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1、第二讲第二讲核酸提取技术核酸提取技术PartTwoTechniquesofNucleicAcidIsolation第一部分：第一部分：DNA提取方法简介提取方法简介第二部分：第二部分：DNA提取常见问题、提取常见问题、原因分析及其对策原因分析及其对策内容内容第三部分：第三部分：RNA提取方法简介提取方法简介第四部分：第四部分：RNA提取及其提取及其RT-PCR常见常见 问题、原因分析及其对策问题、原因分析及其对策核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸的提取是分子生物学实验技术
2、中最重要、此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作最基本的操作。前言前言第一部分：第一部分：DNA提取方法简介提取方法简介第二部分：第二部分：DNA提取常见问题、提取常见问题、原因分析及其对策原因分析及其对策第三部分：第三部分：RNA提取方法简介提取方法简介第四部分：第四部分：RNA提取及其提取及其RT-PCR常见常见 问题、原因分析及其对策问题、原因分析及其对策第一部分：第一部分：DNA提取方法简介提取方法简介DNA提取提取的基的基本步本步骤骤DNA提取的几种方法提取的几种方法q基因组基因组DNADNA的提取的提取CTAB法法SDS法法其它其它DNA提取的几种方法提取的几种方法
3、q非基因组非基因组DNA的提取的提取质粒质粒DNA的提取的提取 碱裂解法碱裂解法 煮沸法煮沸法线粒体、叶绿体线粒体、叶绿体DNA的提取的提取 差速离心结合差速离心结合SDS裂解法裂解法基因组基因组DNA CTAB法法qCTAB法原理法原理（植物（植物DNA提取经典方法）提取经典方法）CTAB（cetyl trimethyl ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，
4、通过有机溶剂）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。出来。注：注：CTAB溶液在低于溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。qCTAB提取缓冲液的经典配方提取缓冲液的经典配方 组份组份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA（pH8.0）NaCl CTAB-巯基乙醇巯基乙醇 终浓度终浓度 100 mM 20 mM 1.4M2%(W/V)0.1
5、%（V/V）使用前加）使用前加入入Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合螯合Mg2+或或Mn2+离子，抑制离子，抑制DNase活性；活性；NaCl 提供一个高盐环境，使提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相中；充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除基因组基因组DNA CTAB法法qCTAB提取缓冲液的改进配方提取缓
6、冲液的改进配方 组份组份 Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaCl CTAB PVP40-巯基乙醇巯基乙醇 终浓度终浓度 100 mM 20 mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入使用前加入vPVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。和多糖结合，有效去除多糖。基因组基因组DNA CTAB法法基因组基因组DNA CTAB法法十六烷基三十六烷基三甲基溴
7、化铵甲基溴化铵qCTAB法流程图法流程图植物材料植物材料裂解液裂解液上层溶液上层溶液液氮研磨液氮研磨抽提抽提细胞裂解细胞裂解干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液基因组基因组DNA CTAB法法qCTAB法实例法实例1、1.5ml离心管中加入离心管中加入0.3ml提取液置提取液置65预热。预热。2、取材料、取材料0.03g，用液氮研磨（加入，用液氮研磨（加入0.003gPVP及少许石英沙）迅速研磨成粉。及少许石英沙）迅速研磨成粉。3、将冻粉迅速转入提取液中，尽快用移液枪混匀，在温度、将冻粉迅速转入提取液中，尽快用移液枪混匀，在温度65水浴水浴30min，期，期间轻轻摇动
