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1、第八课第八课 双向凝胶电泳双向凝胶电泳概述概述原理原理-IEF，SDS-PAGE双向凝胶电泳分离操作双向凝胶电泳分离操作双向凝胶电泳检测双向凝胶电泳检测双向电泳分离技术的优缺点双向电泳分离技术的优缺点DI GE技术技术一、双向凝胶电泳概述一、双向凝胶电泳概述 双向电泳的思路最早由双向电泳的思路最早由Smithies和和Poulikc提出，蛋白质第提出，蛋白质第一向电泳是根据其自由溶液迁移率一向电泳是根据其自由溶液迁移率(free-solutionmobility)，在滤纸条上进行；第二向电泳方向与第一向垂直，在淀粉胶在滤纸条上进行；第二向电泳方向与第一向垂直，在淀粉胶上进行。上进行。随着聚丙烯
2、酰胺凝胶的发明，双向电泳支持介质逐渐转向随着聚丙烯酰胺凝胶的发明，双向电泳支持介质逐渐转向聚丙烯酰胺凝胶，即双向凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶，即双向凝胶电泳。1969年，双向凝胶电泳年，双向凝胶电泳在原理上有了新的发展，以第一向为蛋白质等电聚焦的双向在原理上有了新的发展，以第一向为蛋白质等电聚焦的双向凝胶电泳建立起来凝胶电泳建立起来(即即IEF-PAGE)。20世纪世纪70年代初，第二向电泳中使用了十二烷基硫酸钠年代初，第二向电泳中使用了十二烷基硫酸钠(SDS)，使第二向电泳基本上根据蛋白质的相对分子质量来，使第二向电泳基本上根据蛋白质的相对分子质量来分离，从而奠定了现代双向凝胶电泳的基础分离，从
3、而奠定了现代双向凝胶电泳的基础(即即IEF-SDS PAGE)。1975年，年，OFarrellL、Kloset和和Scheele分别对双向分别对双向凝胶电泳做进一步的优化，建立了高分辨的双向凝胶电泳。凝胶电泳做进一步的优化，建立了高分辨的双向凝胶电泳。双向电泳分析中的样品制备制备原则制备原则：应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰防止
4、在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。（如酶性或化学性降解等）。完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。待研究蛋白的可检测性。可溶性样品可溶性样品 固体组织样品固体组织样品 细胞细胞不同样品的基本处理方法不同样品的基本处理方法样品的分级处理样品的分级处理通过采用亚细胞分级、液相电泳和选择性沉淀等方法对蛋白质样品进行分级处理，可降低样品的复杂性并富集低丰度蛋白质。当前最简单有效的处理是采用分级抽提，按样品溶解度不同进行分离。
5、样品的溶解是是2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一。成功分离蛋白质的最关键因素之一。溶解的目标：溶解的目标：1、样品中非共价结合的蛋白质、样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液（否则样品中结合牢固的蛋白复合物的溶解液（否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使可能使2-DE中出现新的蛋白点，相应的表示单中出现新的蛋白点，相应的表示单个多肽的点的强度会下降）；个多肽的点的强度会下降）；2、溶解方法必、溶解方法必须允许可能干扰须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除；核酸等物质的去除；3
6、、溶解方法要保证样品、溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解状态。在电泳过程中保持溶解状态。增加样品溶解性的手段增加样品溶解性的手段变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。量域。其典型代表是尿素和硫尿。表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。团后，还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面活性剂有离子去污剂常用的表面活
