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1、第三章第三章 动、植物细胞培养产酶动、植物细胞培养产酶 与微生物细胞相比，动物细胞与微生物细胞相比，动物细胞和植物细胞具有各自不同的特性，和植物细胞具有各自不同的特性，需采用各自不同的培养工艺。需采用各自不同的培养工艺。植物细胞结构 植物、动物、微生物细胞的特性比较植物、动物、微生物细胞的特性比较细胞种类细胞种类植物细胞植物细胞微生物细胞微生物细胞动物细胞动物细胞细胞大小细胞大小/um20030011010100倍增时间倍增时间/h120.3-615营养要求营养要求简单简单简单简单复杂复杂光照要求光照要求大多数要求大多数要求不要求不要求不要求不要求对剪切力对剪切力敏感敏感大多数不敏感大多数不敏
2、感非常敏感非常敏感主要产物主要产物色色素素、药药物物、香精、酶等香精、酶等醇、有机酸、氨醇、有机酸、氨基酸、抗生素、基酸、抗生素、核苷酸、酶等核苷酸、酶等疫疫苗苗、激激素素、单单克克隆隆抗抗体体、酶等酶等三者之间的差异主要有：三者之间的差异主要有：植物细胞植物细胞 动物细胞动物细胞 微生物细胞。微生物细胞。动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长。动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长。植物细胞和微生物细胞的营养要求较简单。植物细胞和微生物细胞的营养要求较简单。植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定的植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定的光照。光照。植物细胞和动物细胞对剪切力敏感。植物
3、细胞和动物细胞对剪切力敏感。植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同。植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同。一、植物细胞培养产酶一、植物细胞培养产酶从外植体中从外植体中选育植物细胞选育植物细胞高产稳定细胞高产稳定细胞培养培养各种产物各种产物 1.1.植物细胞培养的特点植物细胞培养的特点 提高产率和产品质量提高产率和产品质量 缩短周期缩短周期 易于管理易于管理 2.2.培养基特点培养基特点 需要大量无机盐需要大量无机盐 需多种维生素和激素需多种维生素和激素 氮源一般为无机氮氮源一般为无机氮 一般以蔗糖为碳源一般以蔗糖为碳源n应用最广的是应用最广的是MSMS培养基和培养基和LSLS培养
4、基培养基 MS MS培养基是培养基是19621962年为烟草细胞培养而设年为烟草细胞培养而设计的培养基。计的培养基。LSLS培养基是在其基础上演变而来培养基是在其基础上演变而来的。的。P82P82表表3-33-33.3.培养工艺：培养工艺：悬浮细胞培养悬浮细胞培养工艺流程工艺流程外植体外植体细胞的获取细胞的获取细胞培养细胞培养分离分离纯化纯化产物产物外植体选择和处理外植体选择和处理选取那些无病虫害、生长旺盛、生长规则植株，把茎、选取那些无病虫害、生长旺盛、生长规则植株，把茎、叶、根、芽，花、果实等切成小片段或小块。用叶、根、芽，花、果实等切成小片段或小块。用70%-70%-75%75%乙醇，乙
5、醇，0.1%0.1%升汞消毒，无菌水漂洗。升汞消毒，无菌水漂洗。外植体：外植体：从植株取出，经过预处理后，用于植物组织培养从植株取出，经过预处理后，用于植物组织培养的植物组织（包括根、茎、叶、芽、花、果实、种子的植物组织（包括根、茎、叶、芽、花、果实、种子等）的片段或小块。等）的片段或小块。愈伤组织：愈伤组织：将上述外植体植入诱导培养基中，于将上述外植体植入诱导培养基中，于2525左右培左右培养一段时间，从外植体的切口部位长出小细胞团。养一段时间，从外植体的切口部位长出小细胞团。水稻的外植体（幼水稻的外植体（幼胚）和愈伤组织胚）和愈伤组织外植体外植体愈伤组织愈伤组织植物细胞获取植物细胞获取 直
6、接分离法直接分离法 愈伤组织诱导法愈伤组织诱导法 原生质体再生法原生质体再生法细胞悬浮培养：转新培养基，在生物反细胞悬浮培养：转新培养基，在生物反应器中进行培养应器中进行培养分离纯化：生化技术分离纯化：生化技术机械法机械法酶法酶法 培养条件的影响与控制培养条件的影响与控制温度：室温温度：室温2525pHpH：微酸性范围。即：微酸性范围。即pH 通气与搅拌通气与搅拌光照的控制：强度和时间有一定要求光照的控制：强度和时间有一定要求前体的添加（饲喂）前体的添加（饲喂）刺激剂的应用刺激剂的应用4.4.植物细胞培养产酶实例植物细胞培养产酶实例 以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（以大蒜细胞培养生产超氧化物
7、歧化酶（SODSOD）为例）为例(1)(1)大蒜愈伤组织的诱导大蒜愈伤组织的诱导 选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去除外选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去除外皮，先用皮，先用70%70%乙醇消毒乙醇消毒20s20s，再用，再用0.1%0.1%升汞消毒升汞消毒10min10min，然后无菌水漂洗然后无菌水漂洗3 3次。次。在无菌条件下，切成在无菌条件下，切成3 3的小块，植入含有的小块，植入含有3mg/L 3mg/L 2,4-D2,4-D和的半固体和的半固体MSMS培养基中，在培养基中，在2525，600lux600lux，12h/d12h/d光照条件下培养光照条件下培养18d18d，诱