8、几次（防止间轻轻摇动几次（防止DNA断裂）。断裂）。4、取出离心管，冷至室温，每管加等体积氯仿、取出离心管，冷至室温，每管加等体积氯仿/异戊醇（异戊醇（24：1），轻轻混匀，），轻轻混匀，颠倒混匀静止颠倒混匀静止10min，10000rpm离心离心10min。5、吸取上清夜于另一离心管中，加入、吸取上清夜于另一离心管中，加入1/10体积的体积的3%CTAB，混匀；再加入等体，混匀；再加入等体积的氯仿积的氯仿/异戊醇（异戊醇（24：1），轻缓颠倒混匀，室温放置），轻缓颠倒混匀，室温放置15min，然后，然后10000rpm离心离心10min去上清。去上清。6、分别用、分别用70%、80%酒精洗涤
9、沉淀。在风扇下将沉淀吹干。酒精洗涤沉淀。在风扇下将沉淀吹干。基因组基因组DNA CTAB法法qCTAB法实例法实例7、加、加30lTE缓冲液回溶缓冲液回溶DNA沉淀（不要反复吸打，用手指轻弹），同时加入沉淀（不要反复吸打，用手指轻弹），同时加入终浓度终浓度50l/mgRNase，置，置37处理处理1h。8、加入等体积的氯仿、加入等体积的氯仿/异戊醇异戊醇（24：1）抽提）抽提1-3次。次。9、吸取上清，加入终浓度为、吸取上清，加入终浓度为0.2-0.4mol/l的的NaCL，2倍体积的无水乙醇，放置倍体积的无水乙醇，放置1h左右，左右，10、12000rpm离心离心10min除去上清夜。除去上
10、清夜。11、用、用70%乙醇洗涤沉淀乙醇洗涤沉淀2-3次，自然干燥后，溶于次，自然干燥后，溶于30l去离子水中形成去离子水中形成DNA提取液。提取液。12、以、以DNA提取液提取液/去离子水去离子水1/100的比例加入石英杯中在蛋白质核酸分析仪中的比例加入石英杯中在蛋白质核酸分析仪中进行测定。进行测定。基因组基因组DNA CTAB法法q SDS法原理法原理基因组基因组DNASDS法法SDS是是一一种种阴阴离离子子去去垢垢剂剂，在在高高温温（5565）条条件件下下能能裂裂解解细细胞胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提提高高盐盐(KAc或或NH4Ac)浓浓
11、度度并并降降低低温温度度（冰冰浴浴），使使蛋蛋白白质质及及多多糖糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；杂质沉淀，离心后除去沉淀；上上清清液液中中的的DNA用用酚酚/氯氯仿仿抽抽提提，反反复复抽抽提提后后用用乙乙醇醇沉沉淀淀水水相相中中的的DNA。组份组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH 8.0）NaCl SDS终浓度终浓度 10 mM 20 mM 0.4M 2%q SDS法法DNA提取缓冲液提取缓冲液q SDS SDS法流程图法流程图 （以动物组织为例）（以动物组织为例）动物组织动物组织细胞裂解细胞裂解上层溶液上层溶液组织匀浆组织匀浆抽提抽提干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀D
12、NA溶液溶液基因组基因组DNASDS法法q SDS SDS法实例法实例1、取、取0.03g新鲜材料，置液氮中研磨成粉。新鲜材料，置液氮中研磨成粉。2、将冻粉转移置、将冻粉转移置65预热的预热的450lDNA提取液中，轻轻晃动，使冻粉充分散提取液中，轻轻晃动，使冻粉充分散开。开。3、加入、加入30l10%SDS充分混匀，置充分混匀，置65水浴中保温水浴中保温10-15min（间隔晃动（间隔晃动2-3次）次）4、加入、加入48lKAC充分混匀，冰浴中放置充分混匀，冰浴中放置30min。5、412000rpm离心离心15min。6、上清转入另一离心管中，加入等体积氯仿、上清转入另一离心管中，加入等体
13、积氯仿/异戊醇（异戊醇（24：1），轻扣，倒离），轻扣，倒离心管数次，放置片刻，于心管数次，放置片刻，于48000rpm离心离心10min。7、按、按6-7重复重复1-2次。次。8、将上清转移另一离心管，加入、将上清转移另一离心管，加入2倍体积冷无水乙醇。轻缓摇匀，置倍体积冷无水乙醇。轻缓摇匀，置-20沉沉淀淀0.5-1h。410000rpm离心离心10min。基因组基因组DNASDS法法9、倒掉上清，用、倒掉上清，用70%乙醇洗涤沉淀乙醇洗涤沉淀2-3次，吹干后，用次，吹干后，用30l去去TE缓冲液溶解缓冲液溶解沉淀。沉淀。10、DNA溶液加入溶液加入RNase1l，于，于37保温保温0.5