7、性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂非离子去污剂Triton X-100和和NP-40、两性离子去污剂两性离子去污剂CHAPS、OBG等。其中等。其中CHAPS和和SB3-10最好。最好。还原剂：在变性剂和表面活性剂联用条件下，加用还还原剂：在变性剂和表面活性剂联用条件下，加用还原剂可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。原剂可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。常用含自由巯基的常用含自由巯基的DTT或或-巯基乙醇，以及不带电荷巯基乙醇，以及不带电荷的三丁基膦（的三丁基膦（TBP）进行还原。进行还原。起载体作用的两性电解质：即便在变性剂和表起载体作用的两性电解质：即便在变性剂和表面活性剂
8、存在的情况下，某些蛋白质也需要在面活性剂存在的情况下，某些蛋白质也需要在盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态，否盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态，否则这些蛋白质在其处于则这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀。点时会发生沉淀。Carrier ampholytes的作用在于捕获样品中的的作用在于捕获样品中的少量盐分，从而保证蛋白质的溶解性。应用时，少量盐分，从而保证蛋白质的溶解性。应用时，两性电解质的浓度应小于两性电解质的浓度应小于0.2（w/v)。浓度过浓度过高会使高会使IEF的速度降低。另外，为了保证实验的速度降低。另外，为了保证实验的精确性，在选择不同的精确性，在选择不同pH范围的范围的
9、IPG胶条时，胶条时，也应使两性电解质的也应使两性电解质的pH值与之相符合。值与之相符合。样品中核酸的去除样品中核酸的去除对电泳的影响：增加样品粘度、与蛋白对电泳的影响：增加样品粘度、与蛋白质形成复合物后会出现假象迁移和条纹。质形成复合物后会出现假象迁移和条纹。解决方法：用适量纯的不含蛋白酶的核解决方法：用适量纯的不含蛋白酶的核酸内切酶进行降解，或是利用合成载体酸内切酶进行降解，或是利用合成载体两性电解质（两性电解质（SCA）同核酸结合形成复合同核酸结合形成复合物的能力，再通过超速离心来去除复合物的能力，再通过超速离心来去除复合物。物。亚蛋白质组样品的制备亚蛋白质组样品的制备用超离心技术分离出
10、细胞器、质膜和细胞核等成分，用超离心技术分离出细胞器、质膜和细胞核等成分，再用适当的蛋白质溶解液进行溶解。其优点是不仅大再用适当的蛋白质溶解液进行溶解。其优点是不仅大大减少样品的复杂性，而且可对分离的蛋白质进行亚大减少样品的复杂性，而且可对分离的蛋白质进行亚细胞定位。但该法需要专业仪器，有时会出现假阳性。细胞定位。但该法需要专业仪器，有时会出现假阳性。顺序抽提法：根据细胞蛋白溶解性的差异，用具有顺序抽提法：根据细胞蛋白溶解性的差异，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液进行抽提的方法。不同溶解能力的蛋白溶解液进行抽提的方法。第一步：用第一步：用Tris碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白；碱溶液裂解细胞提取
11、高溶解性蛋白；第二步：把未溶解的第二步：把未溶解的pellet用标准用标准IEF样品液溶解提取样品液溶解提取高疏水性蛋白；高疏水性蛋白；第三步：用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后抽第三步：用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后抽提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白约占整个样品的提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白约占整个样品的11%（W/W）。）。特殊样品的制备特殊样品的制备 低低丰丰度度蛋蛋白白的的分分离离：尽尽管管增增加加上上样样量量和和提提高高总总蛋蛋白白的的溶溶解解度度能能增增加加分分离离时时的的低低丰丰度度蛋蛋白白的的量量，但但同同时时增增加加了了高高丰丰度度蛋蛋白白的的负负荷荷，且且造造成成蛋
