获取细胞培养分离纯化产物外植体的选择与处理：选择外植体、切取片段、消毒处理。植物愈伤组织植物愈伤组织直接分离法直接分离法机械捣碎发：动作轻柔机械捣碎发：动作轻柔酶分解法：纤维素酶、果胶酶等酶分解法：纤维素酶、果胶酶等过滤、离心分离过滤、离心分离愈伤组织诱导法愈伤组织诱导法能迅速增殖、无特定结构和功能的薄壁细胞团能迅速增殖、无特定结构和功能的薄壁细胞团外植体外植体半固体培养基半固体培养基灭菌、冷却灭菌、冷却生长素、分裂素生长素、分裂素插入插入培养培养2525愈伤组织愈伤组织1-31-3周周分散、接种分散、接种原生质体再生原生质体再生去除细胞壁
5、后得到的微球体去除细胞壁后得到的微球体n三、植物细胞培养的工艺条件及其控制三、植物细胞培养的工艺条件及其控制n（一）植物细胞培养的工艺流程植物细胞的获取：第十二页，讲稿共四十五页哦第二节 植物细胞培养产酶n三、植物细胞培养的工艺条件及其控制三、植物细胞培养的工艺条件及其控制n（一）植物细胞培养的工艺流程n外植体细胞的获取细胞培养分离纯化产物n1、外植体的选择与处理n2、植物细胞的获取n3、细胞悬浮培养n4、分离纯化第十三页，讲稿共四十五页哦第二节 植物细胞培养产酶n三、植物细胞培养的工艺条件及其控制三、植物细胞培养的工艺条件及其控制n（二）植物细胞培养的培养基n1、植物细胞培养基的特点n与微生
6、物培养基的主要不同点如下：n（1）植物细胞的生长和代谢需要大量的无机盐n（2）植物细胞需要多种维生素和植物生长激素n（3）植物细胞要求的氮源一般为无机氮源n（4）植物细胞一般以蔗糖为碳源第十四页，讲稿共四十五页哦第二节 植物细胞培养产酶n三、植物细胞培养的工艺条件及其控制三、植物细胞培养的工艺条件及其控制n（二）植物细胞培养的培养基n2、几种常用的植物细胞培养基n 1）MS培养基n硝酸盐浓度高，广泛用于培养植物细胞、组织及原生质体。n2）B5培养基n铵的浓度较低，适于双子叶植物特别是木本植物的组织、细胞培养。n3）White培养基n无机盐浓度低，适用于生根培养。n4）KM-8P培养基n主要用于
7、原生质体培养。第十五页，讲稿共四十五页哦第二节 植物细胞培养产酶n三、植物细胞培养的工艺条件及其控制三、植物细胞培养的工艺条件及其控制n（二）植物细胞培养的培养基n3、植物细胞培养基的配制n为取用方便及减小误差，先配成母液保存备用。n（1）大量元素母液：即含有N、P、S、K、Ca、Mg、Na等大量元素的无机盐混合液。一般配成10倍浓度的母液。需单独溶解，按顺序搅拌混合。避免生成沉淀。n（2）微量元素母液：即含有B、Mn、Zn、Co、Cu、Mo、I等微量元素的无机盐混合液。一般配制成100倍浓度的母液。第十六页，讲稿共四十五页哦第二节 植物细胞培养产酶n三、植物细胞培养的工艺条件及其控制三、植物
8、细胞培养的工艺条件及其控制n（二）植物细胞培养的培养基n3、植物细胞培养基的配制n（3）铁盐母液：单独配制，一般采用敖和铁，通常配制成100倍浓度母液。n（4）维生素母液：是各种维生素和氨基酸的混合液，一般配成100倍浓度母液。n（5）植物激素母液：各种植物激素单独配制成母液。一般浓度为100mg/L.（注：一般难溶于水，需先用有机溶剂或酸、碱溶解，再用水定容。）第十七页，讲稿共四十五页哦第二节 植物细胞培养产酶n三、植物细胞培养的工艺条件及其控制三、植物细胞培养的工艺条件及其控制n（三）温度的控制：一般室温（25左右）n温度高，有利细胞生长；n温度低，有利于次级代谢产物积累。n（四）pH的控