14、-1h。11、用等体积的氯仿、用等体积的氯仿/异戊醇（异戊醇（24：1）抽提）抽提1-3次次12、70%乙醇洗涤沉淀乙醇洗涤沉淀2-3次，自然干燥后，溶于次，自然干燥后，溶于30l去离子水形成去离子水形成DNA提取提取液。液。13、以、以DNA提取液提取液/去离子水去离子水1/100的比例加入石英杯中在蛋白质核酸分析仪的比例加入石英杯中在蛋白质核酸分析仪中进行测定。中进行测定。一步法一步法:1、0.03mg材料，加材料，加200l0.5mol/lNAOH研磨后，取研磨后，取60l研磨液，加研磨液，加300l100mol/lTris-HCL（PH7.6）缓冲液中）缓冲液中8000rpm离心离心5
15、min，取上清即为，取上清即为DNA提取液。提取液。2以以DNA提取液提取液/去离子水去离子水1/100的比例加入石英杯中在蛋白质核酸分析仪中的比例加入石英杯中在蛋白质核酸分析仪中进行测定。进行测定。基因组基因组DNASDS法法基因组基因组DNA其它方法其它方法物理方式物理方式：玻璃珠法、：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法超声波法、研磨法、冻融法化学方式化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法：异硫氰酸胍法、碱裂解法生物方式生物方式：酶法：酶法q根据细胞裂解方式的不同有：根据细胞裂解方式的不同有：基因组基因组DNA其它方法其它方法吸附材料结合法：吸附材料结合法：q根据核酸分离纯化方式的不同有：根据核
16、酸分离纯化方式的不同有：硅质材料硅质材料阴离子交换树脂阴离子交换树脂磁珠磁珠高盐低高盐低pHpH值结合核酸，低盐高值结合核酸，低盐高pHpH值洗脱。值洗脱。快捷高效。快捷高效。低盐高低盐高pHpH值结合核酸，高盐低值结合核酸，高盐低pHpH值洗脱。值洗脱。适用于纯度要求高的实验。适用于纯度要求高的实验。磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。物，从而达到分离目的。基因组基因组DNA其它方法其它方法浓盐法浓盐法：有机溶剂抽提法：有机溶剂抽提法：密度梯度离心法：密度梯度离心法：利用利用RNA和和DNA在盐溶液中溶解度不同，将二者分离在盐溶液中溶
17、解度不同，将二者分离有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物质粒质粒DNA碱裂解法碱裂解法q碱裂解法原理碱裂解法原理染色体染色体DNADNA比质粒比质粒DNADNA分子大得多，且染色体分子大得多，且染色体DNADNA为为线状分线状分子，而质粒子，而质粒DNADNA为共价闭合环状分子；为共价闭合环状分子；当用碱处理当用碱处理DNADNA溶液时，线状染色体溶液时，线状染色体DNADNA容易发生变性，共容易发生变性，共价闭环的质粒价闭环的质粒DNADNA在回到中
18、性在回到中性pHpH时即恢复其天然构象；时即恢复其天然构象；变性染色体变性染色体DNADNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒淀，而复性的超螺旋质粒DNADNA分子则以溶解状态存在液相分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。中，从而可通过离心将两者分开。l 碱变性碱变性碱变性碱变性质粒质粒DNA碱裂解法碱裂解法q碱裂解法流程图碱裂解法流程图对数期菌体对数期菌体溶液溶液III中和中和溶液溶液I充分重悬充分重悬溶液溶液II裂解裂解上清液上清液抽提抽提离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀干燥溶解干燥溶解沉淀沉淀质粒质粒DNA溶液溶
19、液溶液配制：溶液配制：溶液溶液1 1GETGET缓冲液：缓冲液：50mmol/L50mmol/L葡萄糖，葡萄糖，10mmol/L EDTA10mmol/L EDTA，25mMTris-HCl pH8.025mMTris-HCl pH8.0。溶液溶液2 20.2mol/L NaOH,1%SDS0.2mol/L NaOH,1%SDS溶液溶液3 3乙酸钾溶液乙酸钾溶液(3M,pH=4.8)(3M,pH=4.8)：60mL60mL的的5mol/L KAc,5mol/L KAc,11.5ml 11.5ml冰醋酸，冰醋酸，28.5mL H28.5mL H2 2O OTETE缓冲液或水（缓冲液或水（+20+