12、蛋白白的的叠叠加加效效应应而而影影响响分分离离。现现常常用用预预分分级级窄窄pH胶胶的的微微制制备备技技术术进进行行分分离离：即即将将总总蛋蛋白白组组分分成成蛋蛋白白质质组组亚亚群群，再再用用pH梯梯度度小小于于2个个pH单单位位的的IPG胶进行胶进行窄窄pH范围的分离。范围的分离。强碱性蛋白质（如核糖体强碱性蛋白质（如核糖体）的处理：先将蛋白预处）的处理：先将蛋白预处理以富集，再用特殊理以富集，再用特殊pH梯度的梯度的IPG胶条（如胶条（如pH312、4-12或或10-12）进行等电聚焦。其中窄范围碱性）进行等电聚焦。其中窄范围碱性IPG胶胶（如（如pH10-12）的挑战是克服反向、阴极向阳
13、极、电的挑战是克服反向、阴极向阳极、电渗流和水平条纹模式，而宽范围的碱性渗流和水平条纹模式，而宽范围的碱性IPG胶（如胶（如pH3-12、4-12）等消除了窄范围胶所需要的专门水化等消除了窄范围胶所需要的专门水化液。液。极端分子量的蛋白质：小于极端分子量的蛋白质：小于8kD和大于和大于200kD的蛋白的蛋白在常规在常规IPG-2D上不易看到，这可能是在上不易看到，这可能是在Tris/glycine缓冲液中，样品和游离的缓冲液中，样品和游离的dodelcyl sulfate ions持续积持续积累浓缩，与小分子量的蛋白质发生对流混合，产生茸累浓缩，与小分子量的蛋白质发生对流混合，产生茸毛状的或模
14、糊的带，从而降低小蛋白的分辨率；在胶毛状的或模糊的带，从而降低小蛋白的分辨率；在胶底端，高浓度的十二磺酸使蛋白固定致染色困难。至底端，高浓度的十二磺酸使蛋白固定致染色困难。至于高分子量蛋白少的原因可能是在变性条件下，蛋白于高分子量蛋白少的原因可能是在变性条件下，蛋白质复合物变成了多肽，或者可能是大分子。质复合物变成了多肽，或者可能是大分子。一维固一维固相相pH梯度等电聚焦梯度等电聚焦（IEF with IPG）：）：IPG胶的材料是胶的材料是Immobilines，为拥有为拥有CH2=CH-CO-NH-R结构的结构的8种丙烯酰胺衍生物种丙烯酰胺衍生物系列，其中系列，其中R包含羧基或叔氨基团，它
15、们构成包含羧基或叔氨基团，它们构成了分布在了分布在pH310不同值的缓冲体系。根据公布不同值的缓冲体系。根据公布的配方计算后，将适宜的的配方计算后，将适宜的IPG试剂添加至混合试剂添加至混合物中用于凝胶聚合，在聚合中缓冲基团通过乙物中用于凝胶聚合，在聚合中缓冲基团通过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯梯度。通过这种方式生成的度。通过这种方式生成的IPG不会发生电渗透不会发生电渗透作用，因而可以进行特别稳定的作用，因而可以进行特别稳定的IEF分离达到分离达到真正的平衡状态。真正的平衡状态。Immobilized pH Gradient(IPG)IPG
16、胶条的重泡胀胶条的重泡胀泡胀的实质：是让样品能完全以可溶性的形泡胀的实质：是让样品能完全以可溶性的形式进入式进入IPG内，从而能进行接下来的内，从而能进行接下来的IEF 常用的泡胀液的成分为常用的泡胀液的成分为8M8M尿素，尿素，2 2的去污剂（的去污剂（NP-NP-40,Triton X-100,CHAPS),15mM DTT,0.5%IPG buffer40,Triton X-100,CHAPS),15mM DTT,0.5%IPG buffer蛋白载样量蛋白载样量影响影响IPG胶条对蛋白载样量的因素包括：胶条对蛋白载样量的因素包括：电泳的目的：如果只是得到一张好的图片，则无需电泳的目的：如
17、果只是得到一张好的图片，则无需考虑太多其它因素。考虑太多其它因素。待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析。待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析。不同的加样方法和加样量（根据显色方法）不同的加样方法和加样量（根据显色方法）待研究蛋白的丰度待研究蛋白的丰度样品的复杂度：复杂度较高的样品，为了尽可能的样品的复杂度：复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白，需要反复实验才能完成。了解所包含的每种蛋白，需要反复实验才能完成。如果将待检样品被富集以后则更易分析。如果将待检样品被富集以后则更易分析。IPG胶条的胶条的pH范围范围IPG胶条的蛋白质大约载样量胶条的蛋白质大约载样量IPG Strip