9、制：一般微酸性（Ph5.06.0）n（五）溶解氧的控制:通风搅拌供给（不能太剧烈）。第十八页，讲稿共四十五页哦第二节 植物细胞培养产酶n三、植物细胞培养的工艺条件及其控制三、植物细胞培养的工艺条件及其控制n（六）光照的控制：对强度及时间有要求。n（七）前体的添加：前提指处于目的代谢途径上游的物质。n（八）刺激剂的应用：微生物细胞壁碎片、果胶酶、纤维素酶等微生物胞外酶。第十九页，讲稿共四十五页哦第二节 植物细胞培养产酶n四、植物细胞培养产酶的工艺过程四、植物细胞培养产酶的工艺过程n1、大蒜愈伤组织的诱导n2、大蒜细胞悬浮培养n3、超氧化物歧化酶的分离纯化第二十页，讲稿共四十五页哦 第三节 动物细
10、胞培养产酶n由于动物细胞体外培养具有明显的表达产物的优点，为传统微生物发酵所无法取代，因此，生物技术中许多有价值的生物制品，需要借助于动物细胞培养而获得，这种需求极大地促进了动物细胞培养技术的发展。第二十一页，讲稿共四十五页哦第三节 动物细胞培养产酶n早在1907年，美国的Harrison在世界上首次将蛙的神经组织在试管内培养成功，建立起动物组织体外培养的第一块基石。n1950年前后，Enders及其同事发表了第一篇关于在培养细胞中生长病毒的报告，开拓了以动物病毒为研究对象的新领域。n作为大规模细胞培养，Copsik等人成功的进行了有关仓鼠肾细胞的悬浮培养。第二十二页，讲稿共四十五页哦第三节
11、动物细胞培养产酶n随着基因工程技术的发展，人们逐渐认识到有许多基因产物不能在原核细胞内表达，它们需要经过真核细胞所特有的翻译后修饰，以及正确的切割、折叠后，才能形成与自然分子一样的功能和抗原性。使得动物细胞一跃成为一种重要的宿主细胞，用以生产多种生物制品等。这些采用大规模细胞培养技术生产贵重药品在临床诊断、治疗和预防等方面都有重要意义。第二十三页，讲稿共四十五页哦动物细胞培养与微生物培养的不同点na.动物细胞无细胞壁，机械强度低，适应环境能力差；nb.生长速度缓慢，易受微生物污染，培养时需要抗生素；nc.大多数动物细胞需附着在固体或半固体的表面生长；nd.对营养要求严格；ne.大规模培养时，不
12、可简单地套用微生物培养的经验。第二十四页，讲稿共四十五页哦 第三节 动物细胞培养产酶n动物细胞生长十分缓慢，并易为大多数微生物污染物所破坏。支原体对动物细胞培养的威胁最大，因为其感染力强且不易检出。n 因此，大规模细胞培养成功的必要条件是要有一个设备精良的细胞库。在细胞库中的冷冻细胞不受污染。第二十五页，讲稿共四十五页哦 第三节 动物细胞培养产酶n动物细胞培养基的配方十分复杂，并且还需补充血清。n 原料的质量控制和培养基的生产是大规模细胞培养的主要问题。n 因为血清来源困难，质量不稳定，残留血清给产物提纯带来困难等。第二十六页，讲稿共四十五页哦第三节 动物细胞培养产酶n动物细胞培养主要用于生产
13、下列功能蛋白质功能蛋白质：q疫苗q激素q多肽生长因子q酶q单克隆抗体q非抗体免疫调节剂狂犬病疫苗培养VERO（非洲绿猴肾细胞）生产重组人白细胞干扰素重组人白细胞干扰素第二十七页，讲稿共四十五页哦一、动物细胞的特性n（1）没有细胞壁，细胞适应能力差，十分脆弱。n（2）体积比微生物大，比植物细胞稍小。n（3）相互粘连以集群形式存在。n（4）营养要求复杂，培养基一般要添加血清。第二十八页，讲稿共四十五页哦二、动物细胞培养的特点n（1）主要用于功能蛋白质和多肽的生产n（2）生长较慢，15-100hn（3）需要添加抗生素以防染菌n（4）无细胞壁，体积较大，对剪切力敏感，要求严格控制培养条件如通风、搅拌、