20、20 g/ml RNase g/ml RNase）:10mmol/L 10mmol/L，Tris-HCl,Tris-HCl,1mmol/L 1mmol/L，EDTA EDTA，pH8.0,pH8.0,100%100%乙醇，乙醇，7070乙醇乙醇注意：注意：用移液器操作时，每一步都要格用移液器操作时，每一步都要格外小心，特别是在加入溶液外小心，特别是在加入溶液II II 和和IIIIII后，一定不要剧烈振荡，以免后，一定不要剧烈振荡，以免切碎切碎DNA(DNA(包括质粒包括质粒DNADNA和基因组和基因组DNA)DNA)！1.1.培培养养细细菌菌：将将带带有有质质粒粒的的大大肠肠杆杆菌菌接接种种
21、到到1.5-3ml1.5-3ml含含有有相相应应抗抗生生素素的的液液体体培培养养基基，3737培养培养12121616小时小时;2.2.取取液液体体培培养养液液1.5-3ml1.5-3ml于于EppendorfEppendorf管管中中，10000r/min10000r/min离离心心1min1min，去去掉掉上上清清液液，加加入入100100 l l溶液溶液1(GET)1(GET)，充分混匀放置，充分混匀放置3-53-5分钟分钟;3.3.加加 入入 200200 l l新新 配配 制制 的的 0.2mol/L 0.2mol/L NaOH+1NaOH+1SDSSDS（变变性性液液），加加盖盖颠
22、颠倒倒6-76-7次次使使之之混混匀匀，冰上放置冰上放置5min;5min;质粒小量提取的方法（手工提取）：质粒小量提取的方法（手工提取）：4.4.加入加入150 150 l l乙酸钾溶液乙酸钾溶液(溶液溶液II)II)，加盖后颠倒，加盖后颠倒6-76-7次混匀，冰上放置次混匀，冰上放置5min;5min;5.5.用台式高速离心机，用台式高速离心机，10000r/min10000r/min离心离心7min7min，上，上清移入另一干净离心管，并加清移入另一干净离心管，并加1ml 1001ml 100乙醇乙醇混匀，混匀，12000r/min12000r/min离心离心5min5min，弃去上清液
23、，弃去上清液;6.6.沉淀用沉淀用0.5ml 700.5ml 70乙醇清洗一次，乙醇清洗一次，12000r/min12000r/min离心离心5min5min，弃去上清液，小管倒置，弃去上清液，小管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥;7.7.加入加入30-5030-50 l l含有含有2020 g/ml RNaseg/ml RNase的灭菌蒸馏的灭菌蒸馏水或水或TE TE 缓冲液溶解提取物，室温放置缓冲液溶解提取物，室温放置15-15-30min30min，使，使DNADNA充分溶解充分溶解(有时需要酚有时需要酚:氯仿抽提氯仿抽提););8.8.将分离出的
24、质粒将分离出的质粒DNADNA置于置于-20-20保存备用。保存备用。用分光光度计法定量用分光光度计法定量DNA1.1.取取2 2 l l提提取取的的质质粒粒DNADNA，加加入入9898 l l蒸蒸馏馏水水对对待待测测DNADNA样样品品做做1:50(1:50(或或更更高高倍数的稀释倍数的稀释););2.2.蒸蒸馏馏水水作作为为空空白白,在在波波长长260nm260nm、280nm280nm处处调调节节紫紫外外分分光光光光度度计计读读数数至零。至零。3.3.加加入入DNADNA稀稀释释液液，测测定定260nm260nm 及及280nm280nm的的吸吸收收值值。260nm260nm 读读数数
25、用用于于计计算算样样品品中中核核酸酸的的浓度。浓度。4.4.ODOD260260值值为为1 1相相当当于于约约5050 g g /ml/ml双双链链DNADNA，3333 g g/ml/ml单链。单链。5.5.可可根根据据在在260nm260nm以以及及在在280nm280nm的的读读数数的的比比值值（ODOD260260/OD/OD280280）估估计计核核酸酸的的纯纯度度。一一般般DNADNA的的纯纯品品，其其比比值值为为1.81.8，低低于于此此值值说说明明有有蛋白质或其它杂质的污染蛋白质或其它杂质的污染。6、记录记录ODOD值，通过计算确定值，通过计算确定DNADNA浓度浓度或纯度，公
26、式如下或纯度，公式如下:dsDNA=50 dsDNA=50(OD(OD260260)稀释倍数稀释倍数以上浓度单位为以上浓度单位为 g g/ml/ml 凝胶电泳检测凝胶电泳检测DNADNA的浓度的浓度0.8%0.8%的琼脂糖凝胶，的琼脂糖凝胶，100V,40100V,40分钟。分钟。NEB NEB 标准分子量片段标准分子量片段(1kb DNA Ladder)(1kb DNA Ladder)1 kb DNA Ladder1 kb DNA Ladder虽然不能虽然不能对对DNADNA质量进行精确定量分质量进行精确定量分析，但可以通过与相近的析，但可以通过与相近的条带进行比较估算出大概条带进行比较估算