18、 lengthAnalytical Load(silver staining)Preparative Load(Coom staining)7cm10100 g/125 l200500ug/125 l11cm50200 g/185 l2501000ug/185 l17cm100300 g/300 l13mg/300 lIPG IEF 中中pH梯度的选择梯度的选择 常用方法：先宽后窄，先线性后非线性，常用方法：先宽后窄，先线性后非线性，先短后长，预试验确定。先短后长，预试验确定。温度的选择温度的选择：20 (防止低温尿素结晶）防止低温尿素结晶）IPG IEF 中的温度中的温度聚焦时间聚焦时间理论
19、上讲，要获得最好的图谱质量和重复性所理论上讲，要获得最好的图谱质量和重复性所需最佳时间是需最佳时间是IEF分离达到稳定态所需的时间。分离达到稳定态所需的时间。聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹的出现。聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹的出现。过度聚焦虽然不会导致蛋白质向阴极漂移，但过度聚焦虽然不会导致蛋白质向阴极漂移，但会因为活性水转运而导致过多水在会因为活性水转运而导致过多水在IPG胶表面胶表面渗出（电渗）而造成蛋白图谱变性，在胶条碱渗出（电渗）而造成蛋白图谱变性，在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢失。性端产生水平条纹以及蛋白丢失。最佳时间的确定需要根据不同蛋白样品、上样最佳时间的确定需要根
20、据不同蛋白样品、上样量、量、pH范围和胶条长度通过经验来确定。范围和胶条长度通过经验来确定。IEF的基本条件的基本条件Step 1Step 2Step 3totalvoltageTimeVolt-HoursRamp25020minLinear400040002hr10,000V-hrLinearRapid5 hr14,000V-hr7 cmStep 1Step 2Step 3totaltotalStep 1Step 2Step 311 cm17 cm25025080001000010000800020min20min 2.5hr2.5hr20,000V-hr40,000V-hr30,000V-
21、hr50,000V-hr5.3 hr7 hrLinear LinearLinear LinearRapidRapidProtean IEF cell、IPGphor等集等集成设备成设备两维间的平衡两维间的平衡 一维结束后可马上进行二维电泳，也可保存在两片一维结束后可马上进行二维电泳，也可保存在两片塑料膜间于塑料膜间于80保存数月。保存数月。但在二维电泳前一定要进行胶条的平衡，以便于被但在二维电泳前一定要进行胶条的平衡，以便于被分离的蛋白质与分离的蛋白质与SDS完整结合，从而在完整结合，从而在SDS-PAGE是电泳能顺利进行。是电泳能顺利进行。建议方案是：建议方案是：用含用含2%(m/v)SDS
22、、1%(m/v)DTT、6mM尿素和尿素和30%甘油的甘油的50mM Tris（pH8.8）缓冲液先平衡缓冲液先平衡15min，再用再用5%(m/v)碘乙酰胺取代碘乙酰胺取代DTT后的上述后的上述缓冲液平衡缓冲液平衡15min。如果用如果用TBP代替代替DTT则只需一则只需一步平衡。步平衡。二维二维SDS-PAGE同普通同普通SDS-PAGE类似。类似。但一般在垂直电泳系统中无需浓缩胶，但一般在垂直电泳系统中无需浓缩胶，因为在因为在IPG胶条中蛋白质区域已得到浓缩，胶条中蛋白质区域已得到浓缩，可以认为非限制性可以认为非限制性IEF胶（低浓度丙烯酰胶（低浓度丙烯酰胺胶）充当了浓缩胶。胺胶）充当了
23、浓缩胶。2D Gel-Based Proteomics聚丙烯酰胺凝胶的蛋白质的检测聚丙烯酰胺凝胶的蛋白质的检测理想显色剂的理想显色剂的7S安全（安全（safety）：）：灵敏（灵敏（sensitivity）：）：简单（简单（simplicity）：）：特异性（特异性（specificity）：）：快速（快速（speed）：）：稳定（稳定（stability）：）：兼容性（兼容性（synergy）：）：考马斯亮蓝染色和银染考马斯亮蓝染色和银染考染灵敏度为考染灵敏度为30100ng，线性范围是线性范围是20倍；银染的倍；银染的线性范围是线性范围是40倍，灵敏度是考染的倍，灵敏度是考染的100倍。倍