8、导得到愈伤组织，每，诱导得到愈伤组织，每1818天继代一次。天继代一次。(2)(2)大蒜悬浮细胞培养大蒜悬浮细胞培养 将上述在半固体将上述在半固体MSMS培养基上培养培养基上培养18d18d的愈伤组的愈伤组织，在无菌条件下转入含有织，在无菌条件下转入含有3mg/L 2,4-D3mg/L 2,4-D和和 （苄基（苄基腺嘌呤）腺嘌呤）的液体的液体MSMS培养基中，加入灭菌的玻璃珠，培养基中，加入灭菌的玻璃珠，2525，600lux600lux，12h/d12h/d光照条件下震荡培养光照条件下震荡培养18d18d，使，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。然后在无菌条
9、件下，经过筛网将小细胞团或单然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有细胞转入含有3mg/L 2,4-D3mg/L 2,4-D和的液体和的液体MSMS培养基中，培养基中，25,600lux25,600lux，12h/d12h/d光照条件下震荡培养光照条件下震荡培养18d18d。(3)(3)酶的分离纯化酶的分离纯化 细胞培养完成后，收集细胞，经过细胞细胞培养完成后，收集细胞，经过细胞破碎、提取、分离得到超氧化物歧化酶。破碎、提取、分离得到超氧化物歧化酶。二、动物细胞培养产酶二、动物细胞培养产酶 1.1.动物细胞培养的特点动物细胞培养的特点动物细胞可以产生各种有效高价值的物质动物细胞可以
10、产生各种有效高价值的物质需添加抗生素需添加抗生素（常用青霉素和链霉素联合）（常用青霉素和链霉素联合）细胞生长速度慢细胞生长速度慢细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感。细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感。反应过程成本高，产品价格贵反应过程成本高，产品价格贵细胞具有锚地依赖性。宜采用贴壁培养细胞具有锚地依赖性。宜采用贴壁培养原代细胞一般繁殖原代细胞一般繁殖5050代代2.2.培养方式培养方式(1)(1)悬浮培养悬浮培养(2)(2)贴壁培养贴壁培养 滚瓶培养滚瓶培养 微载体培养微载体培养(microcarrier culture)(microcarrier culture)(3)(3)固定化细
11、胞培养固定化细胞培养包埋包埋(entrapment)(entrapment)和中空纤维和中空纤维(microencapsulation)(microencapsulation)培培养养3.工艺控制工艺控制 工艺流程工艺流程 种质细胞种质细胞（体细胞；杂交瘤细胞）（体细胞；杂交瘤细胞）分散成悬浮细胞分散成悬浮细胞 细胞悬浮或贴壁培养细胞悬浮或贴壁培养 收集收集 分离纯化分离纯化 产物产物 胰蛋白酶消化胰蛋白酶消化培养条件的影响与控制培养条件的影响与控制温度：一般控制在温度：一般控制在36.5.36.5.pHpH值：一般控制在的微碱性范围内。值：一般控制在的微碱性范围内。渗透压渗透压:应与细胞内渗
12、透压相同。应与细胞内渗透压相同。溶解氧：根据情况随时调节。溶解氧：根据情况随时调节。4.产酶实例产酶实例以人黑色素瘤细胞培养生产组织纤溶酶原以人黑色素瘤细胞培养生产组织纤溶酶原激活剂为例激活剂为例纤溶酶原纤溶酶原 纤溶酶纤溶酶纤溶酶原激活剂纤溶酶原激活剂种质细胞用胰蛋白酶处理，分散，磷酸盐洗涤。种质细胞用胰蛋白酶处理，分散，磷酸盐洗涤。稀释成细胞悬浮液稀释成细胞悬浮液接种到反应器中，与接种到反应器中，与37 CO37 CO2 2培养箱中，长成培养箱中，长成致密单层致密单层去培养液，用磷酸盐冲洗细胞去培养液，用磷酸盐冲洗细胞换无血清换无血清EagleEagle培养液，继续培养培养液，继续培养每每
13、3-43-4天，取出培养液分离纯化天，取出培养液分离纯化再加新鲜再加新鲜EagleEagle培养液，继续培养培养液，继续培养亲和层析进行分离亲和层析进行分离细胞生产滚瓶培养装置细胞生产滚瓶培养装置 第一章第一章作业：作业：1.1.概念概念 酶活力单位酶活力单位 酶比活力酶比活力2.2.酶工程的主要任务和主要内容是什么？酶工程的主要任务和主要内容是什么？3.3.写出酶活力测定的一般步骤。写出酶活力测定的一般步骤。第二章第二章作业：作业：1.1.概念：产物阻遏；分解代谢物阻遏；酶合成的概念：产物阻遏；分解代谢物阻遏；酶合成的诱导诱导2.2.提高酶产量的策措施有哪些？提高酶产量的策措施有哪些？3.3.试述发酵过程中对溶解氧进行控制的必要性及试述发酵过程中对溶解氧进行控制的必要性及其依据。其依据。4.4.影响酶生物合成模式的主要因素是什么？影响酶生物合成模式的主要因素是什么？5.5.优良产酶菌种应具备哪些条件？优良产酶菌种应具备哪些条件？第三章第三章作业：作业：1.1.概念：外植体；愈伤组织；微载体培养概念：外植体；愈伤组织；微载体培养2.2.论述植物细胞培养产酶的条件控制。论述植物细胞培养产酶的条件控制。3.3.动物细胞培养的特点有哪些？动物细胞培养的特点有哪些？4.4.举例说明动物细胞培养产酶的工艺过程。举例说明动物细胞培养产酶的工艺过程。