27、出大概的数据。每条带大概的量的数据。每条带大概的量如下（按如下（按0.5g0.5g上样量计。上样量计。应按应按1313条带计算，因为条带计算，因为3kb3kb的量是其它片段量的近三的量是其它片段量的近三倍）：倍）：片段碱基对质量110,00242 ng28,00142 ng36,00150 ng45,00142 ng54,00133 ng63,001125 ng72,00048 ng81,50036 ng91,00042 ng10a51742 ng*10b50042 ng*0.5kb的条带由的条带由500bp和和517bp组组成，这样即使在低分子量区域条成，这样即使在低分子量区域条带的强度也比
28、较均一。带的强度也比较均一。质粒质粒DNA煮沸法煮沸法q煮沸法原理煮沸法原理染色体染色体DNADNA比质粒比质粒DNADNA分子大得多，且染色体分子大得多，且染色体DNADNA为为线状分线状分子，而质粒子，而质粒DNADNA为共价闭合环状分子；为共价闭合环状分子；当加热处理当加热处理DNADNA溶液时，线状染色体溶液时，线状染色体DNADNA容易发生变性，共容易发生变性，共价闭环的质粒价闭环的质粒DNADNA在冷却时即恢复其天然构象；在冷却时即恢复其天然构象；变性染色体变性染色体DNADNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒淀，而复性
29、的超螺旋质粒DNADNA分子则以溶解状态存在液相分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。中，从而可通过离心将两者分开。细胞器细胞器DNA差速离心法差速离心法q差速离心法原理差速离心法原理是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分离。从而得以分离。线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞
30、器，自身可编码蛋白，它们的白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。种组分分级分离出来。大豆线粒体大豆线粒体DNA的提取的提取 1、大豆黄化苗的培育大豆黄化苗的培育取大豆种子（大小均一、无病虫害）取大豆种子（大小均一、无病虫害）2020粒左右，用粒左右，用清水冲洗干净，浸泡清水冲洗干净，浸泡1 12 2天。待种子完全膨胀后，天。待种子完全膨胀后，取两张发芽纸，用水浸湿，将种子均匀、整齐地摆放取两张发芽纸，用水浸湿
31、，将种子均匀、整齐地摆放在发芽纸上，其上再覆盖一层发芽纸，然后从一端卷在发芽纸上，其上再覆盖一层发芽纸，然后从一端卷起，两端用束带扎起，防止豆种散落，放入装有一薄起，两端用束带扎起，防止豆种散落，放入装有一薄层清水的烧杯中，于层清水的烧杯中，于2828暗培养暗培养5 57 7天（定期更换天（定期更换补充烧杯内水源），补充烧杯内水源），1010左右长的黄化幼苗即可作为左右长的黄化幼苗即可作为实验材料。实验材料。大豆线粒体大豆线粒体DNA的提取的提取 2、线粒体的分离和纯化、线粒体的分离和纯化 1 1）取黄化苗）取黄化苗30g30g，剪成，剪成2cm2cm左右的小段，按左右的小段，按5ml/g5m
32、l/g加匀浆缓冲液加匀浆缓冲液A A（500mmol/L500mmol/L蔗糖，蔗糖，50mmol/L Tris-Cl pH7.550mmol/L Tris-Cl pH7.5，5mmol/L EDTA5mmol/L EDTA，0.1%BSA0.1%BSA，5mmol/L-5mmol/L-巯基乙醇），用预冷的巯基乙醇），用预冷的组织捣碎机匀浆，组织捣碎机匀浆，2 2层无菌纱布过滤。层无菌纱布过滤。2 2）将滤液以）将滤液以1000g1000g，离心，离心10min10min，收取上清，再经，收取上清，再经17000g17000g，离心，离心15 min15 min。3 3）将得到的线粒体沉淀重悬
33、于）将得到的线粒体沉淀重悬于2.5ml2.5ml（按（按1ml/20g1ml/20g）悬浮缓冲液）悬浮缓冲液 B B（300mmol/L300mmol/L蔗糖，蔗糖，50mmol/L Tris-Cl pH7.550mmol/L Tris-Cl pH7.5）中，加）中，加MgCl2MgCl2至终浓度为至终浓度为10mmol/L10mmol/L，加，加DNase IDNase I至终浓度为至终浓度为50g/ml50g/ml，冰上反应，冰上反应1h1h，然后加，然后加EDTAEDTA至终浓度为至终浓度为50 mmol/L50 mmol/L，以终止反应。，以终止反应。4 4）17000g17000g，