24、。胶体考马斯亮蓝染色技术可实现胶体考马斯亮蓝染色技术可实现PAGE的无背景染的无背景染色，其极限灵敏度为色，其极限灵敏度为810ng，但这种染液会对蛋白但这种染液会对蛋白质进行修饰而影响质谱分析的结果。质进行修饰而影响质谱分析的结果。银染的缺点是：对某些种类的蛋白质染色效果差，银染的缺点是：对某些种类的蛋白质染色效果差，对其后的蛋白质测序和质谱分析造成影响。对其后的蛋白质测序和质谱分析造成影响。这两种染色技术都可减少胶内蛋白质产量。这两种染色技术都可减少胶内蛋白质产量。The Silver Stained 2-DE Map of Rat Liver Mitochondrial Protein
25、3 pH 104 pH 7 400ug IEF:pH310 NL SDS-PAGE 12.5 200ug IEF:pH47 SDS-PAGE 10有机荧光团染料有机荧光团染料包包括括共共价价结结合合和和非非共共价价结结合合的的荧荧光光团团染染料料两两类类。后后者者最最为为常常用用，其其典典型型代代表表是是已已经经商商品品化化的的SYPRO Red、Orange、Ruby等荧光染料。等荧光染料。这这三三种种染染料料可可对对SDS-PAGE胶胶内内蛋蛋白白质质进进行行一一步步染染色色，约约3060min完完成成，灵灵敏敏度度为为210ng。染染色色后后的的凝凝胶胶用用标标准准的的实实验验室室300
26、nm紫紫外外透透射射仪进行照像保存，其线性范围为仪进行照像保存，其线性范围为3个数量级。个数量级。在在Tris/甘甘氨氨酸酸转转印印缓缓冲冲液液中中染染色色后后，蛋蛋白白质质可可被被转转印印至至膜膜上上并并进进行行免免疫疫染染色色或或Edman测测序序来来鉴定蛋白质。鉴定蛋白质。荧光染色的优缺点荧光染色的优缺点对对蛋白无固定作用蛋白无固定作用与质谱兼容性好与质谱兼容性好灵敏度较高与银染相仿灵敏度较高与银染相仿线性范围远高于银染线性范围远高于银染与蛋白质共价结合，可能改变蛋白的迁与蛋白质共价结合，可能改变蛋白的迁移性能移性能荧光淬灭荧光淬灭降低蛋白溶解度降低蛋白溶解度用用SYPRO Ruby对对
27、2D电泳后的胶染色图电泳后的胶染色图利用利用Sypro Ruby染色后的染色后的2D胶分析图谱胶分析图谱SYPRO Ruby进行染色的优缺点进行染色的优缺点灵敏度高：比银染高灵敏度高：比银染高330倍倍线性动态范围广线性动态范围广不对核酸染色（荧光染料不对核酸染色（荧光染料SYPRO Rose染染核酸）核酸）染色时间不严格，用担心染色过度染色时间不严格，用担心染色过度不干扰后续的质谱及免疫学检测不干扰后续的质谱及免疫学检测染料本身及扫描仪价格昂贵染料本身及扫描仪价格昂贵Comparison of fluorescent labeled 2-D gel with silver stainingC
28、yTM5 labelled gelSilver stained gelE.coli lysate,50g loading,pH 4-7负负 染染能能专专门门提提高高PAGE胶胶上上蛋蛋白白质质的的回回收收率率，但但不不能能用用于膜上染色。于膜上染色。结果表现为胶面着色而蛋白质点透明。结果表现为胶面着色而蛋白质点透明。速速度度快快（515min），蛋蛋白白质质的的生生物物活活性性能能保保持持：一一旦旦用用络络合合剂剂如如EDTA或或Tris/甘甘氨氨酸酸转转移移缓缓冲冲液液来来络合金属离子就可进行提取来转移蛋白质。络合金属离子就可进行提取来转移蛋白质。它它主主要要适适用用于于蛋蛋白白质质显显色色
29、、完完整整蛋蛋白白质质的的胶胶上上被被动提取以及质谱分析。动提取以及质谱分析。该该技技术术主主要要包包括括金金属属盐盐染染料料、锌锌咪咪唑唑染染料料等等的的使用。使用。胶体扩散染料胶体扩散染料主要用于高灵敏度检出电转印至硝酸纤主要用于高灵敏度检出电转印至硝酸纤维素和维素和PVDF膜上的蛋白质，不用于胶内膜上的蛋白质，不用于胶内染色。染色。最好的胶体金染色的灵敏度与最好的胶体金染色的灵敏度与PAGE胶内胶内的银染类似。的银染类似。这种技术主要包括印度墨水染料、胶体这种技术主要包括印度墨水染料、胶体金属染料等。金属染料等。金属螯合染料金属螯合染料这这是是一一类类与与现现代代蛋蛋白白质质组组学学研研