14、pH、渗透压等n（5）大部分动物细胞有锚地依赖性，需要贴壁培养n（6）培养基成分复杂，分离纯化复杂，成本较高，多用于高价值药物的生产n（7）原代细胞培养50代之后即会退化死亡，需要重新分离细胞第二十九页，讲稿共四十五页哦三、动物细胞培养方式n1、悬浮培养：血液细胞等q对剪切力敏感n2、贴壁培养：上皮、成纤维细胞等。q滚瓶培养q微载体培养n3、固定化细胞培养q吸附法q包埋法培养瓶培养瓶CGIII-12 悬浮、贴壁培养细胞转瓶机悬浮、贴壁培养细胞转瓶机 第三十页，讲稿共四十五页哦细胞培养微载体系统第三十一页，讲稿共四十五页哦四、动物细胞培养的工艺条件及其控制n工艺流程：n制备细胞悬液接种培养收集培
15、养液分离纯化目的物第三十二页，讲稿共四十五页哦培养动物细胞的步骤n1.无菌取出目的细胞所在的组织用培养液漂洗干净；n2.用无菌刀割掉多余部分并切成小组织块；n3.小组织块置于解离液中离散细胞；n4.低速离心洗涤细胞后，将目的细胞吸移到培养瓶中。第三十三页，讲稿共四十五页哦动物细胞培养动物细胞培养第三十四页，讲稿共四十五页哦小鼠组织块，用胰蛋白酶处理后变成单个细胞，24h后（贴壁生长）的成纤维细胞第三十五页，讲稿共四十五页哦（一）动物细胞培养基的组成成分n氨基酸：q必需氨基酸q谷氨酰胺作碳源及能源n维生素q血清提供或补充B族维生素、Vc等n无机盐q调节渗透压、提供必需元素等n葡萄糖q作碳源及能源
16、n激素q维持正常的分裂与代谢（血清提供或添加）n生长因子q血清提供或添加第三十六页，讲稿共四十五页哦（二）动物细胞培养基的配制n自制：配制母液并过滤除菌备用q无血清培养基特定营养成分的添加n购买：商品化培养基细胞培养用小牛血清细胞培养用小牛血清无血清动物细胞培养基无血清动物细胞培养基 Wako(和光纯药和光纯药)细胞培养无血细胞培养无血清培养基清培养基Sericin GIT 第三十七页，讲稿共四十五页哦（三）温度的控制n温度影响生长与代谢q36.5+0.25 n温度影响pH（通过影响CO2的溶解度影响pH）第三十八页，讲稿共四十五页哦（四）pH的控制n一般控制在pH7.07.6微碱性范围，通常
17、pH7.4下生长最好。n调节方法：通常用CO2与NaHCO3 n维持pH稳定：缓冲系统qCO2与NaHCO3系统、柠檬酸与柠檬酸盐系统等npH监测：酚红指示剂qpH7.6 蓝红色 pH 7.4红色 橙色pH7.0 黄色pH6.5第三十九页，讲稿共四十五页哦n（五）渗透压的控制q等渗溶液q700850 kPan（六）溶解氧的控制q量：过多过少都不行q控制：通过调节进入反应器的混合气体的量及其比例调剂控制溶解氧（混合气体含4种气体：空气、氧气、氮气、二氧化碳）第四十页，讲稿共四十五页哦五、动物细胞培养产酶的工艺过程n举例：组织纤溶酶原活化剂（tPA）生产过程ntPA作用：是一种丝氨酸蛋白酶，催化纤溶酶原水解，生成纤溶酶。纤溶酶催化血栓中的血纤维蛋白水解，对血栓性疾病血栓性疾病有显著疗效。重组型组织纤溶酶原激活剂重组型组织纤溶酶原激活剂 第四十一页，讲稿共四十五页哦n举例：组织纤溶酶原活化剂（tPA）生产过程n配培养基n培养细胞n取含产物的培养液ntPA的分离纯化五、动物细胞培养产酶的工艺过程第四十二页，讲稿共四十五页哦动物细胞培养技术 视频nhttp:/