34、离心，离心15min15min，所得沉淀悬于，所得沉淀悬于6ml6ml缓冲液缓冲液A A中；取中；取6 6只只4ml4ml的水平超速离心管，的水平超速离心管，依次铺依次铺60%60%、52%52%、36%36%、20%20%蔗糖液（蔗糖液（60%60%、52%52%、36%36%与与20%20%的蔗糖液用的蔗糖液用TETE配制）各配制）各700l700l，上铺，上铺1ml1ml线粒体悬液，线粒体悬液，35000 r/min35000 r/min，离心，离心1h1h。5 5）收集）收集52%52%与与36%36%蔗糖液之间的黄色线粒体层于一新蔗糖液之间的黄色线粒体层于一新50ml50ml离心管中
35、，加离心管中，加3 3倍体积裂解缓倍体积裂解缓冲液冲液 C C（150mmol/L NaCl 150mmol/L NaCl，50mmol/L Tris-Cl pH8.050mmol/L Tris-Cl pH8.0，20mmol/L EDTA20mmol/L EDTA）轻轻混匀，于）轻轻混匀，于17000g17000g，离心，离心15min15min，所得沉淀即为纯化线粒体。，所得沉淀即为纯化线粒体。大豆线粒体大豆线粒体DNA的提取的提取 3、线粒体、线粒体DNA的提取的提取 1）将线粒体沉淀悬于）将线粒体沉淀悬于1ml缓冲液缓冲液C中，加中，加-巯基乙醇至终浓度为巯基乙醇至终浓度为5%，加蛋白
36、，加蛋白酶酶K至终浓度为至终浓度为200g/ml，加，加SDS至终浓度为至终浓度为2%，37反应反应2h后于冰水浴中冷却。后于冰水浴中冷却。2）加等体积氯仿）加等体积氯仿/异戊醇（异戊醇（24：1）抽提）抽提12次，离心取上清。次，离心取上清。3）上清中加）上清中加2倍体积无水乙醇，倍体积无水乙醇，-20过夜；过夜；17000g，离心，离心20min，所得沉淀用，所得沉淀用70%酒精洗涤后，晾干，溶于酒精洗涤后，晾干，溶于100lTE或水，或水，-20保存备用。保存备用。（如未加说明，以上操作均在（如未加说明，以上操作均在4条件下进行。）条件下进行。）大豆线粒体大豆线粒体DNA的提取的提取 4
37、、线粒体、线粒体DNA的检测的检测（1）电泳检测 取取1l1l所得的所得的mtDNAmtDNA溶液加溶液加1L1L溴酚蓝，行溴酚蓝，行0.8%0.8%琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳，以以DNADNA（50ng50ng）作对照，于）作对照，于70V70V稳压电泳稳压电泳90min90min（待溴酚蓝行至离（待溴酚蓝行至离前端前端2cm2cm左右），在紫外灯下观察。左右），在紫外灯下观察。（2）DNA含量测定 取取5l5l所得的所得的mtDNAmtDNA溶液，于溶液，于1ml1ml比色皿中加比色皿中加995l995l无菌水，在无菌水，在岛津岛津UV2401PCUV2401PC型紫外分光光度计上测定
38、型紫外分光光度计上测定OD230OD230、OD260OD260及及OD280OD280。DNA的酶切鉴定的酶切鉴定 质粒量质粒量（ngng）缓冲液缓冲液(l)*(l)*EcoREcoR1 1（ll）XhoXho1 1（ll）H H2 2O O(l)(l)总体积总体积（ll）I I2002002 20 00 017-1917-192020IIII2002002 20.50.50 015-1715-172020IIIIII2002002 20.50.50.50.514-1614-162020*缓冲液随不同的酶而不同缓冲液随不同的酶而不同,本实验用本实验用 H bufferH buffer。置于置
39、于3737水浴酶解水浴酶解0.5-10.5-1小时。酶解完成后，分别小时。酶解完成后，分别加入加入1010 l l 3 3倍的上样缓冲液倍的上样缓冲液,然后各取然后各取1515 l l进进行电泳分析。行电泳分析。1)质粒质粒DNA的酶解的酶解2)琼脂糖凝胶的制备琼脂糖凝胶的制备琼脂糖凝胶液的制备：称取琼脂糖凝胶液的制备：称取0.8g琼脂糖，置于三琼脂糖，置于三角瓶中，加入角瓶中，加入100mlTBE或或TAE工作液，瓶口倒工作液，瓶口倒扣一个小烧杯，将该三角瓶置于微波炉加直至琼扣一个小烧杯，将该三角瓶置于微波炉加直至琼脂溶解。脂溶解。3）胶板的制备）胶板的制备取有机玻璃内槽，洗净、晾干；将有机