30、究究相相兼兼容容的的、相相对对较较新新的的蛋蛋白白质质显显色色试试剂剂，其其设设计计专专门门与与常常用用微微量量化化学学表表征征过过程程兼兼容容。它它们们不不包包含含戊戊二二醛醛、甲甲醛醛或或Tween-20等等，很很容容易易和和集集成成化化蛋蛋白白质质组组学学平平台台（包包括括自自动动化化凝凝胶胶染染色色仪仪、图图像像分分析析工工作作站站、机机器器人人剪剪切切仪仪器器、蛋蛋白白质质酶酶解解工工作作站站和和质谱仪等）相结合。质谱仪等）相结合。其其中中SYPRO Ruby也也是是一一种种基基于于钌钌的的金金属属发发光光染料。染料。EXCISEAutomated instrumentationMa
31、nual excisiontrim slice to 1mm3*Run proper controlsnegative gelreagent aloneWASHOrganic/AqueousThis will remove excess Coomassie BlueDEHYDRATESoak in 100%acetonitrile,then removeslices turn opaque whitebe sure that acetonitrile is free of acidDry slices in speed-vac or lyophilizerremember to wear gl
32、oves as the samples will be uncoveredDIGESTStocks of trypsin can be stored at-70Cpreferably one-time-use aliquots of 100 lRehydrate slices with trypsin solutionincubate while securely covered at 37C for 16-24 hoursEXTRACTSoak slices 50%acetonitrile with 5%TFATransfer supernatant to new plate or tube
33、Extract slices again and combine supernatantsDRYSpeed-vac or lyophilize combined supernatants to complete drynessReconstitute dried samples in 50%acetonitrile with 0.1%TFARECONSTITUTE非非变变性性2D-PAGE：两两向向均均在在非非变变性性条条件件下下进进行行，这这样样分分离离的的蛋蛋白白质质点点的的等等电电点点和和表表观观分分子子量量同同生生理理条条件件下下获获得得的的这这些些蛋蛋白白的的值值是是一样的；一样的；
34、非非变变性性/SDS-2D-PAGE：第第一一向向采采用用非非变变性性IEF，之之后后在在2%SDS溶溶液液中中平平衡衡；第第二二向向也也在在SDS存存在在的的条条件件下下进进行行。适适于于分分析析非非共共价键连接的蛋白蛋白间的相互作用。价键连接的蛋白蛋白间的相互作用。非非变变性性/还还原原/SDS-2D-PAGE：非非变变性性条条件件下下IEF聚聚焦焦，之之后后用用8M尿尿素素5%-ME2%SDS进进行行平平衡衡，再再进进行行第第二二向向SDS-PAG电电泳泳。此此时时分分离离的的蛋蛋白白质质点点可可进进行行点点的的切切取取、蛋蛋白白酶酶消消化化、MALDI-TOF-MS分分析析鉴鉴定定，提
35、提供供关关于于断断裂裂二二硫硫键键连连接接的的多多肽肽的的信息。信息。变变性性2D-PAGE：样样品品先先用用2%SDS5%-ME95变变性性5min，IEF在在8M尿尿素素1%NP-40条条件件下下进进行行，之之后后胶胶条条用用2%SDS5%-ME平平衡衡，然然后后进进行行SDS-PAGE。该该技技术术适适于于DNA序序列列和和多多肽肽结结构构的的分分析析，或或分分析析被被碳碳氢氢键键连连接接和和其其它它翻翻译译后后修修饰饰所所引引起起的的多多肽肽结结构构微微异异质质性性，但但此此方方式式显显示示的的大大于于100Kd的的蛋蛋白白质质点点少少于于第三种方式第三种方式双向电泳的分类双向电泳的分