40、玻璃取有机玻璃内槽，洗净、晾干；将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上，放好梳子。内槽置于一水平位置模具上，放好梳子。将冷却至将冷却至65左右的琼脂糖凝胶液，小心地倒左右的琼脂糖凝胶液，小心地倒在有机玻璃内槽上，控制灌胶速度和量，使胶在有机玻璃内槽上，控制灌胶速度和量，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。成均匀的胶层。室温下静置室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。出梳子，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有制好胶后将铺胶的有机玻璃
41、内槽放在含有0.5-1TAE（Tris-乙酸）乙酸）或或TBE（Tris-硼酸）工作硼酸）工作液的电泳槽中使用。液的电泳槽中使用。4）加样）加样用微量加样器将上述样品分别加入胶板的用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品孔内。每加完一个样品，换一个加样样品孔内。每加完一个样品，换一个加样头。加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶头。加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透凝胶底部，本实验样品孔容量面以及穿透凝胶底部，本实验样品孔容量约约1520 l。1kbDNAladder（能见到（能见到10条带）条带）:在第在第一个上样孔或最后一个上样孔内加入一个上样孔或最后一个上样孔内加入6 l的的1kbDN
42、Aladder（50ng/l）。）。5）电泳（带上手套操作）电泳（带上手套操作）加完样后的凝胶板即可通电进行电泳；加完样后的凝胶板即可通电进行电泳；建议在建议在80100V的电压下电泳；的电压下电泳；当溴酚兰移动到距离胶板下沿约当溴酚兰移动到距离胶板下沿约1cm处停处停止电泳；止电泳；将凝胶放入将凝胶放入溴化乙啶（溴化乙啶（EB工作液工作液（0.5 g/ml左右）中染色约左右）中染色约20min。为了获得电泳分离为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，片段的最大分辨率，电场强度不应高于电场强度不应高于5V/cm（两电极间的距（两电极间的距离）。电泳温度视需要而定，对大分子的离）。电泳温度视需要
43、而定，对大分子的分离，以低温较好，也可在室温下进行。分离，以低温较好，也可在室温下进行。在琼脂糖凝胶浓度低于在琼脂糖凝胶浓度低于0.5%时，由于胶太时，由于胶太稀，最好在稀，最好在4进行电泳以增加凝胶硬度。进行电泳以增加凝胶硬度。6）观察与拍照）观察与拍照在紫外灯在紫外灯(310nm波长波长)下观察染色后的凝胶。下观察染色后的凝胶。DNA存在处显示出红色的荧光条带。紫外存在处显示出红色的荧光条带。紫外光激发光激发30s左右，肉眼可观察到清晰的条带。左右，肉眼可观察到清晰的条带。在紫外灯下观察时，应戴上防护眼镜或有在紫外灯下观察时，应戴上防护眼镜或有机玻璃防护面罩，避免眼睛遭受强紫外光机玻璃防护
44、面罩，避免眼睛遭受强紫外光损伤。拍照电泳图谱时，可采用快速凝胶损伤。拍照电泳图谱时，可采用快速凝胶成象系统。成象系统。对对于于未未进进行行酶酶切切的的质质粒粒来来说说，常常会会出出现现两两条条电电泳泳带带，一一条条是是（松松弛弛）螺螺旋旋状状质质粒粒DNADNA带带，另另一一条条是是超超螺螺旋旋状状质质粒粒DNADNA的的带带，以以超超螺螺旋旋状状质质粒粒DNADNA居居多多，移移动动速速度度也也最最快快。有有时时还还会会出出现现三三条条带带，其其中中一一条条是是因因为为有有一一些些质质粒粒DNADNA在在提提取取过过程程中中遭遭到到损损伤伤而而线线性性化化，其其移移动动速速度度介介于于螺螺旋
45、旋状状和和超超螺螺旋旋状状质质粒粒DNADNA之之间间，所所以以该该条条电电泳泳带带位位于于上上述述两两种种带带之之间间。如如果果提提取取的的质质粒粒很很好时，这条带会很弱，有时看不到。好时，这条带会很弱，有时看不到。Relaxed circleSuper-coiled form第一部分：第一部分：DNA提取方法简介提取方法简介第二部分：第二部分：DNA提取常见问题、提取常见问题、原因分析及其对策原因分析及其对策内容内容第三部分：第三部分：RNA提取方法简介提取方法简介第四部分：第四部分：RNA提取及其提取及其RT-PCR常见常见 问题、原因分析及其对策问题、原因分析及其对策第二部分：第二部分