36、类2D-PAGE 2D-PAGE StrongpointStrongpoints sControl and experimental samples in the same gelControl and experimental samples in the same gelDifferencialDifferencial expression analysis expression analysisReproducibilityReliability Statistically Reliability Statistically High SensitivityHigh Sensitivit
37、yE Effectivityffectivity:a relatively large number of proteins:a relatively large number of proteins Simple and relatively economical compared to LC Simple and relatively economical compared to LC 2D-PAGE2D-PAGE的分辨率和重复性的分辨率和重复性目前，一块胶板目前，一块胶板(16cm20cm)(16cm20cm)可检测到可检测到3000300040004000个甚至个甚至100001000
38、0个蛋白斑点；个蛋白斑点；8080年代开始采用固定化年代开始采用固定化pHpH梯度胶的梯度胶的IEFIEF，克服，克服了载体两性电解质阴极漂移等许多缺点而得了载体两性电解质阴极漂移等许多缺点而得以建立非常稳定的可以随意精确设定的以建立非常稳定的可以随意精确设定的pHpH梯梯度，可建立很窄的度，可建立很窄的pHpH范围范围(0.05U/cm)(0.05U/cm)，对特，对特别感兴趣的区域做第二轮分析，大大提高了别感兴趣的区域做第二轮分析，大大提高了分辨率。固定化分辨率。固定化pHpH梯度胶已有商品生产，基梯度胶已有商品生产，基本解决了重复性的问题；本解决了重复性的问题；2D-PAGE2D-PAG
39、E的灵敏度的灵敏度SDS-PAGESDS-PAGE有垂直板和水平超薄胶电有垂直板和水平超薄胶电泳两种方法，可分离泳两种方法，可分离1010100kD100kD分子分子量的蛋白质；量的蛋白质；银染色法可检测到银染色法可检测到4ng4ng蛋白，同位素蛋白，同位素标记法最灵敏，可测定标记法最灵敏，可测定20ppm20ppm的标记的标记蛋白。蛋白。2-DE的局限性的局限性低丰度蛋白、膜蛋白、碱性蛋白的分离与低丰度蛋白、膜蛋白、碱性蛋白的分离与检测检测重复性重复性规模化与自动化规模化与自动化Strategies for increasing resolutionStrategies for increa
40、sing resolutionUsing large amount of samplesTo remove abundant proteinsUsing wide pH gradient immobilized gel strips(pH3-10)To try narrow pH gradient gel strips 预分步预分步收集收集细胞浆细胞浆细胞核细胞核 细胞膜细胞膜核糖体及其他核糖体及其他特定细胞成份特定细胞成份细胞分细胞分泌成份泌成份pH4-12pH3-10pH4-7pH5-8pH7-10pH6-11pH3-6pH3-4pH4-5pH5-6pH6-7pH7-8pH8-9pH9-1
41、0pH10-11pH11-12第一步第一步第二步第二步第第三三步步用窄用窄pH范围阵列分离范围阵列分离低丰度或交叉覆盖蛋白低丰度或交叉覆盖蛋白阵列那些亚细胞定位位阵列那些亚细胞定位位置的功能蛋白质置的功能蛋白质3倍3倍荧光差异双向电泳荧光差异双向电泳(DIGE)(DIGE)技术路线技术路线是将样品在电泳前标记是将样品在电泳前标记Cy2Cy2、Cy3 Cy3 和和Cy5 Cy5 这这3 3 种荧光染料（其中种荧光染料（其中Cy2 Cy2 作为用作为用Cy3Cy3、Cy5 Cy5 标记的蛋白质内标）标记的蛋白质内标）将标记后的将标记后的3 3 种样品混合种样品混合,同时在一块胶上进行电泳。同时在一
42、块胶上进行电泳。所得到的所得到的2D 2D 胶图像可使用胶图像可使用3 3 种不同的激发种不同的激发P P发射过滤器得到不发射过滤器得到不同颜色荧光信号同颜色荧光信号,根据这些信号的比例来判断样品之间蛋白质的差根据这些信号的比例来判断样品之间蛋白质的差异异,这样可避免在匹配时出现的误差这样可避免在匹配时出现的误差,进行定量分析时也不依赖于进行定量分析时也不依赖于胶与胶之间的重复性。胶与胶之间的重复性。用于标记的荧光基团在化学结构上相似用于标记的荧光基团在化学结构上相似,分子量也基本相同分子量也基本相同,都都带有正电荷带有正电荷,所以在与赖氨酸残基反应时所以在与赖氨酸残基反应时,保证了所有的样品
43、可以保证了所有的样品可以移至相同的位置。移至相同的位置。该方法的灵敏度可与银染和该方法的灵敏度可与银染和SYPRO Ruby SYPRO Ruby 相媲美，可以检测到相媲美，可以检测到100100200pg 200pg 的蛋白质的蛋白质,线形动态范围在线形动态范围在5 5个数量级左右。个数量级左右。Fluorescence 2D differential gel electrophoresis Fluorescence 2D differential gel electrophoresis(F-2D(F-2D DIGE)DIGE)利用双荧光标记在同一块胶上进行两组利用双荧光标记在同一块胶上进行
44、两组样品的差异性比较样品的差异性比较优点优点该方法提高了定量上的准确性。由于实验方法本身造该方法提高了定量上的准确性。由于实验方法本身造成的蛋白质斑点强度的差异成的蛋白质斑点强度的差异,比如样品在进入胶条时会比如样品在进入胶条时会有一些样品损失有一些样品损失,但在同一块差异凝胶电泳胶上就不会但在同一块差异凝胶电泳胶上就不会出现这样的差异。出现这样的差异。不同的不同的CyDyeCyDye（Cy2,Cy2,Cy3,Cy3,Cy5Cy5）标记的样品可以在）标记的样品可以在同一块胶上共分离，保证所有样品在完全相同的第一同一块胶上共分离，保证所有样品在完全相同的第一向和第二向电泳条件下分离，消除实验的偏
45、差并保证向和第二向电泳条件下分离，消除实验的偏差并保证精确的胶内匹配。精确的胶内匹配。利用利用IPGphorIPGphorIIII进行第一向分离和进行第一向分离和EttanEttanDALTDALT垂直垂直电泳仪进行第二向分离，在一块电泳仪进行第二向分离，在一块2-D2-D胶上同时分离多达胶上同时分离多达3 3个样品。大大减少了一个实验需要的胶的总数。个样品。大大减少了一个实验需要的胶的总数。2D-PAGE2D-PAGE的高通量与自动化的高通量与自动化Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics:Old,old fashioned,but
46、it still climbs up the mountainsT.Rabilloud(Proteomics 2002,2,3-10)2D Gel DatabasesBiobase 角质形成细胞,膀胱癌等(丹麦Center for Genome Research)http:/biobase.dk/cgi-bin/celisECO2DBASE 大肠杆菌(在NCBI库中)ftp:/ncbi.nlm.nih.gov/respository/ECO2DBASEHeart-2DPAGE 人心肌(德国柏林)http:/www.chemie.fu-berlin.de/user/pleissHSC-2DPAG
47、E 人类心脏(英国Harefield,Heart Science Center)http:/www.harefield.nthames.nhs.uk/nhli/protein/index.htmlLSB 人类,小鼠和大鼠肝脏等(美国Large Scale Biology)http:/.2dmaps/patterns.htmlQUESTRef52 细胞,大鼠胚胎,酵母(美国Cold Spring Harbor Lab)http:/siva.cshl.org/SWISS-2DPAGE 十个人类图谱,包括:肝,浆细胞,红细胞,血小板,以及酵母,大肠杆菌(瑞士日内瓦,University Hospital)http:/expasy.hcuge.ch/ch2d/ch2d-top.htmlYeast S.cerevisiae,S.pombe等(瑞典Goteborg University)http:/yeast-2dpage.gmm.gu.se/Yeast S.cerevisiae(美国Proteome Inc.)http:/ Laboratories,Bio-Rad Laboratories 中国生命科学论坛：中国生命科学论坛：http:/http:/