46、：DNA提取常见问题、提取常见问题、原因分析及其对策原因分析及其对策DNA提取的基本步骤提取的基本步骤I.I.材料准备材料准备II.II.破碎细胞或包膜内容物释放破碎细胞或包膜内容物释放III.III.核酸分离、纯化核酸分离、纯化IV.IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.V.核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸溶解在适量缓冲液或水中材料准备材料准备最好使用新鲜材料，最好使用新鲜材料，低温保低温保存的样品材料不要反复冻融存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组提取血液基因组DNA时，要时，要选择有核细胞（白细胞）选择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长，组培细胞培养时间不
47、能过长，否则会造成否则会造成DNA降解降解含病毒的液体材料含病毒的液体材料DNADNA含量较含量较少，提取前先富集少，提取前先富集基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取使用处于对数期的新鲜菌体（老使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）化菌体导致开环质粒增加）培养时应加入筛选压力，否则菌培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失体易污染，质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒，如为低尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体拷贝或大质粒，则应加大菌体用量用量菌株不要频繁转接（质粒丢失）菌株不要频繁转接（质粒丢失）细胞裂解细胞裂解材料应适量，过
48、多会影响裂解，材料应适量，过多会影响裂解，导致导致DNA量少，纯度低量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：解预处理方式：植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨组培细胞蛋白酶组培细胞蛋白酶K细菌溶菌酶破壁细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠酵母破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡高温温浴时，定时轻柔振荡基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取菌体量适当菌体量适当培养基去除干净，同时保证菌体培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮在悬浮液中充分悬浮变性的时间不要过长（变性的时间不要过长（5
49、分钟），分钟），否则质粒易被打断否则质粒易被打断复性时间也不宜过长，否则会有复性时间也不宜过长，否则会有基因组基因组DNA的污染的污染G菌、酵母质粒的提取，应先菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以破壁用酶法或机械法处理，以破壁核酸分离、纯化核酸分离、纯化采用吸附材料吸附的方式分离采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相时，应提供相应的缓冲体系应的缓冲体系采用有机（酚采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的针对不同材料的
50、特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法去杂质的方法基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取核酸分离、纯化核酸分离、纯化q蛋白质的去除：蛋白质的去除：酚酚/氯仿抽提氯仿抽提使用变性剂变性（使用变性剂变性（SDSSDS、异硫氰酸胍等）、异硫氰酸胍等）高盐洗涤高盐洗涤蛋白酶处理蛋白酶处理q多糖的去除：多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/21/2体体积的积的5M NaCl5M NaCl，高盐可溶解多糖。，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯在提取缓冲液中加一